乙型流行性感冒病毒的基因快速检测

〔目的〕建立乙型流行性感冒病毒的核酸快速诊断技术。〔方法〕采用RT -PCR方法对乙型流感病毒的HA基因进行检测 ,我们对乙型流感病毒的HA基因保守区域设计相关引物 ,进行扩增 ,并作了特异性与灵敏度比较。〔结果〕该引物只能扩增乙型流感病毒的特异性片段 ,而对其它型别的流感病毒以及麻疹、风疹、腮腺炎病毒无交叉反应。检测的灵敏度一次PCR可达 1TCID50 ,二次PCR反应可达 0 .1TCID50 。〔结论〕采用该方法从临床患者含漱液标本中的检出率 ,比采用MDCK细胞分离的阳性率更高 ,可达到迅速、正确地诊断乙型流感的实用目的。     

多重逆转录-聚合酶链反应对甲1与甲3型流行性感冒病毒神经氨酸酶亚型的快速鉴定

为建立流行性感冒 (流感 )病毒甲1、甲3 型神经氨酸酶 (NA)N1与N2 亚型的快速鉴别方法 ,通过对大量NA基因序列的比较 ,分别在N1与N2 亚型的保守区域设计特异性引物 ,采用多重逆转录 聚合酶链反应 (MRT PCR)进行NA基因扩增 ,并评价了其灵敏度和特异性。结果表明 :MRT PCR能特异性扩增甲1、甲3 型流感病毒NAN1与N2 亚型基因 ,灵敏度为 0 1TCID50 ,可从临床患者含漱液中直接检测到N1、N2 基因。MRT PCR方法不仅可作为甲型流感病毒NA亚型的快速鉴定方法 ,而且可以作为人类甲型流感病毒基因快速诊断方法的补充 ,应用于流感爆发疫情的应急诊断。     

多重逆转录-聚合酶链反应对甲1与甲3型流行性感冒病毒神经氨酸酶亚型的快速鉴定

为建立流行性感冒(流感)病毒甲1、甲3型神经氨酸酶(NA)N1与N2亚型的快速鉴别方法,通过对大量NA基因序列的比较,分别在N1与N2亚型的保守区域设计特异性引物,采用多重逆转录-聚合酶链反应(MRT-PCR)进行NA基因扩增,并评价了其灵敏度和特异性.结果表明MRT-PCR能特异性扩增甲1、甲3型流感病毒NA N1与N2亚型基因,灵敏度为0.1TCID50,可从临床患者含漱液中直接检测到N1、N2基因.MRT-PCR方法不仅可作为甲型流感病毒NA亚型的快速鉴定方法,而且可以作为人类甲型流感病毒基因快速诊断方法的补充,应用于流感爆发疫情的应急诊断.     

甲3型流行性感冒病毒环介导逆转录等温扩增检测方法的建立与应用

目的 建立适用甲3型流行性感冒(流感)病毒核酸检测的环介导逆转录等温扩增(RT-LAMP)方法,为基层实验室流感快速诊断服务.方法 对甲3型流感病毒设计两对环介导特异性引物与一个环引物,采用环介导RT-LAMP技术对甲3型流感病毒核酸进行等温扩增,并对反应体系进行优化.结果 采用RT-LAMP技术检测甲3型流感病毒核酸,敏感度可达0.01TCID50/反应,与荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的敏感度相一致,且对H1和H5亚型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、风疹病毒、流行性腮腺炎病毒、副流感病毒与腺病毒无交叉反应,具有良好的特异性.采用该方法检测58份临床样本,病毒分离的阳性率为37.9%,而荧光定量RT-PCR与RT-LAMP的阳性率分别为53.45%和51.72%,敏感度明显高于通常的细胞病毒分离.结论 甲3型流感病毒环介导RT-LAMP检测方法,不仅快速特异、敏感性强,而且简便价廉,适于基层实验室使用.     

应用PCR-RFLP技术进行乙型流感病毒鉴别的实验研究

目的:应用聚合酶链反应(PCR)连接的限制性片段长度多态性(RELP)技术进行乙型流感病毒及其巴拿马株与维多利亚株两大谱系的鉴别。方法:根据GenBank中登录乙型流感病毒血凝素(HA)区域的核苷酸序列,应用软件进行序列比对,根据HA基因的保守区设计、筛选引物,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增流感病毒HA基因,用限制性内切酶H indⅢ酶切扩增产物并进行琼脂糖凝胶电泳,同时对检测方法进行特异性和灵敏性实验。结果:该方法对乙型流感病毒有特异性,与甲1和甲3型流感病毒无交叉反应。维多利亚株和巴拿马株HA基因均能被特异性引物所扩增,扩增产物经H indⅢ酶切后,乙型流感病毒巴拿马株在电泳谱上出现603 bp与242 bp的两个可见片段,而维多利亚株因无H indⅢ酶切位点,仍呈872 bp的一个片段。该方法检测敏感度可达0.1 TC ID50。结论:该方法是一种灵敏度高、特异性强的乙型流感病毒维多利亚株与巴拿马株鉴别的方法。     

优化的套式核酸体外扩增方法用于甲型流感病毒快速诊断的研究

目的临床上对流感的有效控制与治疗在于实验室快速与准确的诊断，这对于指导用药和避免滥用抗生素具有重要意义。RT-PCR在流感病毒检测中特异性和灵敏度较强，nested multirplex RT-PCR法可以在此基础上提高灵敏度。实验的目的是应用分子生物学方法对流感病毒进行快速诊断。方法我们结合流感病毒M基因、NS基因、HA基因的结构和进化特性设计多元引物达到流感病毒的型和亚型准确与快速的鉴定。结果甲型流感病毒以M基因保守区域设计引物，PCR后电泳带为413bp；甲型流感病毒以HA基因分亚型，H1N1亚型PCR后电泳带为348bp，H3N2亚型PCR后电泳带为291bp，H5N1亚型PCR后电泳带为326bp。结论应用优化的套式核酸体外扩增方法进行流感病毒的型与亚型的诊断是比较快速的，且所需要的病毒量少(0.01～0．1TCID50)，灵敏度较高。     

荧光定量逆转录-聚合酶链反应方法快速检测甲1型流行性感冒病毒核酸

目的建立特异、快速、敏感的TaqMan荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,用于检测甲1型流行性感冒(流感)病毒核酸.方法在甲1型流感病毒血凝素基因的保守区设计引物和TaqMan探针,对其进行筛选,同时对荧光定量RT-PCR反应条件和反应体系进行优化,验证该方法的特异性、敏感性、重复性,并对疑似流感患者含漱液标本进行检测.结果该方法对甲1型流感病毒的检测具有高度的特异性,对甲3型流感病毒、乙型流感病毒、禽流感病毒H5、严重急性呼吸道综合征病毒、麻疹病毒及其它呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.1TCID50.采用该方法从临床疑似患者含漱液中对甲1型流感病毒核酸的检出,比采用狗肾传代细胞进行病毒分离更为敏感.从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,操作简便,重复性好,且大大减少了常规RT-PCR检测产物的污染机会.结论新建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测甲1型流感病毒的特异、敏感的方法,非常适合于疑似流感爆发疫情的应急诊断和鉴别诊断.     

多重逆转录聚合酶链反应检测流感病毒

目的：建立特异敏感的热速检测流感病毒的分子生物学方法。方法：用多重逆转录聚合酶链反应连接多重聚合酶链反应扩增甲1、甲3和乙型流感病毒的HA基因的HA1片段。根据扩增产物的大小检测流感病毒。结果：以流感病毒的HA基因为模板设计的三对引物能特异性地扩增出942bp、1117bp和751bp的核酸片段，它们分别和甲1、甲3和乙型流感病毒有稳定对应关系。根据扩增产物的大小可以检测流感病毒。用这个方法能检测病毒浓度为0．1TCID50的样品。还可以直接从疑似流感病人的含漱液中检测到乙型流感病毒。结论：多重逆转录聚合酶链反应连接多重聚合酶链反应是检测流感病毒的特异敏感的方法，此法还能直接从疑似流感病人的含漱液中检测到乙型流感病毒。     

优化的套式核酸体外扩增方法用于甲型流感病毒快速诊断的研究

目的临床上对流感的有效控制与治疗在于实验室快速与准确的诊断,这对于指导用药和避免滥用抗生素具有重要意义。RT_PCR在流感病毒检测中特异性和灵敏度较强,nestedmultiplexRT_PCR法可以在此基础上提高灵敏度。实验的目的是应用分子生物学方法对流感病毒进行快速诊断。方法我们结合流感病毒M基因、NS基因、HA基因的结构和进化特性设计多元引物达到流感病毒的型和亚型准确与快速的鉴定。结果甲型流感病毒以M基因保守区域设计引物,PCR后电泳带为413bp;甲型流感病毒以HA基因分亚型,H1N1亚型PCR后电泳带为348bp,H3N2亚型PCR后电泳带为291bp,H5N1亚型PCR后电泳带为326bp。结论应用优化的套式核酸体外扩增方法进行流感病毒的型与亚型的诊断是比较快速的,且所需要的病毒量少(0.01～0.1TCID50),灵敏度较高。     

荧光定量RT-PCR快速检测乙型流感病毒核酸

目的建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RT-PCR方法用于检测乙型流感病毒核酸.方法根据GenBank登录的流感毒株序列,应用生物学软件进行序列比对,在乙型流感病毒核蛋白(NP)基因的保守区设计引物和TaqMan探针进行筛选,对荧光定量RT-PCR反应条件进行优化,检测该方法的特异性和灵敏度.此外还对疑似乙型流感含漱液标本进行检测.结果该方法对乙型流感病毒的检测有高度的特异性,对甲1型、甲3型、禽流感病毒H5、SARS病毒及其他呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.01 TCID50,可从疑似流感患者含漱液中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右.结论本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测乙型流感病毒特异、敏感的新方法.