慢病毒介导的RNAi对人胃癌细胞VEGF表达的影响

目的 探讨慢病毒介导的RNAi对人胃癌细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法 将构建的pGCL-GFP重组载体、phelper 1.0载体、phelper 2.0载体共转染293T细胞,包装产生重组慢病毒颗粒VEGF-RNAi-LV,并进行其病毒滴度测定.转染胃癌SGC7901细胞96 h后,用RT-PCR法检测细胞VEGF基因表达,ELISA法检测细胞培养液上清VEGF蛋白表达,四甲基偶氮唑盐比色法检测RNAi对胃癌细胞增殖的影响.结果 重组慢病毒包装滴度为2×109 TU/ml,VEGF-RNAi-LV转染胃癌细胞96 h后,其VEGF基因及培养液上清VEGF蛋白表达均明显下降,细胞生长缓慢,增殖受到抑制.结论 慢病毒介导的RNAi可明显抑制人胃癌细胞VEGF基因和蛋白表达,抑制细胞增殖.     

血管内皮生长因子调节内皮祖细胞生物学功能

目的研究血管内皮生长因子（VEGF）对体外培养骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）数量及增殖、迁移、黏附功能的影响及机制初探。方法密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞,FITC-荆豆凝集素I、DiI-乙酰化低密度脂蛋白荧光双染鉴定。单个核细胞培养7d后分为对照组和VEGF干预组。VEGF干预组加入不同浓度VEGF（25,50,75,100μg／L）培养48h,分别采用四氮唑溴盐比色法、改良的Boyden小室和黏附能力测定观察EPCs的增殖、迁移和黏附能力。RT—PCR法半定量检测VEGF对EPCs内皮型一氧化氮合酶（eNOS）mRNA表达的影响。硝酸还原酶法比色测定VEGF对EPCs分泌一氧化氮的影响。结果VEGF可浓度依赖性地增加EPCs数量并明显促进EPCs的黏附、迁移和增殖能力,与对照组比较差异显著。VEGF可上调EPCseNOSmRNA的表达,促进EPCs分泌一氧化氮。结论VEGF可能通过上调EPCseNOSmRNA的表达影响EPCs部分生物学功能。     

慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因转染血管内皮祖细胞的实验研究

目的探讨HIV-1来源的慢病毒载体介导绿色荧光蛋白（GFP）基因转染血管内皮祖细胞（EPCs）的可行性和方法。方法用梯度密度离心法分离人脐带血内皮祖细胞,在EGM-2培养基中培养。用细胞免疫荧光染色和流式细胞仪检测其表达情况。以HIV-1来源的慢病毒为载体、以GFP基因为目的基因转染EPCs,MTT法检测不同病毒滴度（MOI）时细胞增殖情况并观察转染率。结果单个核细胞经EGM-2培养基培养1周后即分化成EPCs。GFP转染后48 h细胞即发出绿色荧光。MOI 1∶10转染组细胞转染率低于MOI 1∶50组（P〈0.05）。MOI 1∶50转染后的细胞与未转染GFP组比较,生长曲线无明显差异（P〉0.05）。MOI 1∶100组转染后细胞的增殖处于停滞状态。结论采用HIV-1来源的慢病毒载体介导GFP基因转染标记EPCs是可行的。以MOI 1∶50进行转染对细胞生长影响小,转染效率高。     

慢病毒载体及基因开启技术构建过表达GATA-4骨髓间充质干细胞

目的:用慢病毒载体及基因开启构建过表达GATAG-4小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)。方法:将已构建成功的GATA-4基因插入慢病毒包装质粒GV308中,构建GV308-GATA-4重组慢病毒包装质粒。将构建成功的GV308-GATA-4重组慢病毒包装质粒转染入小鼠BMSCs,并加入基因开启剂强力霉素(DOX)。转染成功后利用RT-PCR及Wstern blot法检测转染24、48、72hGATA-4基因量的表达及转录因子GATA-4的表达。结果:RT-PCR及Western blot实验均提示,随着转染时间的延长,GATA-4在小鼠BMSCs内的表达量是增加的。结论:利用慢病毒载体及基因开启技术构建过表达GATA-4小鼠BMSCs成功。     

靶向VEGFsiRNA对人乳腺癌细胞的抑制作用观察

目的 观察慢病毒介导靶向血管内皮生长因子(VEGF)小干扰RNA(siRNA)对人乳腺癌细胞MCF-7的抑制作用.方法 以携带VEGFsiRNA序列的慢病毒重组载体感染正常的MCF-7细胞,经反复实验优化,确定感染条件;提取各组细胞的总RNA和蛋白,利用RT-PCR、Western blot法分别检测VEGF mRNA及其蛋白;利用细胞增殖及细胞毒性实验检测细胞增殖抑制率.结果 VEGF siRNA慢病毒对MCF-7细胞的感染率达90％以上.与正常对照组相比,慢病毒RNA干扰组细胞的VEGF mRNA及其蛋白表达水平明显下调(P均＜0.05),而阴性对照组无明显变化(P均＞0.05);慢病毒RNA干扰组的细胞生长缓慢,细胞增殖抑制率显著高于阴性对照组(P＜0.05).结论 靶向VEGFsiRNA显著抑制人乳腺癌细胞VEGF的表达,并抑制人乳腺癌细胞的增殖.     

VEGF165正反义表达载体的构建及其对人胃癌细胞VEGF表达的调节

目的构建VEGF165(vascular endothelial growth factor,血管内皮生长因子)正、反义表达载体,将其转染人胃癌细胞,观察其对胃癌细胞VEGF在mRNA和蛋白质水平表达的调节作用.方法用限制性内切酶将VEGF165 cDNA从pGEM-hVEGF165克隆载体上切下来,以正、反方向插入质粒pCDNA3中,构建VEGF165正、反义真核表达载体;用限制性内切酶和Sanger双脱氧终止DNA测序法证明VEGF165正、反义表达载体目的基因的序列和方向的正确性;用脂质体将VEGF165正、反义表达载体转染人胃癌细胞,用RNA斑点杂交及免疫荧光流式细胞仪检测VEGF mRNA和蛋白质的表达水平.结果酶谱分析及DNA测序表明VFGF165正、反义真核表达载体目的基因的序列及方向正确;转染正义表达载体后VEGF mRNA和蛋白质表达水平增加(蛋白免疫强度为75.4%;P＜0.05vs对照组,31.6%),转染反义表达载体后VEGF mRNA和蛋白表达水平降低(蛋白免疫强度为8.9%;P＜0.05vs对照组).结论成功地构建了VEGF165正、反义真核表达载体;构建的载体能在胃癌细胞内有效表达,调节血管内皮生长因子的水平.     

解偶联蛋白-2基因过表达慢病毒载体的构建

目的构建解偶联蛋白-2（UCP-2）基因慢病毒表达载体。方法用RT-PCR技术从转基因肥胖小鼠肝脏组织中获得UCP-2基因编码区片段,用In-Fusio技术将PCR产物连接入Age I单酶切后的慢病毒转移质粒体pGC-FU,进行鉴定及序列测定。将构建成功的转移质粒和两种辅助包装原件载体质粒pHelper1.0、Helper2.0（VS-VG元件）共转染293T细胞,包装成慢病毒,浓缩纯化后检测滴度。结果RT-PCR产物经电泳证实成功获取UCP-2基因cDNA克隆,鉴定证实慢病毒转移质粒连接构建正确,病毒包装滴度为2×108TU/ml。结论成功构建了UCP-2基因慢病毒表达载体。     

钙敏感受体对内皮祖细胞数量及功能的影响

目的观察钙敏感受体(Ca SR)对人外周血内皮祖细胞(EPCs)数量及功能的影响。方法培养并鉴定EPCs;RT-PCR和Western印迹检测EPCs中Ca SR的表达情况;MTT法观察Ca SR对EPCs增殖能力的影响;Tube形成和迁移实验评价Ca SR对EPCs血管新生能力和迁移能力的影响;Western印迹检测Ca SR对EPCs中血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达的影响。结果 RT-PCR和Western印迹结果显示在EPCs中有Ca SR的表达;MTT法、Tube形成和迁移实验检测结果显示与正常对照组相比较,Ca SR激动剂组EPCs增殖、迁移能力和血管形成能力明显增强(P0.05),而Ca SR抑制剂组EPCs增殖、迁移能力和血管形成能力明显降低(P0.05);Western印迹检测发现与正常对照组相比较,Ca SR激动剂组VEGF和Ca SR表达明显增强,而Ca SR抑制剂组VEGF和Ca SR表达明显降低。结论 EPCs中有Ca SR的表达,并且Ca SR可以影响EPCs的数量、迁徙和血管形成能力。     

人骨诱导因子和绿色荧光蛋白基因共表达慢病毒载体的构建和鉴定及在HT-29细胞中的表达

目的构建和鉴定人骨诱导因子基因(hOGN)和绿色荧光蛋白(GFP)共表达慢病毒载体,并检测其在人大肠癌细胞株HT-29中的表达水平。方法采用PCR方法克隆hOGN基因;将hOGN基因连接到带有GFP的慢病毒表达载体pEZ-Lv201中构建慢病毒载体;将构建的慢病毒载体质粒pEZ-hOGN-SV40-eGFP-IRES-Puro(pEZ-hOGN)与慢病毒包装质粒混合物Lenti-PacHIVmix共转染293T细胞,收集慢病毒悬液;重组病毒转染H1299细胞,定量PCR法检测重组病毒滴度;将构建的pEZ-hOGN感染HT-29细胞,荧光显微镜观察和Western印迹检测感染后HT-29细胞中GFP表达情况和目的基因hOGN的表达情况。结果基因测序分析证实克隆的hOGN基因与GenBank提供的序列完全一致;构建的重组慢病毒载体经双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定证实OGN正确插入pEZ-Lv201;定量PCR测定慢病毒滴度为0.1×10~9~1×10~9TU/ml。在HT-29细胞中重组病毒感染96h后在荧光显微镜下可检测到较强的绿色荧光蛋白表达,Western印迹检测到在HT-29细胞中hOGN蛋白过表达。结论成功构建携带hOGN基因的重组慢病毒载体,在HT-29细胞中有效表达。     

多效蛋白基因的小干涉RNA慢病毒表达载体的构建及其对人小细胞肺癌H446细胞株生长与凋亡的影响

目的 构建针对多效蛋白(pleiotrophin,PTN)基因的小干涉RNA(siRNA)慢病毒表达载体并观察其对人小细胞肺癌H446细胞株PTN表达抑制及对细胞生长和凋亡的影响.方法 设计4对针对PTN基阒的小发夹RNA(shRNA)序列,与Plvthm载体连接,构建慢病毒表达载体LV(lentiviral)-shPTN,连接产物转化到DH5α感受态细胞,阳性克隆测序鉴定.再用LV-shPTN与pRsvREV、pMDlg-pRRE、pMD2G三种质粒共转染293T细胞,小量包装与纯化产生慢病毒颗粒.感染H446细胞后,用荧光定量PCR及Western blot法检测PTN的表达.将包含对PTN基因十扰效率最高的序列慢病毒载体进行大量包装、纯化及病毒滴度测定,将包装好的病毒感染H446细胞.实验分为正常未干扰细胞组、阴性对照组、PTN抑制组、化疗组及PTN抑制加化疗组,四甲基偶氮唑盐比色法观察细胞生长,流式细胞仪分析细胞凋亡.结果 测序结果与构建慢病毒载体的预期结果一致,对PTNmRNA的最高抑制效率为72%,对PTN蛋白的最高抑制效率为59%.大量包装与纯化后病毒滴度为1×10~8 TU/ml.PTN基因抑制组H446细胞活力明显低于正常未干扰细胞组和阴性对照组,基因抑制联合化疗组较单纯基因抑制组及化疗组细胞活力下降,凋亡率增高,并具有浓度依赖性.结论 构建PTN RNA干涉载体,转染后可有效降低H446细胞FIN的转录和表达,抑制H446细胞的生长并促进其凋亡,有望成为小细胞肺癌基因治疗的可选择的方法之一.     

过表达HSP20的慢病毒载体对H2O2诱导的大鼠心肌细胞凋亡的影响

目的构建过表达大鼠热休克蛋白20(HSP20)基因慢病毒载体,探讨其对H2O2诱导的大鼠H9C2心肌细胞凋亡的影响。方法构建大鼠HSP20基因pHIV-HSP20过表达质粒慢病毒,与包装质粒psPAX2、pMD2G共转染293FT细胞,检测其转染效率;包装慢病毒并转染H9C2心肌细胞;72 h后观察其转染效率,RT-PCR法检测细胞HSP20 mRNA表达,CCK-8、Hochest33258染色法检测H2O2诱导后H9C2心肌细胞凋亡情况。结果成功构建了HSP20慢病毒过表达载体,经293FT细胞包装后,其对H9C2细胞72 h的转染效率为95%;与慢性病毒组比较,H9C2细胞转染72 h后HSP20 mRNA水平显著升高,细胞活力下降,心肌细胞凋亡率明显降低(P均<0.01)。结论过表达HSP20能显著抑制H2O2诱导的H9C2心肌细胞凋亡。     

靶向人 BRG1基因的慢病毒载体构建及效率验证

目的：构建靶向人 BRG1基因的短发夹 RNA（shRNA）慢病毒载体并验证其沉默效率。方法：设计3个针对人 BRG1基因的特异性 shRNA 序列（shBRG1）,构建于 pLKO．1慢病毒载体中,并与 psPAX2和 pMD2．G 质粒共同转染293T 细胞以包装成慢病毒颗粒。将包装好的慢病毒感染人主动脉平滑肌细胞（HASMC）,应用实时荧光定量 PCR 和 western blot 检测 BRG1 mRNA 和蛋白表达水平,判断其沉默效率。结果：3种 shBRG1干扰序列均成功插入慢病毒载体中且测序正确,3种慢病毒均可有效降低 BRG1 mRNA 表达水平（P 均＜0．01）。其中 shBRG1-3的沉默效率最高,其感染HASMC 后 BRG1蛋白表达水平较对照组显著下降（P ＜0．01）。结论：靶向人 BRG1基因的 shRNA 慢病毒表达载体构建成功,shBRG1-3慢病毒能够有效降低 BRG1 mRNA和蛋白表达水平。     

天然免疫分子LILRB5慢病毒稳定转染THP-1细胞系的构建

目的构建天然免疫分子LILRB5的慢病毒表达载体,获得稳定转染LILRB5的单核细胞系。方法将LILRB5构建入真核表达载体pEGFP-flag,瞬时转染293T细胞系,通过免疫荧光和流式细胞术检测LILRB5-GFP和LILRB5-flag在293T细胞中的表达。构建慢病毒表达载体pHR-LILRB5,与p8.91和pMD共同转入293T细胞,产生标记有绿色荧光的LILRB5慢病毒,感染单核细胞系THP-1后通过流式细胞术检测LILRB5的表达。结果测序显示真核表达载体pEGFP-LILRB5-flag的序列与预期相符,瞬时转染pEGFP-LILRB5-flag的293T细胞可检测到绿色荧光蛋白的表达,流式细胞术检测显示LILRB5-flag在细胞膜表面有表达;构建亚克隆慢病毒载体pHR-LILRB5,经测序验证后,转染293T细胞,产生LILRB5的慢病毒,并感染THP-1细胞,流式细胞术检测LILRB5在THP-1细胞稳定表达。结论构建LILRB5的慢病毒载体,通过LILRB5慢病毒感染建立LILRB5的稳转THP-1细胞系。     

胰腺癌CFPAC1细胞增殖诱导配体基因shRNA慢病毒表达载体的构建

目的 构建针对人胰腺癌细胞株CFPAC1增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand,APRIL)基因的shRNA慢病毒表达载体.方法 应用基因工程技术,筛选出针对APRIL基因的RNAi靶序列,与pGCL-GFP载体连接,构建慢病毒表达载体LV-shAPRIL;将连接产物转化到DHSα感受态细胞,经PCR筛选阳性克隆、测序鉴定.再用LV-shAPRIL、pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒.重组慢病毒感染CFPAC1细胞,实时定量PCR和Western blotting检测CFPAC1细胞APRIL mRNA和蛋白的表达.结果 PCR和测序结果与构建的慢病毒载体的预期结果一致,经包装产生的病毒滴度为5×107TU/ml.构建的慢病毒载体感染CFPAC1细胞后第4天、第4周和第8周,APRIL mRNA表达量较空载体慢病毒感染组分别下降了73%、70%和71%;APRIL蛋白表达量分别下降了66%、63%和62%(P＜0.05).而各时间段未感染慢病毒的细胞组与空载体组相比无明显差异(P＞0.05).结论 成功构建了APRIL基因的shRNA慢病毒表达载体LV-shAPRIL.     

MCFP慢病毒干涉载体及HepG2稳定细胞系的构建

目的:研究线粒体转运蛋白质超家族新成员SLC25A40(MCFP)RNA干扰(RNAi)慢病毒表达载体对人肝癌细胞系HepG2细胞中MCFP基因的沉默效果.方法:通过RNAi序列设计软件进行MCFP干涉片段设计,筛选出MCFP基因的RNAi有效靶序列,进一步合成靶序列的Oligo DNA,构建pSiCoR-MCFP慢病...     

慢病毒介导HBV X基因稳定表达HepG2细胞系的建立

目的:构建乙型肝炎病毒X基因(HBV X)重组慢病毒表达载体,建立稳定表达HBVX蛋白(HBx)的HepG2细胞系.方法:应用PCR法从质粒pIERES2-EGFP-HBV中扩增X基因片段,克隆至慢病毒载体pZac2.1,应用PCR、酶切和测序鉴定正确后,经病毒包装,感染HepG2细胞,经嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株,RT-PCR、免疫组织化学、Western blot鉴定HBx的表达.结果:酶切鉴定和基因序列测定证实长度为489bp的HBx基因成功克隆至慢病毒表达载体pZac2.1-HBx;重组慢病毒经包装、纯化后获得滴度为1×108TU/mL,通过感染HepG2细胞株和嘌呤霉素筛选,8-10d形成生长形态良好的单克隆细胞株HepG2-HBx;RT-PCR鉴定显示细胞株HepG2-HBx在3d,14d,30d和2mo后均可见稳定表达的HBx mRNA;利用免疫组织化学和蛋白免疫印迹法鉴定,细胞株HepG2-HBx可稳定表达HBx蛋白.结论:成功构建了HBV X重组慢病毒载体,获得稳定表达HBx的HepG2细胞系,为进一步研究HBx的生物学功能及致病机制提供细胞模型.     

Lentiviral vectors for efficient delivery of CD80 and granulocyte-macrophage- colony-stimulating factor in human acute lymphoblastic leukemia and acute myeloid leukemia cells to induce antileukemic immune responses

Cell vaccines engineered to express immunomodulators have shown feasibility in eliminating leukemia in murine models. Vectors for efficient gene delivery to primary human leukemia cells are required to translate this approach to clinical trials. In this study, second-generation lentiviral vectors derived from human immunodeficiency virus 1 were evaluated, with the cytomegalovirus (CMV) promoter driving expression of granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF) and CD80 in separate vectors or in a bicistronic vector. The vectors were pseudotyped with vesicular stomatitis virus G glycoprotein and concentrated to high titers (10(8)-10(9) infective particles/mL). Human acute lymphoblastic leukemia (ALL), acute myeloid leukemia (AML), and chronic myeloid leukemia cell lines transduced with the monocistronic pHR-CD80 vector or the bicistronic pHR-GM/CD vector became 75% to 95% CD80 positive (CD80(+)). More important, transduction of primary human ALL and AML blasts with high-titer lentiviral vectors was consistently successful (40%-95% CD80(+)). The average amount of GM-CSF secretion by the leukemia cell lines transduced with the pHR-GM-CSF monocistronic vector was 2182.9 pg/10(6) cells per 24 hours. Secretion was markedly lower with the bicistronic pHR-GM/CD vector (average, 225.7 pg/10(6) cells per 24 hours). Lower amounts of CMV-driven messenger RNA were detected with the bicistronic vector, which may account for its poor expression of GM-CSF. Primary ALL cells transduced to express CD80 stimulated T-cell proliferation in an autologous mixed lymphocyte reaction. This stimulation was specifically blocked with monoclonal antibodies reactive against CD80 or by recombinant cytotoxic T-lymphocyte antigen 4-immunoglobulin fusion protein. These results show the feasibility of efficiently transducing primary leukemia cells with lentiviral vectors to express immunomodulators to elicit antileukemic immune responses. (Blood. 2000;96:1317-1326)     

人IFN-β重组慢病毒的制备及对肺癌细胞增殖的影响

人β干扰素;;慢病毒载体;;基因转染;;A549细胞 %X 目的构建人β干扰素（IFN-β）基因重组慢病毒,体外转染人肺癌A549细胞,观察IFN-β基因的表达及其对A549细胞的增殖抑制作用。方法通过聚合酶链反应（PCR）获得人IFN-β基因,克隆到慢病毒载体,通过转染293细胞包装制备慢病毒液,并体外感染A549细胞,采用RT-PCR及Western Blot检测IFN-β基因在A549细胞中的表达情况。应用MTS法检测转染后对A549细胞增殖的影响。结果 IFN-β基因重组质粒经酶切后电泳结果显示能得到与理论大小相符的片段,基因测序结果与GenBank序列完全一致,重组质粒经鉴定正确,转染293细胞获得病毒滴度为3×107PFU/ml,体外感染A549细胞后,RT-PCR、Western Blot检测IFN-β表达水平明显增高,并可明显抑制A549细胞增殖。结论本研究成功构建IFN-β基因重组慢病毒,体外感染后能够稳定表达并抑制A549细胞增殖,为应用IFN-β基因治疗肺癌奠定初步基础。