HBx上调HepG2细胞DNA修复酶hMTH1表达的意义

目的: 探讨DNA氧化损伤修复酶hMTH1在HBx致肝细胞癌发生机制中的作用.方法: 应用HPLC/ECD法检测稳定表达HBx的转基因细胞HepG2/HBx及其对照组HepG2与HepG2/pcDNA3.1细胞中的8-OHdG的含量;并以β-actin为内对照, 应用RT-实时PCR定量检测各组细胞中可水解8-OHdG的DNA修复酶hMTH1的表达.结果: 8-OHdG在He pG2/HBx细胞中的含量(fmol 8-OHdG/mg DNA)显著高于对照组HepG2和HepG2/pDNA3.1细胞(36.5±6.25 vs8.52±1.65, 9.12±2.69, 均P<0.05). DNA修复酶hMTH1在HepG2/HBx细胞中的表达较两对照组细胞明显增高(1.213±0.100 vs 0.087±0.026, 0.112±0.052 hMTH1/β-actin mRNA×100, 均P<0.05).结论: H B x 可能通过诱导氧化应激增加HepG2细胞内DNA氧化损伤产物8-OHdG的含量, 从而反应性上调DNA修复酶hMTH1的表达.     

DNA修复酶表达与8-羟脱氧鸟核苷酸在肝癌发生中的作用

本研究拟通过检测肝癌组织与癌旁组织中人类MutT的类似物（hMTH1）、人类MutM的功能类似物（hOGG1）和人类MutY的类似物（hMYH）表达水平及8-羟脱氧鸟核苷酸DNA修复酶（8-OHdG）含量，并比较其相互关系，旨在探讨三种DNA修复酶在肝癌发生机制中的作用。     

自发性高血压大鼠发病过程中结缔组织生长因子表达的动态观察

目的:观察自发性高血压大鼠(SHR)发病过程中结缔组织因子(CTGF)的动态变化,探讨其与高血压病发生发展的关系。方法: 采用RT-PCR检测心肌组织中CTGF mRNA的表达。用苏木精、伊红染色检测心肌纤维化。用免疫组化染色(SP法)检测CTGF在心肌组织中的分布。结果: 随着鼠龄的增长,SHR组大鼠左室质量指数、CTGF及其mRNA的表达均显著增加,其心肌细胞的大小也明显增大（P<0.05）。SHR组大鼠心肌间质和血管平滑肌中,可见大量的呈棕黄色的CTGF阳性颗粒的分布,不同鼠龄组之间比较亦有显著性差异(P<0.01)。结论: 不同鼠龄(8~16周)的SHR大鼠心肌细胞中CTGF的表达显著增加,尤以16周龄的大鼠为著,同时伴有心肌纤维化进程加快,提示CTGF参与了高血压大鼠心肌病变的发生发展。     

衰老小鼠线粒体DNA缺失的研究

目的：探讨线粒体DNA(mtDNA)大片段缺失与衰老的关系。方法：用聚合酶链反应（PCR）检测不同年龄段小鼠心肌组织mtDNA片段缺失，同时用电镜观察其组织学改变。结果：用PCR检测到2只老年小鼠心肌mtDNA存在着3.87Kb片段缺失，电镜下老年小鼠心肌线粒体明显肥大肿胀，数目减少。结论：MtDNA片段缺失的发生随年龄增加而增加，可能中衰老的过程中起重要作用。     

原发性肝癌患者DNA损伤修复酶基因多态性分析

目的探讨DNA损伤修复酶基因多态性与原发性肝癌发生发展的关系。方法 PCR-RFLP法检测150例肝癌患者（肝癌组）和150例健康体检者（对照组）DNA损伤修复酶基因的表型,并进行比较。结果肝癌组XRCC1 Arg399Gln位点野生型的比率明显低于对照组（P〈0.05）;XRCC1（Arg194Trp、Arg280His）、hOGG1Ser326Cys位点多态性型别在两组中出现的频率相近（P〉0.05）;各基因位点不同表型者的尿8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）水平相比,P均〉0.05。结论 DNA修复酶基因多态性与肝癌的发生发展无明确的相关关系。     

DNA聚合酶γ的提取、纯化和鉴定

目的:提取并纯化人宫颈癌细胞(HeLa)的线粒体DNA聚合酶γ(DNA polymeraseγ,Polγ),鉴定其纯度和活性.方法:运用离子交换层析等方法提取纯化HeLa细胞的线粒体Polγ,并用Bradford法检测蛋白浓度.经SDS-PAGE检测蛋白纯度和相对分子量,Western blotting验证蛋白.用α-~(32)P- dTTP掺入法,液体闪烁计数器进行放射性测量以确定Polγ的活性.结果:成功提取并纯化HeLa细胞的线粒体Polγ,经SDS-PAGE鉴定,有一个大约140 kDa的亚基单位,Western blotting证实为Polγ.对其进行150倍纯化,收得率为6%,酶的总活力为4.81 U,比活力为36.17 U/mg.结论:HeLa细胞的线粒体Polγ通过离子交换层析法提取和纯化后活性较高,可用于体外药物线粒体毒性的检测.     

病毒性心肌炎与扩张型心肌病心肌线粒体DNA缺失的定量分析

目的对比研究病毒性心肌炎(VMC)与扩张型心肌病(DCM)患者活检心肌组织线粒体DNA(mtDNA)缺失突变情况及其与外周淋巴细胞mtDNA缺失程度的相关性.方法用定量PCR法检测20例VMC患者、12例DCM患者心肌细胞及其外周血淋巴细胞mtDNA4977碱基对(mtDNA4977)和mtDNA7436碱基对(mtDNA)缺失率.取12例健康意外死亡者心肌和23例献血员外周血淋巴细胞作正常对照.结果正常对照者、VMC和DCM患者心肌细胞均存在mtDNA4977及mtDNA7436缺失,合计缺失率分别为0.175%、0.385%和3.004%;外周淋巴细胞mtDNA缺失程度与心肌细胞呈一致性改变,且有良好的相关性(r=0.960,P＜0.001).结论mtDNA缺失可能是VMC发病及其向DCM演变的一个重要心肌损伤机制;外周淋巴细胞在研究心肌细胞mtDNA缺失中的作用值得进一步探讨.     

阿托伐他汀对老年慢性阻塞性肺病大鼠心肌和血管损伤的影响

目的观察慢性阻塞性肺病(COPD)对老年大鼠心肌、血管的氧化应激损伤作用及阿托伐他汀干预的影响。方法 18只22月龄SD大鼠随机分为空白对照组、COPD组、阿托伐他汀组[5mg/(kg·d)],每组6只。COPD组和阿托伐他汀组给予被动吸烟和气管内注射脂多糖。6周后,各组大鼠行心脏超声心动图检查,光镜下观察心肌组织学,采用比色法检测大鼠心肌、主动脉丙二醛、超氧化物歧化酶(SOD)水平,免疫组织化学法检测大鼠心肌、主动脉8羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)表达。结果与空白对照组比较,COPD组、阿托伐他汀组心肌组织HE染色无明显病理改变;COPD组、阿托伐他汀组主动脉管壁平滑肌细胞轻度增生。与空白对照组比较,COPD组、阿托伐他汀组大鼠心肌、主动脉8-OHdG表达明显增高(P0.01),但阿托伐他汀组心肌、主动脉8-OHdG表达较COPD组明显降低(P0.05)。与空白对照组比较,COPD组、阿托伐他汀组大鼠心肌、主动脉丙二醛含量均明显升高,SOD活性明显下降(P0.05);与COPD组比较,阿托伐他汀组大鼠心肌、主动脉丙二醛含量明显降低,SOD活性明显升高(P0.05)。结论 COPD可造成老年大鼠心肌、主动脉的氧化应激损伤,阿托伐他汀具有改善作用。     

替米沙坦对压力超负荷大鼠心肌内皮素-1表达和GATA DNA结合活性的影响

目的 研究压力超负荷心肌肥厚大鼠心肌组织(GATA)DNA结合活性和内皮素(ET)-1蛋白表达的变化及其意义,观察替米沙坦对压力超负荷心肌肥厚大鼠血流动力学参数[收缩压(SBP)、舒张压(DBP)和平均压(MBP)]、左室质量指数(LVMI)、心肌细胞横径(DC)、心肌组织GATA DNA结合活性和ET-1蛋白表达的影响.方法 腹主动脉缩窄法建立压力超负荷大鼠心肌肥厚模型.健康SD大鼠24只,随机分为三组:假手术组(n=8);手术组(n=8);替米沙坦组(手术后第7天给替米沙坦3 mg·kg-1·d-1灌胃4 w,n=8).测定大鼠SBP、DBP、MBP、LVMI及DC;免疫组化半定量检测心肌组织ET-1蛋白的表达,电泳迁移率变动分析检测ET-1与GATA的特异性结合及GATA DNA结合活性的变化.结果 ①与假手术组比较,手术组SBP、DBP、MBP、LVMI和DC均显著升高(P均<0.05);光镜下见心肌实质、间质结构改变;心肌组织ET-1蛋白表达和GATA DNA结合活性均明显增加(P均<0.05);心肌组织ET-1蛋白表达与LVMI和DC均呈显著正相关(r=0.895,r=0.899,P均<0.01);②与手术组比较,替米沙坦组SBP、MBP、LVMI、DC、心肌组织ET-1蛋白表达和GATA DNA结合活性均明显降低(P均<0.05).结论 (1)GATA DNA结合活性增加使ET-1蛋白表达增加与压力超负荷大鼠的心肌肥厚有关;(2)替米沙坦能够抑制压力超负荷大鼠的心肌肥厚,其机制可能与替米沙坦降低GATA DNA结合活性从而下调ET-1蛋白表达有关.     

香烟烟雾提取物对大鼠股四头肌细胞氧化损伤的研究

目的 研究经香烟烟雾提取物（CSE）刺激后大鼠股四头肌细胞8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）含量的变化以及细胞内活性氧（ROS）水平和8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1（OGG1）表达对8-OHdG含量变化的影响.方法 用不同浓度CSE分别刺激大鼠股四头肌细胞24 h、48 h和72 h后,采用高效液相色谱-电化学法（HPLC-ECD）检测大鼠股四头肌细胞8-OHdG的含量,流式细胞术检测大鼠股四头肌细胞ROS水平,实时定量PCR（Realtime PCR）检测OGG1 mRNA水平,用Western blot检测OGG1蛋白水平.结果 经相同CSE浓度分别刺激大鼠股四头肌细胞24 h、48 h和72 h后,大鼠股四头肌细胞中8-OHdG含量、ROS水平及OGG1 mRNA和蛋白水平差异均无统计学意义.但经不同浓度CSE刺激相同时间后,10.00％ CSE和20.00％CSE刺激组大鼠股四头肌细胞8-OHdG含量明显高于对照组和5.00％ CSE刺激组（P＜0.05）;大鼠股四头肌细胞内ROS水平、OGG1 mRNA和蛋白水平较对照组均明显升高（P＜0.05）;大鼠股四头肌细胞8-OHdG含量与其ROS水平呈明显正相关（r=0.746,P＝0.000）;经CSE刺激后,大鼠股四头肌细胞OGG1 mRNA和蛋白水平均高于对照组（P＜0.05）,但大鼠股四头肌细胞8-OHdG含量与其OGG1 mRNA和蛋白水平无明显相关（r=0.392,P＝0.536;r=0.297,P=0.426）.结论 CSE刺激可引起大鼠股四头肌细胞8-OHdG升高,8-OHdG含量与ROS水平有关,但与其修复酶OGG1表达水平无明显相关.     

食管鳞癌组织中线粒体和细胞核DNA的提取和鉴定

目的:研究在同一组织中同时提取线粒体DNA(mtDNA)和核DNA(nDNA)的方法的有效性.方法:同一组织中既含有mtDNA又含有nDNA,利用试剂盒同时提取出mtDNA和nDNA,用琼脂糖凝胶电泳,聚合酶链反应(PCR)的方法,对所提取的mtDNA和nDNA进检测.结果:用同一组织从线粒体中得到mtDNA,从细胞核中得到nDNA.与用传统方法分别提取mtDNA和nDNA效果一样,并且两者相关性强,相比较更有说服力.结论:同一组织中能同时提取mtDNA和nDNA,既节省组织又节省时间和费用,为DNA的研究提供了较好的实验方法.     

苦楝素诱导小鼠肝细胞DNA损伤

目的:观察苦楝素对DNA损伤及损伤修复的影响。方法:体外采用苦楝素与小鼠胚胎肝细胞BNL CL2细胞株共培养,CCK-8检测肝细胞活力,吸光度检测肝细胞内ROS含量,Western blot检测γ-H2AX、Parp-1、poly ADP-ribose蛋白表达,观察不同浓度苦楝素以及苦楝素不同作用时间对DNA损伤及损伤修复的影响。结果:随着苦楝素浓度升高,肝细胞BNL.CL2细胞活力逐渐下降(P0.0001),ROS含量升高(P0.05),同时γ-H2AX蛋白质含量随着苦楝素作用时间的延长而升高(P0.0001)。苦楝素作用0.5～1.0 h Parp-1自身PAR化量达最高(P0.05);而苦楝素作用时间自1～24 h Parp-1的PAR逐渐减少(P0.05)。结论:苦楝素可通过增加细胞内ROS诱导DNA损伤,同时抑制Parp-1的活性从而抑制DNA损伤的修复。     

冬凌草甲素诱导人胰腺癌SW1900细胞DNA损伤及对H2AX蛋白表达的影响

目的 研究冬凌草甲素(ORI)诱导胰腺癌SW1900细胞DNA损伤对磷酸化组蛋白(H2AX)表达的影响.方法 彗星实验检测ORI诱导胰腺癌SW1900细胞DNA损伤的程度.Western印迹检测不同浓度ORI作用胰腺癌SW1900细胞后H2AX蛋白的磷酸化.免疫荧光实验检测Phos-S1981 ATM和γ-H2AX焦点.结果 彗星实验结果表明不同浓度的ORI(20,40,80μmol/L)处理SW1900细胞48 h后,可发生DNA损伤,并且随浓度增加,DNA损伤加重.Western印迹检测不同浓度ORI作用胰腺癌SW1900细胞后,H2AX蛋白发生磷酸化,γ-H2AX随着浓度增加表达增大.免疫荧光实验发现Phos-S1981 ATM和γ-H2AX焦点随着浓度增加表达量增加.结论 ORI可以诱导胰腺癌SW1900细胞DNA损伤;H2AX蛋白发生磷酸化,具体DNA损伤信号通路有待进一步研究.     

高氟对大鼠口腔粘膜细胞增殖周期和DNA合成的影响

目的研究高氟对大鼠口腔粘膜细胞增殖周期和DNA合成的影响。方法雄性SD大鼠饮用含150mg／LNaF的蒸馏水溶液4周，用流式细胞术研究大鼠口腔粘膜细胞增殖周期和DNA相对含量(DNARC)，用单细胞凝胶电泳检测DNA损伤。结果高氟能引起大鼠口腔粘膜细胞增殖周期的改变，使G2／M期细胞明显下降，DNARC也显著下降，DNA损伤率明显升高。另外，高氟也造成口腔粘膜组织的氧化应激，活性氧族、脂质过氧化产物显著增高，还原型谷胱甘肽明显下降。结论高氟不仅改变了大鼠口腔粘膜细胞的增殖周期，还造成氧化应激，引起DNA损伤并影响DNA合成使DNA相对含量显著下降。     

慢性染砷大鼠肝脏线粒体DNA及相关酶活性变化研究

目的 探讨慢性染砷大鼠肝脏线粒体DNA（mtDNA）及线粒体相关酶，特别是mtDNA编码酶活性的变化。方法 Wistar大鼠经饮水给75mg／L三氧化二砷6个月。用分光光度法测定肝脏线粒体呼吸酶活性：碱变性法提取大鼠肝脏mtDNA；以PCR大片段扩增法扩增长片段mtDNA；用HindⅢ、EcoRⅠ、SalⅠ、BamHⅠ、MspⅠ、MboⅠ、StuⅠ7种限制性内切酶对扩增片段进行酶切分析。结果 染砷大鼠肝脏线粒体细胞色素C氧化酶（CytCOX）和ATP酶活性下降；而经mtDNA扩增片段凝胶电泳分析和7种限制性内切酶酶切分析，未发现染砷大鼠肝脏参与编码上述2种线粒体酶的4151bp片段有碱基缺失、重复和突变等异常表现。结论 慢性染砷能够导致肝细胞mtDNA参与编码的CytCOX和ATP酶活性下降，进一步证实了染砷对肝细胞及其线粒体的损害作用。但其活性下降的机制，目前尚不能以砷致mtDNA片段的变化来解释，需进一步进行DNA序列分析研究。     

大鼠心肌肥厚过程中亲环素A表达时程变化

目的探讨大鼠压力负荷性心肌肥厚过程中左心室心肌组织中亲环素A表达的时程变化。方法采用腹主动脉缩窄法建立压力负荷性大鼠心肌肥厚模型。术后4周和8周,检测左心室重量和体质量比值观察心肌肥大程度。然后用蛋白免疫印迹检测左心组织中亲环素A表达变化。结果在术后4周和8周,腹主动脉缩窄组左心/体质量比值比假手术对照组分别增加38.10%和37.70%。蛋白免疫印迹结果显示,两组亲环素A的表达均随鼠龄的增长而增加,但在术后4周和8周,腹主动脉缩窄组左心室心肌组织中亲环素A表达明显高于假手术对照组,亲环素A表达分别增加26.06%和31.95%。结论大鼠心肌肥厚的同时伴随亲环素A表达增多,提示心肌肥厚发病机制可能涉及亲环素A。     

自发性高血压大鼠左室重构中细胞增殖及心肌细胞DNA倍体的变化

目的 :探讨组织细胞增殖在高血压左室重构中的变化规律。方法 :不同年龄 (1周、3、6、12月龄 )的 WKY和 SHR大鼠 ,称重法测量左室肥厚指数 ,L SAB免疫组化法检测左室中增殖细胞核抗原 (PCNA)的蛋白表达 ,图像细胞分析技术原位检测心肌细胞核 DNA倍体和细胞核面积的变化。结果 :1周、3、6、12月龄各组 SHR左室肥厚指数分别比同龄WKY增加 18%、15 %、2 6 %、2 6 % ,均有统计意义。 1周龄和 3月龄 SHR心肌细胞 PCNA阳性率较同龄 WKY显著增加 ;而纤维细胞阳性率在两株大鼠无明显差异。 6月龄 WKY无阳性细胞表达 ,SHR心肌细胞阳性率为 0 .13± 0 .0 7,无统计学意义。 12月龄 WKY和 SHR均无阳性细胞表达。各年龄段SHR4倍体心肌细胞核百分比和心肌细胞核面积均较 WKY大鼠显著增加。在 1周至 12月龄时 ,两株大鼠 4倍体心肌细胞核比例均随年龄呈线性生长 ,6月龄后 WKY倍体比例相对稳定 ,SHR增加幅度明显下降。回归分析表明 ,成年 SHR4倍体比例与动脉收缩压呈相正关性。结论 :SHR左室重构在新生鼠即已发生 ,在 6月龄时基本完成 ,并且不完全依赖于血压的增高。这种病理性变化表现为心肌细胞的增殖 (肥大和 /或增生 ) ,而纤维细胞无明显增殖     

TET2重塑CXCR4 DNA甲基化对急性心肌梗死小鼠心肌组织自噬、炎症反应及凋亡的影响

目的:探究急性心肌梗死(AMI)过程中内皮细胞tet甲基胞嘧啶双加氧酶2(TET2)对趋化因子受体4(CXCR4)DNA甲基化的影响以及对AMI小鼠心肌组织自噬、炎症反应及组织细胞凋亡的影响机制,为临床探究AMI发展的分子机制提供理论依据。方法:8周龄雄性C57/BL6小鼠50只,制备AMI模型,尾部注射TET2、CXCR4过表达质粒;蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测心肌组织TET2、CXCR4、微管相关蛋白3(LC3)、P62、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)关联X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、Bcl-2表达;甲基化检测CXCR4 DNA甲基化水平;酶联免疫吸附法(ELISA)检测心肌组织内炎性因子白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)水平;原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测各组心肌组织细胞凋亡指数。结果:与假手术组比较,模型组心肌组织内TET2、CXCR4均表达上调,TET2、CXCR4均在心肌组织内过表达,TET2过表达促进CXCR4表达,差异有统计学意义(P<0.0...     

增龄对SAM小鼠脑线粒体DNA氧化损伤的影响

目的探讨增龄对SAM小鼠脑线粒体DNA(mtDNA)缺失、活性氧自由基水平及脑组织总抗氧化能力的影响。方法SAM-P／8和SAM-R／1小鼠分别分为三组幼年组(0．5月龄)、青年组(2月龄)和老年组(12月龄)各6只。用PCR方法测定脑组织线粒体DNA缺失、用化学发光法测定总抗氧化能力及活性氧自由基。结果随增龄，SAM—P／8小鼠脑组织线粒体DNA缺失增加，线粒体活性氧自由基水平升高，脑组织总抗氧化能力下降。结论随增龄，SAM-P／8小鼠脑组织氧化损伤增加，可能是导致其记忆学习障碍的原因之一。     

木犀草素对人胃癌细胞DNA双链断裂及同源重组修复的影响

目的 探讨木犀草素对人胃癌细胞DNA双链断裂(DNA double-strand breaks, DSBs)及同源重组(homologous recombination, HR)修复的影响。方法 采用流式细胞仪检测作用木犀草素后各组细胞内ROS水平变化及GFP阳性率；彗星实验检测木犀草素对DSBs的影响；Western blotting检测DNA损伤标志性蛋白γH2AX和HR修复蛋白Rad51的表达；免疫荧光检测DNA损伤修复相关蛋白表达的募集情况。结果 木犀草素以剂量依赖性方式增加胃癌细胞内ROS含量；用I-Scel质粒转染DR-GFP后木犀草素处理组GFP阳性细胞比例明显少于未加木犀草素组；但彗星实验表明，木犀草素处理后人胃癌AGS细胞后增加彗星尾炬；经木犀草素处理后，胃癌细胞中DNA的γH2AX上调，修复关键蛋白Rad51的表达下调；免疫荧光结果表明，在木犀草素处理人胃癌AGS细胞后HR修复蛋白Rad51在DNA损伤位点的募集减少。结论 木犀草素能够促进人胃癌细胞DSBs,并抑制其HR修复。