免疫磁珠法分选人脑胶质瘤干细胞及其培养和鉴定

背景与目的:脑胶质瘤治疗效果一直不理想,这与胶质瘤细胞无限增殖能力和侵袭性生长有关,本研究旨在从人脑胶质瘤组织和细胞株中分离脑胶质瘤干细胞、进行体外培养并对其干细胞特性加以鉴定。方法:采用以CD133为标志的免疫磁珠法从人脑胶质瘤组织和细胞株中分离脑胶质瘤干细胞并进行体外培养,通过免疫荧光技术检测干细胞标志物CD133、Nestin,诱导分化后检查分化细胞标志物MAP2、GFAP、MBP以及电镜超微结构观察和移植SCID鼠致瘤实验,对其干细胞特性加以鉴定。结果:新鲜人脑胶质瘤组织和胶质瘤细胞株中存在一小部分CD133 的胶质瘤细胞,能表达干细胞的标志物CD133和Nestin,符合干细胞的超微结构特点,体外培养能连续传代;诱导分化后能产生MAP2、GFAP、MBP染色阳性的细胞;移植SCID鼠后能形成与亲本肿瘤表型一致的移植瘤。结论:新鲜人脑胶质瘤组织和胶质瘤细胞株中存在的一小部分CD133 胶质瘤细胞具有干细胞的属性,就是胶质瘤中的肿瘤干细胞,即胶质瘤干细胞。     

人恶性胶质瘤干细胞的分离与鉴定

目的:从人恶性胶质瘤中分离并鉴定胶质瘤干细胞。方法:采用神经干细胞无血清培养方法,分离胶质瘤干细胞,免疫细胞化学法、有限梯度稀释实验、二代球体形成分析、流式细胞分析等方法对胶质瘤干细胞进行鉴定。结果:3例患者原代培养胶质瘤细胞中CD133 细胞分别为7.4%、2.8%和4.2%。每100个原代胶质瘤细胞中可形成1个左右的胶质瘤细胞球;胶质瘤细胞球细胞均表达神经干细胞标记CD133和Nestin,不表达分化标志GFAP和MAP2,少数细胞表达分化标记MBP。每100个原代胶质瘤细胞球体细胞可形成6.07±2.15个悬浮生长的二代胶质瘤细胞球,二代细胞球细胞表达CD133和Nestin。胶质瘤细胞球细胞分化后细胞多数表达GFAP,少数表达MAP2和MBP。胶质瘤球体干细胞的增殖较原代胶质瘤细胞慢。胶质瘤球体细胞1×103个时可成瘤,原代培养的胶质瘤细胞需1×107。结论:采用神经干细胞培养条件可以很简便的分离出悬浮生长的胶质瘤球体干细胞。分离出的胶质瘤球体干细胞表达CD133抗原,具备肿瘤干细胞的基本特征。     

人脑胶质瘤干细胞SHG-44s的克隆及初步鉴定

目的:探讨人脑胶质瘤体外细胞系中存在肿瘤干细胞的可能性.方法:将SHG44细胞系和SHG44-9细胞株,分别应用含血清培养基(DMEM 10?S)和无血清培养基(DMEM/F12,添加bFGF、LIF和EGF)培养.用CD133免疫磁珠分离干细胞、Hoechst33342和NESTIN流式细胞仪、Nestin、NSE、GFAP免疫细胞化学染色检测肿瘤干细胞及其分化细胞.结果:CD133磁珠分离得到的干细胞的比例:在血清组SHG44和SHG44-9分别为0.021%和0.035%:无血清组分别为1.2%和2.3%.而Hoechst33342和CD133标记后流式细胞仪检测干细胞比例:血清组中SHG44、SHG44-9分别为1.5%、0.37%;无血清组分别为16.4%和29.1%.并且这些细胞能够增殖和分化成神经元和胶质细胞.而Nestin标记后SHG44、SHG44-9中分别有51.05%、77.53%阳性细胞.结论:体外长期传代培养的人脑胶质瘤细胞系中存在肿瘤干细胞SHG44s,CD133磁珠和Hoechst33342流式细胞仪分离和检测胶质瘤干细胞是行之有效的方法,而Nestin 细胞是干细胞分化后的祖细胞或前体细胞,不能作为分离和检测干细胞特异性标记物使用.     

人脑胶质瘤组织培养的干细胞样细胞具有体外高侵袭能力

目的:分离培养人脑胶质瘤干细胞样细胞(glioma stem-like cell,GSLC),研究其体外侵袭力。方法:选取中国医科大学第一医院神经外科2008年10月至2009年1月间住院患者手术切除的脑胶质瘤组织8例,以无血清成球培养法培养胶质瘤细胞球;免疫细胞化学实验检测其CD133的表达;荧光免疫显微镜观察其分化后胶质细胞标志物GFAP和神经元标志物TU-20的表达;matrigel侵袭实验检测其侵袭力,并与原代脑胶质瘤细胞进行比较。结果:成功分离培养出人脑胶质瘤细胞球细胞,该细胞表达干细胞标志物CD133;能自我更新与增殖;诱导分化后,GFAP和TU-20均为阳性表达,提示其为GSLC。胶质瘤细胞球细胞侵袭细胞数显著多于原代胶质瘤细胞[(261.23±87.20)vs(116.08±63.88)个,P<0.01];此外,胶质瘤细胞球细胞穿过matrigel胶后可再次聚集成球状生长。结论:成功分离培养人脑胶质瘤组织中的GSLC,其体外具有较高的侵袭力,可能参与脑胶质瘤的侵袭和转移。     

胶质瘤干细胞的分离、培养及初步鉴定

目的:探讨人脑胶质瘤干细胞的培养和分离方法。方法:取9例脑胶质瘤患者的手术标本进行处理,采用B27培养基进行培养,碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子刺激细胞扩增;应用免疫组织化学染色对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定。结果:9例标本中共有7例成功培养出肿瘤细胞球,培养条件下呈悬浮状态生长,形成肿瘤细胞球,免疫细胞化学检测显示肿瘤球细胞表达胶质瘤干细胞的标志物CD133和Nestin,诱导分化后的肿瘤球细胞可以表达成熟神经细胞的标志物GFAP和TU-20。结论:体外的培养条件下,可以从胶质瘤组织中培养出胶质瘤干细胞,为胶质瘤的深入研究奠定基础。     

髓母细胞瘤中脑肿瘤干细胞的分离培养及鉴定

背景与目的:长期以来,脑肿瘤等实体肿瘤中是否存在肿瘤干细胞一直存在争论,最近已经有报道从胶质瘤和髓母细胞瘤等脑肿瘤及其它系统实体肿瘤中成功分离出肿瘤干细胞。本研究旨在利用简化的无血清培养基和悬浮培养方法,从人髓母细胞瘤中分离培养脑肿瘤干细胞,观察其在体外的增殖、分化,鉴定其特异性标志物CD133和Nestin的表达,验证肿瘤组织切片中CD133阳性细胞的存在,为脑肿瘤干细胞的进一步研究打下基础。方法:术中取11例患者髓母细胞瘤组织,分离成单细胞悬液,接种于含表皮生长因子、成纤维生长因子以及B27添加剂的无血清培养基中悬浮培养,以分离其中的脑肿瘤干细胞;对其增殖形成的脑肿瘤干细胞球连续传代培养;并进行单克隆形成实验,以确定原代肿瘤组织中肿瘤干细胞的百分率,观察脑肿瘤干细胞球的形成过程。然后,将脑肿瘤干细胞球接种于含血清培养基,观察脑肿瘤干细胞的分化现象。最后,利用免疫荧光法检测脑肿瘤干细胞特异性标志物CD133和Nestin在脑肿瘤干细胞球中的表达;利用免疫组化法检测组织切片中CD133阳性细胞的分布,并计算CD133阳性细胞百分率。结果:本组11例髓母细胞瘤中均仅有少数肿瘤细胞能够在无血清培养基中存活并悬浮生长、增殖形成克隆性脑肿瘤干细胞球,传代后脑肿瘤干细胞仍保持很强的自我更新和增殖能力。单克隆形成实验表明原代肿瘤细胞中具有单克隆形成能力的肿瘤干细胞百分率为(31.18±6.18)%。在含血清培养基中脑肿瘤干细胞发生贴壁分化,产生具有多种细胞形态的分化细胞。脑肿瘤干细胞表达神经干细胞的特异性标志物CD133和Nestin;肿瘤组织切片中CD133阳性细胞呈巢状或散在分布,占全部肿瘤细胞的(33.06±8.57)%。结论:人髓母细胞瘤组织中存在一定量的具有自我更新和增殖能力、表达CD133和Nestin的脑肿瘤干细胞,并能在体外将其分离、培养和诱导分化。     

胶质瘤干细胞的研究新进展

胶质瘤干细胞存在于多种脑胶质瘤组织和细胞系。胶质瘤干细胞具有类似神经干细胞的特性,但在基凶表达、分化、动物体内成瘤性、耐药性和耐辐射性等方面又不同于神经干细胞。CD133和nestin作为目前公认的神经干细胞表面标志．被应用于胶质瘤干细胞的分离鉴定。靶向胶质瘤干细胞的树突细胞疫苗的开发和靶向肿瘤干细胞信号传导通路的实验研究为脑胶质瘤的治疗提供了新途径。     

胶质瘤干细胞的研究新进展

胶质瘤干细胞存在于多种脑胶质瘤组织和细胞系。胶质瘤干细胞具有类似神经干细胞的特性,但在基因表达、分化、动物体内成瘤性、耐药性和耐辐射性等方面又不同于神经干细胞。CD133和nestin作为目前公认的神经干细胞表面标志,被应用于胶质瘤干细胞的分离鉴定。靶向胶质瘤干细胞的树突细胞疫苗的开发和靶向肿瘤干细胞信号传导通路的实验研究为脑胶质瘤的治疗提供了新途径。     

脑肿瘤干细胞的增殖活性与微血管密度的相关性研究

背景与目的：越来越多的研究表明脑肿瘤干细胞（brain tumor stem cell,BTSC）起源于神经干细胞（neural stem sell,NSC）的基因突变。本研究检测脑肿瘤干细胞标志物CD133、增殖细胞核标志物Ki-67和血管内皮细胞标志物CD31在68例脑胶质瘤中的表达,探讨脑肿瘤干细胞的增殖活性与微血管密度的相关性。方法：（1）采用免疫组织化学SP法检测CD133、Ki-67和CD31在68例胶质瘤组织中的表达。（2）采用免疫荧光双染法检测CD133/Ki-67和CD133/CD31的共表达情况。计算CD133~＋肿瘤干细胞、CD31~＋血管和Ki-67~＋细胞所占的百分率,并进行统计学分析。结果：按照WHO2000年的神经系统肿瘤分类分级标准所有标本分为Ⅱ级23例,Ⅲ级19例,Ⅳ级26例。CD133~＋肿瘤干细胞、CD31~＋血管和Ki-67~＋细胞在各级别胶质瘤中均有表达,在低级别组中,免疫组化中可见CD133~＋肿瘤干细胞、CD31~＋血管和Ki-67~＋细胞较少,免疫荧光双染可见CD133~＋/Ki-67~＋肿瘤干细胞较少,CD133~＋肿瘤干细胞周围的CD31~＋血管散在分布,同时可见少数CD133~＋/CD31~＋血管。而在高级别组中,免疫组化中CD133~＋肿瘤干细胞、CD31~＋血管和Ki-67~＋细胞数明显增加,荧光双染中CD133~＋/Ki-67~＋细胞和CD133~＋肿瘤干细胞周围的CD31＋血管均明显增多,同样可见少数CD133~＋/CD31~＋血管。并且,Ki-67~＋细胞（r=0.758,P〈0.001）和CD31＋血管（r=0.439,P〈0.001）在高低级别组中的表达均与CD133~＋肿瘤干细胞的表达呈正相关,并且,Ki-67~＋细胞和CD31~＋血管之间也呈明显的正相关（r=0.816,P〈0.001）。结论：在脑胶质瘤组织中,脑肿瘤干细胞的增殖活性与微血管是密切联系的,不仅表现在区域分布上肿瘤干细胞围绕微血管增殖分化,还可以表现在功能上与微血管的相互促进和相互依赖。     

人滑膜肉瘤肿瘤干样细胞分离与鉴定

目的:分离鉴定滑膜肉瘤（SW982）肿瘤干样细胞。方法:体外培养人滑膜肉瘤细胞系SW982,用CD133标记方法检测SW982中肿瘤干细胞的数量,用免疫磁珠分选法进行分选,分选后所得CD133+和CD133-细胞群分别进行以下实验。通过无血清悬浮培养基培养获得CD133+悬浮细胞球,并将其进行重新贴壁、重新成球以检测其自我更新能力。顺铂（cisplatin,CDDP）和阿霉素（doxorubicin,DXR）分别处理CD133+与CD133-贴壁细胞,CD133+贴壁细胞与CD133+悬浮细胞球,MTS检测每两种细胞药物敏感性。Real-time PCR及Western blotting 检测CD133+和CD133-贴壁细胞干细胞相关基因ABCG2、Bmi1、c-Myc、Nanog、Oct3/4、Sox2表达情况。将CD133+和CD133-贴壁细胞分别接种于6~8周雌性BALB/c裸鼠,观察成瘤情况,并将接种后所得肿瘤进行免疫组化,观察接种瘤含CD133情况。结果:SW982细胞系中CD133含量为8.59%,CDDP、DXR对CD133+和CD133-贴壁细胞抑制具有浓度依赖性。CD133+和CD133-细胞均表达干细胞相关基因ABCG2、Bmi1、c-Myc、Nanog、Oct3/4、Sox2。相对于CD133-细胞,CD133+细胞ABCG2、Nanog、Oct3/4、Sox2表达明显升高。CD133+细胞裸鼠体内成瘤率高于CD133-细胞,CD133+接种瘤含CD133较CD133-接种瘤多。结论:SW982细胞系CD133+细胞具有高自我更新能力、高耐药性、高表达干细胞相关基因、高成瘤性,是肿瘤干细胞。     

人脑胶质瘤移植瘤中CD133+细胞表型与微生态环境的关系

目的 研究CD133+细胞在肿瘤组织中的分布特征,探讨其与微生态环境的关系.方法 用CD133+肿瘤球或转红色荧光蛋白(RFP)基因的胶质瘤干细胞SU-3行裸小鼠原位、右腋皮下和腹腔等异位接种,致瘤后取荷瘤鼠全脑及整个皮下移植瘤组织行HE染色以及CD133免疫组织化学和免疫荧光染色,分别在光镜、荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察移植瘤的组织结构和CD133+肿瘤细胞的分布特征.结果 在光镜下,原位接种的CD133+肿瘤细胞的分布有一定规律性,从形态上可分为成簇、成对和单个分布;从部位上可分为肿瘤血管旁、血管内皮、正常组织中和脑室内.皮下接种的CD133+肿瘤细胞成簇或散在分布于肌肉和脂肪组织中,还可见CD133免疫复合物分布于血管壁及其基质.在荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜下可见,有些肿瘤血管内皮、血管旁的细胞共表达CD133和RFP.结论 在荷瘤鼠体内成簇生长的CD133+细胞实际上是类似体外生长的肿瘤干细胞(CSCs)球,而成对和单个生存的CD133+细胞分别代表CSCs与微生态环境相关的对称和不对称分裂;沿血管分布的CD133+细胞是依赖微生态环境生存的细胞,而远离血管或远离肿瘤组织、孤立于正常组织中的CD133+细胞是播散的CSCs或神经干细胞,属不受微生态环境控制的细胞.     

人脑胶质瘤新生血管的细胞来源与血液流通功能的初步评价

目的 探讨胶质瘤中部分新生血管是否源于胶质瘤干细胞转分化,并初步评价其血液运输功能.方法 将SHG44人脑胶质瘤细胞系接种于30只NC裸小鼠皮下和20只NC裸小鼠脑内尾状核,将SU-2细胞接种于12只表达绿色荧光蛋白的NC/C57BL/6J-绿色荧光蛋白裸小鼠的尾状核内.取移植瘤组织,石蜡切片后,分别进行CD34-PAS双染及CD31、CD34、CD133、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、人类白细胞抗原(Ki67)、HLA免疫组化染色,并结合HLA免疫荧光共聚焦显微成像对移植瘤血管进行分类,对肿瘤血管起源细胞进行鉴定.每组取3只荷瘤鼠,以活性炭颗粒混悬液行心脏灌注,对移植瘤切片进行相应的免疫组化染色,并在光镜下观察炭颗粒在肿瘤血管中的分布.结果 裸小鼠移植瘤中,同时存在CD34-PAS双阳性的内皮细胞依赖型血管、CD34ˉPAS+的血管生成拟态和由肿瘤细胞与CD34+细胞嵌合而成的马赛克血管,炭颗粒随机分布在这些血管腔内.在人脑胶质瘤于细胞移植瘤中,CD31+细胞依附于血管壁腔侧面;CD34+细胞亦沿血管分布,但在形态上介于肿瘤细胞与内皮细胞之间;在血管壁上可见HLA+和人Ki67+细胞,提示构成血管壁的这些细胞来自人源细胞.HLA免疫荧光共聚焦显微成像可见,移植瘤中的血管以表达HLA(红色)的人源肿瘤细胞为主,兼有表达GFP(绿色)的宿主细胞,或人鼠融合细胞.结论 在移植性人脑胶质瘤组织中存在具有血液运输功能的内皮细胞依赖型血管、血管生成拟态和马赛克血管3类血管,人脑胶质瘤干祖细胞有通过分化和转分化机制自主形成后两类肿瘤血管的潜能.     

mTOR信号通路调控CD133阳性胶质瘤干细胞自我更新的分子机制

背景与目的：mTOR（mammalian target of rapamycin）信号通路异常活化和高级别胶质瘤患者的预后不良相关。本研究探讨mTOR信号通路调控胶质瘤干细胞（GSCs）自我更新相关的分子机制。方法：采用CD133免疫磁珠分选CD133阳性胶质瘤干细胞。Western blot检测mTOR信号通路组分p-S6K、p-S6和干细胞自我更新相关基因Bmi-1的表达水平;Rapamycin（RPA）阻断mTOR信号通路后,用肿瘤球形成实验评价干预mTOR信号通路对胶质瘤干细胞自我更新的影响;统计学处理采用SPSS11.0统计分析软件分析。结果：CD133阳性胶质瘤干细胞表达较高水平的mTOR信号通路组分p-S6K、p-S6和干细胞自我更新相关分子Bmi-1。通过rapamycin阻断mTOR信号通路,可诱导胶质瘤干细胞谱系分化,同时显著降低肿瘤球形成能力（P〈0.05）,而自噬抑制剂3-MA处理不能逆转rapamycin的效应。结论：mTOR信号通路能够调控胶质瘤干细胞自我更新,阻断mTOR通路下调胶质瘤干细胞自我更新潜能。     

Expression of NANOG in human gliomas and its relationship with undifferentiated glioma cells

Stemness genes, including NANOG, which have been reported to play a significant role in embryonic stem cells (ESCs), are purported to be expressed in specific human tumor types. In the present study, we explored the expression of NANOG in gliomas to demonstrate its key roles in maintaining the undifferentiated state of glioma cells. Brain tumor stem cells (BTSCs) were isolated from the human glioma cell line U87 and cultured in simplified serum-free medium. Significantly higher NANOG mRNA and protein expression levels were demonstrated in U87 parental attached cells and suspended BTSCs as well as in 69 glioma specimens of different pathological grades. The relative levels of NANOG mRNA and protein expression were higher in the BTSCs as compared to those in the U87 parental attached cells and were significantly positively correlated with pathological grade. The coexpression and relationship of NANOG, CD133 and GFAP in situ in the cellular levels was determined through double-label immunohistochemical staining in the gliomas. A positive correlation of NANOG and CD133 expression with pathological grade of the samples was noted, while NANOG and GFAP expression correlated negatively with the pathological grade (P<0.01). Overexpression of NANOG in gliomas and its close relationship with the undifferentiated state of glioma cells in?vivo and in vitro indicated that NANOG may contribute to the existence of BTSCs and may be related to tumorigenesis of the cerebrum by maintaining the undifferentiated state of glioma cells, which provides a foundation to further explore its role in the biological behavior of gliomas.     

高转移肺癌细胞株的建立及其肿瘤干细胞生物学特性

 目的 研究高转移肺腺癌细胞株的肿瘤干细胞生物学特征。方法 肺腺癌细胞系A549接种裸鼠皮下成瘤后,取肺的转移灶,通过机械分离法获取肺转移细胞,体外扩大培养后,再次接种裸鼠。如此反复接种裸鼠,获得稳定肺转移的细胞株A549-V13。采用无血清悬浮培养及PKH26染色确定A549-V13存在肿瘤干细胞。流式细胞术（FACS）检测和分选A549和A549-V13中肿瘤干细胞标志物CD133的表达并进行体内外生物学特征实验。结果 建立稳定高转移A549-V13细胞株。无血清悬浮培养A549-V13,7天后形成的球形细胞团中存在单个PKH26阳性细胞。FACS检测显示,与A549中CD133⁺细胞相比,高转移A549-V13细胞株中CD133⁺细胞的表达比例显著提高4.85倍。A549-V13中CD133⁺细胞具有更强的自我更新能力,侵袭能力提高1.42倍,耐药能力也显著增强,其IC₅₀提高1.26倍,A549-V13的CD133⁺细胞在裸鼠皮下接种2×102个细胞3月致瘤4/6,而接种2×10²个A549的CD133⁺细胞3月才致瘤2/6。结论 建立高转移肺癌细胞株A549-V13,伴随CD133⁺细胞表达比例的增加,其体内外生物学功能显著增强。     

An experimental study of dendritic cells transfected with cancer stem-like cells RNA against 9L brain tumors

Cancer stem cells are defined as a subpopulation of cancer cells with the capacity to self-renew and differentiate, which may play critical roles in tumor initiation, progress and resistance to current treatments. It has been reported that Dendritic cells (DCs) transfected with total tumor RNA could induce strong antitumor T-cell responses both in vivo and in vitro. In the study, we investigated the characteristics of 9L tumor spheres, and evaluated the antitumor effects of DCs transfected with 9L tumor spheres RNA in vivo. The results showed that 9L tumor spheres have the properties of cancer stem cells, and the majority of 9L cells were positive for CD133 and nestin. DCs transfected with 9L tumor spheres RNA can significantly inhibit glioma growth and prolong the survival of 9L glioma-bearing rats. These results demonstrated that 9L cancer stem like cells were enriched in tumor spheres, and they were a part of CD133+ cells, DCs transfected with cancer stem cells RNA may be an effective therapy for glioma.