中国人膜结合型干细胞因子cDNA的克隆及初步表达

目的 获得干细胞因子的cDNA以利于进一步对干细胞因子的重组表达进行研究。方法 利用RT-PCR技术,从中国妇女早期妊娠的蜕膜和绒毛膜组织总RNA中扩增得到660bp的干细胞因子cDNA,克隆入质粒pGEM-4z载体构建了pGSM重组质闰,将已测定序列的cDNA亚克隆入pET-11c质粒,得到干细胞因子的重组表达质粒pESM。结果 证实所 获序列是外显子6缺失的膜结合型干细胞因子cDNA,且其分子量与预期的一致。结论 成功克隆了膜结合型干细胞因子的cDNA。     

人干细胞因子cDNA克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

以超速离心法提取的HepG2细胞总RNA为模板，应用RT-PCR技术扩增得到编码人干细胞因子（SCF）全长CDNA（约0.8kb）。克隆、序列分析确证编码人SCF膜外活性区的CDNA（约0.5kb）结构正确，构建了含有该基因的表达质粒（PBV-mhSCF）并在大肠杆菌中获得高效表达。     

人内皮抑素cDNA克隆和初步表达

目的：克隆人内皮抑素基因,获得初步表达产物,为进一步研究打下基础,方法：用RT－PCR方法从中国汉族人正常肝组织扩增出内皮抑素cDNA,T／A插入puCm-T载体,测序,,再插入表达载体pKPL-3a,转化大肠杆菌POP2136,42度诱导表达,SDS－PAGE分析表达蛋白,结果：中国人内皮抑素cDNA开放阅读框架全长552bp,编码184个氨基酸,其85位谷氨酸和98位天冬氨酸密码子的第三位碱基出现改变,但编码的氨基酸不变,结论：构建了中国人内皮抑素的克隆载体和表达载体,初步表达了约20kD人重组内皮抑素。     

人肝脏再生增强因子cDNA的克隆、表达及纯化

克隆人肝脏再生增强因子（ｈＡＬＲ）ｃＤＲＮＡ,构建重组表达载体并对其诱导表达,纯化。方法：提取胎儿肝组织总ＲＮＡ,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增出ｈＡＬＲｃＤＮＡ,克隆于载体ｐＧＥＭ－Ｔ,酶切鉴定后亚克隆至表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－３,测序证实序列正确并转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,ＩＰＴＧ诱导表达融合蛋白ＧＳＴ－ｈＡＬＲ,表达物通过谷胱甘肽Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析纯化后进行Ｔｈｒｏｍｂｉｎ酶切,     

人肿瘤坏死因子样蛋白全长cDNA的克隆及原核表达

目的分离、克隆编码人肿瘤坏死因子样蛋白(TNFLP)的全长cDNA,并对其功能进行初步研究。方法从本室构建的λZAP表达胎脑文库中分离到编码TNFLP的全长cDNA。应用多种软件对该基因及其编码蛋白进行分析,寻找其同源蛋白,分析其亲、疏水性及其存在的结构域和基序。以Northern印迹分析检测TNFLP的mRNA的组织分布,并用谷胱苷肽-S-转移酶(GST)原核表达系统分段表达TNFLP的N端和C端蛋白。结果TNFLP全长共2112bp,编码一208个氨基酸的蛋白。亲、疏水性分析显示,TNFLP有两个疏水区,且C端95个氨基酸与小鼠的TNF-α一致性为42%。基序分析显示,TNFLP的C端有一内质网膜定位信号-TYKRL,与TNF-α完全一致。人的TNFLP位于人的16号染色体上。Northern杂交显示,TNFLP在心、脑和胰腺中呈高表达,可见一个转录本。用GST原核表达系统,分段表达了TNFLP的N端和C端。结论初步分析了TNFLP的组织表达谱,并分段表达了其N端和C端,为进一步研究其功能提供了条件。     

人白细胞介素17cDNA的克隆及表达

目的 获取重组的人白细胞介素17以进行科学研究和应用。方法 应用RT－PCR的方法，从经PHA活化的人外周血单个核细胞中扩增hIL-17cDNA的编码序列，将其克隆至测序载体pBS SKⅡ（ ）中进行测序，再将其亚克隆至表达载体pBV220中，在大肠杆菌XL1－Blue中进行表达。结果 克隆获得了hIL-17cDNA，经热诱导后使hIL-17蛋白在大肠杆菌中的表达量达到了39．7％。结论 通过克隆hIL-17cDNA的编码序列及热诱导使hIL-17蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达。     

人IL—8cDNA克隆及原核表达

目的 从外周血单核细胞中克隆人IL-18成熟编码序列cDNA,对其进行测序并构建原核表达载体,进行原核表达。方法 从人外周血单核细胞中分离总RNA,进行RT-PCR获得人IL-18cDNA,测序证实其结果正确后,检建原核表达载体。E.coli的表达产物通过SDS-PAGE、Western Blot证实,结果 所克隆的人IL-18cDNA编码序列经测序证实与GenBank所报道的序列完全一致,细菌表达产物经SDS-PAGE证实其大小约为18.3KDa,Western Blot进一步证实了所表达产物的正确性。结论 本研究结果为进一步探讨IL-18的生物学活性和特性奠定了基础,同时亦为利用人IL-18进行免疫基因治疗的研究打下了良好的基础。     

人及大鼠胶质细胞源性神经营养因子cDNA的克隆与表达

目的：克隆与表达人及大鼠胶质细胞源性神经营养因子ｃＤＮＡ。方法和结果：用逆转录－聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增了人及大鼠ＧＤＮＦ成熟序列的ｃＤＮＡ片段，并将人及大鼠ＧＤＮＦ ｃＤＮＡ重组到表达质粒ｐＢＰＬ中，分别在大肠杆菌中获得了较高表达。结论：人及大鼠ＧＤＮＦ ｃＤＮＡ的克隆与表达获得成功，为研究ＧＤＮＦ在神经损伤修复中的作用奠定了基础。     

人可溶性CD40L cDNA的克隆及表达

目的: 利用基因技术克隆CD40L分子的胞外区184～831片断cDNA,构建其原核表达载体,从而建立原核表达体系. 方法: 采用RT-PCR 方法从人扁桃体的总RNA中扩增CD40L分子184～831片断的cDNA,以限制性酶切和DNA 测序进行鉴定,并将目的片断克隆至原核表达载体pET-28a ,让重组质粒在BL21中表达,利用Western blot鉴定目的蛋白. 结果: 克隆到人sCD40L分子184～831片断的cDNA,DNA测序结果与报道的完全一致;构建了该片断的原核表达载体, 且目的蛋白能在BL21中表达. 结论: 成功克隆人sCD40L分子184～831片断的cDNA并构建了其原核表达载体. 在BL21中成功表达了目的蛋白.     

人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子cDNA的克隆及鉴定

目的:克隆人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子全长cDNA以构建相应腺病毒表达载体。方法:根据人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因序列设计合成可扩增人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子cD-NA的特异性引物,用RT-PCR法从骨髓细胞总RNA中扩增人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子cDNA,并克隆至pGEM-T载体中,经酶切鉴定后再行序列分析。结果:逆转录多聚酶链反应扩增产物长度与预期的456 bp一致;用M13正、反向引物行荧光测序,证实克隆出的序列与GenBank的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子cDNA序列完全一致;人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子全长cDNA被成功地插入到质粒pGEM-T中。结论:克隆人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子全长cDNA为构建相应腺病毒表达载体及应用B7-1行肿瘤免疫基因治疗提供了可能性。     

BMP-4cDNA的克隆表达及活性的初步测定

目的：利用原核基因工程生产有诱骨活性的骨形态发生蛋白－4（BMP－4），方法：应用RT－PCR技术，从成熟人的胎盘组织中扩增出长0．34Kb编码入骨形态发生蛋白－4成熟肽的基因序列，经测序证实后，装入表达载体pET-22b，诱导表达后SDS－PAGE显示在14kd处有一明显的表达条带，经初步鉴定，证实表达蛋白部分位于裂菌处理后的上清中，部分以包涵体的形式存在于沉淀中，将沉淀中的包涵体蛋白纯化，变性和复性处理，和上清中的蛋白分别经真空冷冻干燥后，植入小鼠的肌肉内检测蛋白活性。结论：第14d和21d，组织切片可见骨细胞和骨基质的形成，结论：大肠杆菌表达的BMP－4的经复性处理后具有诱骨活性。     

BMP-4cDNA的克隆表达及活性的初步测定

目的利用原核基因工程生产有诱骨活性的骨形态发生蛋白-4(BMP-4). 方法应用RT-PCR技术,从成熟人的胎盘组织中扩增出长0.34Kb编码人骨形态发生蛋白-4成熟肽的基因序列,经测序证实后,装入表达载体pET-22b,诱导表达后SDS-PAGE显示在14kd处有一明显的表达条带.经初步鉴定,证实表达蛋白部分位于裂菌处理后的上清中,部分以包涵体的形式存在于沉淀中.将沉淀中的包涵体蛋白纯化、变性和复性处理,和上清中的蛋白分别经真空冷冻干燥后,植入小鼠的肌肉内检测蛋白活性. 结果第14d和21d,组织切片可见骨细胞和骨基质的形成. 结论大肠杆菌表达的BMP-4经复性处理后具有诱骨活性.     

人绒毛膜促性腺激素α亚基cDNA克隆、表达及纯化

目的 从人绒毛膜组织中克隆人绒毛膜促性腺激素α亚基(HCGα)cDNA，构建表达载体并进行了表达、纯化，为进一步研究HCGα在多种肿瘤及异常妊娠中的作用作前期准备。方法 提取新鲜人绒毛膜组织总RNA，利用RT—PCR技术扩增出HCGα cDNA，克隆于表达载体PGEX4T-1，酶切鉴定后测序，测序证实序列正确，并转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导表达融合蛋白GST-HCGα。超声破菌后上清经谷胱甘肽Sepharose 4B亲和层析纯化，沉淀包涵体经变性：透析复性等处理，用SDS—PAGE电泳、Western印迹分析产物。结果 琼脂糖凝胶电泳结果显示RT—PCR扩增片段大小约280bp，同预计片段相符。SDS—PAGE电泳显示诱导表达的产物经初步处理后有36kd左右的一条明显新增条带，与预期分子量相符，Western印迹证实此结果。融合蛋白主要以包涵体形式存在。结论 成功地从人绒毛膜组织中克隆出HCGα cDNA，克隆基因在大肠杆菌中获得了较高水平的表达，表达产物有较好的免疫特异性。     

人绒毛膜促性腺激素β亚基cDNA的克隆初步报告

用新鲜的人绒毛膜组织，抽提组织总ＲＮＡ并通过逆转录反应合成ｃＤＮＡ第一链。利用人工合成的一对寡核苷酸引物，采用ＰＣＲ技术特异性地扩增ｈＣＧ－β－ｃＤＮＡ。琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增片段大小为５００ｂｐ，同预计的片段长度相符。将此片段利用Ｔ－Ａ载体克隆至ＰＣＲⅡ质粒上并进行全序列分析，结果显示克隆片段包含ｈＣＧ－βｃＤＮＡ５’端和３’端非编码区及完整的编码区。     

人绒毛膜促性腺激素β亚基cDNA的克隆初步报告

用新鲜的人绒毛膜组织，抽提组织总ＲＮＡ并通过逆转录反应合成ｃＤＮＡ第一链。利用人工合成的一对寡核苷酸引物，采用ＰＣＲ技术特异性地扩增ｈＣＧ－β ｃＤＮＡ。琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增片段大小为５００ｂｐ，同预计的片段长度相符。将此片段利用Ｔ－Ａ载体克隆至ＰＣＲⅡ质粒上并进行全序列分析，结果显示克隆片段包含ｈＣＧ－β ｃＤＮＡ５＇端和３＇端非编码区及完整的编码区。     

人膜型gp130分子的克隆与表达

采用从人多发性骨髓细胞ＸＧ－７中提取ｇｐ１３０的ｍＲＮＡ经逆转录，ＰＣＲ等步骤克隆出人ｇｐ１３０的全长基因，将人ｇｐ１３０基因克隆至真核细胞表达载体ｐＫＣＲ６中，构建成ｐＫＣＲ６／ｇｐ１３０重组质粒，转染小鼠ＢＡＦ－Ｂ０３细胞后，经流式细胞仪和生物活性检测，证实人ｇｐ１３０分子已在经细胞中稳定表达。     

人BAFF cDNA的克隆及原核表达载体的构建

目的 克隆人BAFF（B cell activating factor belonging to the TNF family)全长及128－285片段的cDNA并构建其原核表达载体，为表达和检测其生物学活性做准备。方法 提取HL－60细胞总RNA，经RT－PCR扩增编码人BAFF全长及128－285氨基酸残基的cDNA序列，并将其克隆至载体pUC18和pUC19进行序列测定，然后构建于新型原核表达载体pQE-80L中。结果 RT－PCR扩增得到了858bp和477bp的DNA片段，序列分析与GenBank中报道的编码BAFF全长及128－285氨基酸残基的cDNA序列完全一致。结论 BAFF cDNA的克隆及其原核表达载体的构建，为进一步表达和检测其生物学活性奠定了基础。     

人TNFRI cDNA的克隆及酵母表达载体的构建

本实验利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)以人单核淋巴细胞系U937细胞总RNA为模板,扩增出人TNFRI型受体胞外区约224个氨基酸残基的cDNA序列,将此片段为模板,采用剿式PCR技术扩增出编码TNFRI胞外区约180个氨基酸的DNA序列,将其克隆于载体PDM18-T进行序列测定,随后构建于新型酵母表达载体PGBKT7-DNA-BD,为进一步通过酵母双杂交获得拮抗TNFRI的具有生物学活性的多肽奠定了基础.     

人NDRG4-B cDNA克隆和表达

目的：获得NDRG4-B(N-myc downstream-regulated gene 4-B)的编码基因，表达NDRG4-B蛋白。方法：以成人脑cDNA文库为模板，通过PCR方法扩增NDRG4-B编码基因，克隆至pMD18-T载体并测序，再亚克隆至表达载体pRSET-A，转化大肠杆菌，IPTG诱导表达6His-NDRG4-B融合蛋白。结果：从成人脑cDNA文库中扩增出编码NDRG4-B的cDNA，序列测定证实有两个沉默突变(从ATG开始，第765bp处：G→A；966bp处：A→G)；成功构建了pRSET-A融合表达载体NDRG4-B-pRSET-A；表达了6His-NDRG4-B融合蛋白。结论：克隆与表达了人NDRG4-B。     

人粒细胞集落刺激因子cDNA的克隆及其在CHO细胞的表达

该文以ＰＫＣＲ４质粒为载体，构建了人体细胞集落刺激因子（ｈＧ－ＣＳＦ）的次级克隆ＰＫＣＲ４－Ｇ－ＣＳＦ，并成功转染ＣＨＯ细胞，获得高表达，稳定分泌人Ｇ－ＣＳＦ的转基因细胞，为扩大规模基因工程生产重组细胞因子奠定了一定的基础。