肝硬化患者骨髓间充质干细胞诱导分化为肝样细胞的实验

目的:探讨肝硬化患者骨髓间充质干细胞向肝样细胞的诱导分化,为患者自体骨髓间充质干细胞移植修复肝损伤提供实验依据。方法:实验于2005-05/06在解放军北京军区总医院肝病中心完成。骨髓来自北京军区总医院肝病中心一例肝硬化患者,应用Ficoll分离液分离培养其骨髓间充质干细胞,应用人肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞进行定向诱导分化,采用倒置显微镜形态观察、反转录聚合酶链反应及免疫组织化学染色检测诱导前后不同阶段骨髓间充质干细胞中白蛋白和角蛋白18核糖核酸和蛋白的表达,通过细胞形态及其白蛋白和角蛋白18的表达等指标确定骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化。结果:①经Ficoll分离液分离得到的人骨髓间充质干细胞体外培养20d左右细胞生长达80%～90%汇合,其形态呈较均一的长梭形。②人骨髓间充质干细胞经肝细胞生长因子诱导培养3周后,诱导组中出现圆形细胞,呈克隆样生长。③人骨髓间充质干细胞经肝细胞生长因子诱导2周时,表达少量白蛋白核糖核酸,于诱导3周时可见白蛋白核糖核酸的表达明显增多。④应用肝细胞生长因子诱导3周后人骨髓间充质干细胞胞浆中白蛋白及角蛋白18染色均呈阳性。结论:肝硬化患者骨髓间充质干细胞在肝细胞生长因子诱导下能定向分化为肝样细胞。     

骨髓间充质干细胞向肝样细胞的诱导及分化

背景:研究表明,在体外提供肝细胞及成纤维细胞生长因子等多种因子可诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化,但对其诱导的最佳环境还处于摸索阶段.目的:观察体外应用肝细胞生长因子和成纤维生长因子4等多种因子联合诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化能力.方法:采用全骨髓贴壁培养法分离、扩增大鼠骨髓间充质干细胞,培养第3代时用肝细胞生长因子、成纤维生长因子4、胰岛素铁硒传递蛋白及地塞米松等联合诱导其向肝样细胞的分化.于诱导7,14,21 d后观察细胞形态变化,RT-PCR检测细胞白蛋白、甲胎蛋白、细胞角蛋白的mRNA表达;于诱导14,21 d行PAS糖原染色检测,并采用免疫细胞荧光法检测细胞白蛋白表达.结果与结论:随着诱导时间的延长,骨髓间充质干细胞表现为肝细胞样,并呈集落生长,肝细胞特异性标志物逐渐出现和成熟.细胞诱导至7 d出现甲胎蛋白mRNA表达,14 d表达增高,21 d时表达下降;14 d时细胞角蛋白18、白蛋白 mRNA和糖原出现表达,并随时间延长表达逐渐增加.细胞诱导14 d时,胞浆白蛋白出现表达,至21 d时表达增强.证实骨髓间充质干细胞在肝细胞生长因子、成纤维生长因子4等多种因子诱导作用下,具有强大的向肝细胞分化能力.     

骨髓间充质干细胞向肝样细胞的诱导及分化

背景：研究表明,在体外提供肝细胞及成纤维细胞生长因子等多种因子可诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化,但对其诱导的最佳环境还处于摸索阶段。目的：观察体外应用肝细胞生长因子和成纤维生长因子 4 等多种因子联合诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化能力。方法：采用全骨髓贴壁培养法分离、扩增大鼠骨髓间充质干细胞,培养第 3 代时用肝细胞生长因子、成纤维生长因子 4、胰岛素铁硒传递蛋白及地塞米松等联合诱导其向肝样细胞的分化。于诱导 7,14,21 d 后观察细胞形态变化,RT-PCR 检测细胞白蛋白、甲胎蛋白、细胞角蛋白的 mRNA 表达;于诱导 14,21 d 行 PAS 糖原染色检测,并采用免疫细胞荧光法检测细胞白蛋白表达。结果与结论：随着诱导时间的延长,骨髓间充质干细胞表现为肝细胞样,并呈集落生长,肝细胞特异性标志物逐渐出现和成熟。细胞诱导至 7 d 出现甲胎蛋白 mRNA 表达,14 d 表达增高,21 d 时表达下降;14 d 时细胞角蛋白 18、白蛋白 mRNA和糖原出现表达,并随时间延长表达逐渐增加。细胞诱导 14 d 时,胞浆白蛋白出现表达,至 21 d 时表达增强。证实骨髓间充质干细胞在肝细胞生长因子、成纤维生长因子 4 等多种因子诱导作用下,具有强大的向肝细胞分化能力。     

小鼠再生肝浸出液体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞样分化的研究

目的应用小鼠再生肝浸出液体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞样分化。方法利用2／3肝部分切除术后36h小鼠再生肝组织浸出液定向诱导小鼠骨髓间充质干细胞，在倒置显微镜下观察细胞形态，应用免疫荧光法鉴定细胞性质。结果骨髓间充质干细胞经小鼠再生肝浸出液诱导7d后，呈肝细胞样圆形，1～2周后免疫荧光染色可见细胞表达肝细胞标记物CK8、CK18和清蛋白。结论小鼠再生肝浸出液可诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞方向分化。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为肝细胞样细胞的特征及功能

目的：观察人骨髓间充质干细胞体外培养定向分化为肝细胞样细胞的过程及其特征。方法：实验于2003—12／2004—05在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心实验室完成。人骨髓取自髂后上嵴骨髓穿刺的健康供者，来源于中山大学附属第二医院儿科患儿健康家属。全骨髓贴壁筛选法分离出骨髓间充质干细胞，体外扩增后以流式细胞仪鉴定其表面标志。取扩增5代的骨髓间充质干细胞，分为2组，分化组于加入20μg／L肝细胞生长因子和10μg／L成纤维细胞生长因子4的opti-MEMI低血清培养基中诱导分化，空白对照组则不加任何细胞因子。2周后，行细胞形态学观察，并检测成热肝细胞的糖原合成和尿素分泌功能(免疫细胞化学法检测甲胎蛋白、白蛋白及细胞角蛋白18，19表达，反转录-聚合酶链式反应检测甲胎蛋白、白蛋白基因mRNA转录水平，高碘酸-Schiff染色检测糖原及紫外分光光度法测定尿素氮合量)。结果：①流式细胞仪显示第5代骨髓间充质干细胞高表达表面抗原白细胞分化抗原29，不表达白细胞分化抗原34，11b。②分化组骨髓间充质干细胞至第14天，部分细胞分化为多角形的肝细胞样细胞。③免疫细胞化学法检测到细胞特异性表达甲胎蛋白、白蛋白及细胞角蛋白18，19，反转录-聚合酶链式反应显示有甲胎蛋白和白蛋白mRNA转录。④高碘酸-Schiff糖原染色可见胞浆内存在红色颗粒，呈阳性反应，培养液内尿素氮含量亦明显升高。⑤空白对照组骨髓间充质干细胞则未见上述各项变化。结论：在低血清培养体系中，采用成纤维细胞生长因子4和肝细胞生长因子联合诱导，证明人骨髓间充质干细胞在体外能定向分化为肝细胞样细胞，诱导后的骨髓间充质干细胞上有了成熟肝细胞的糖原合成和分泌尿素的特征性功能，表明骨髓间充质干细胞可作为肝细胞移植和人工肝的新型种子细胞。     

生长因子体外诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化

背景:肝细胞生长因子是体外诱导骨髓间充质干细胞向肝干细胞方向分化的关键性细胞因子。碱性成纤维细胞生长因子不仅能提高骨髓间充质干细胞的增殖速度及其寿命,且能在增殖过程中保留骨髓间充质干细胞的多向分化潜能。目的:探讨肝细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞的可行性。方法:取大鼠股骨骨髓,用直接贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞并体外传代,流式细胞仪及成骨诱导对骨髓间充质干细胞进行鉴定。将细胞按以下分组进行成肝诱导:①M0组:不添加任何因子。②M1组:20μg/L肝细胞生长因子。③M2组:20μg/L肝细胞生长因子+5μg/L碱性成纤维细胞生长因子。④M3组:20μg/L肝细胞生长因子+10μg/L碱性成纤维细胞生长因子。⑤M4组:20μg/L肝细胞生长因子+20μg/L碱性成纤维细胞生长因子。倒置显微镜下观察细胞形态变化,在不同分化阶段用免疫细胞化学染色法检测不成熟肝细胞表型标志甲胎蛋白和成熟肝细胞表型标志细胞白蛋白的表达。结果与结论:骨髓间充质干细胞诱导后呈肝样细胞形态改变。甲胎蛋白在诱导第7天细胞基本为阳性着色,在诱导第14天时表达降低,21d表达为阴性。细胞白蛋白在诱导第14天细胞开始表达,而后持续。M0对照组未见阳性染色,同一时间点,M3、M4组细胞阳性染色率高于M2组(P<0.05)。提示肝细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子具有体外诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的作用,二者有协同作用。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导为肝细胞样细胞

背景:目前体外诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞样细胞的研究主要集中在不同诱导因子的诱导作用,而微环境的诱导作用研究较少.目的:观察肝细胞生长因子、胎肝细胞对骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞样细胞的影响.方法:采用密度梯度离心法分离大鼠骨髓间充质干细胞,反复贴壁法纯化扩增骨髓间充质干细胞;采用Ⅰ型胶原酶消化法分离孕3周大鼠胚胎肝脏细胞,差速贴壁法纯化肝脏细胞;阴性对照组骨髓间充质干细胞只加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基.诱导组在阴性对照组基础上加入一定浓度肝细胞生长因子或者与胎肝细胞共培养进行诱导分化.结果与结论:诱导组白蛋白、甲胎蛋白水平均高于非诱导组(P < 0.01),诱导组糖原染色阳性,免疫细胞化学染色CK-18阳性,而非诱导组糖原染色、CK-18均阴性.结果显示肝细胞生长因子和胎肝细胞均可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为具有肝细胞样细胞表型和功能的类肝细胞.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导为肝细胞样细胞

背景：目前体外诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞样细胞的研究主要集中在不同诱导因子的诱导作用,而微环境的诱导作用研究较少。目的：观察肝细胞生长因子、胎肝细胞对骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞样细胞的影响。方法：采用密度梯度离心法分离大鼠骨髓间充质干细胞,反复贴壁法纯化扩增骨髓间充质干细胞;采用Ⅰ型胶原酶消化法分离孕3周大鼠胚胎肝脏细胞,差速贴壁法纯化肝脏细胞;阴性对照组骨髓间充质干细胞只加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基。诱导组在阴性对照组基础上加入一定浓度肝细胞生长因子或者与胎肝细胞共培养进行诱导分化。结果与结论：诱导组白蛋白、甲胎蛋白水平均高于非诱导组（P〈0.01）,诱导组糖原染色阳性,免疫细胞化学染色CK-18阳性,而非诱导组糖原染色、CK-18均阴性。结果显示肝细胞生长因子和胎肝细胞均可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为具有肝细胞样细胞表型和功能的类肝细胞。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化:肝细胞生长因子和表皮细胞生长因子的作用

背景:研究证实人骨髓间充质干细胞能够诱导分化为肝样细胞,但其具体生物学特性及分化机制尚不清楚,且诱导分化培养体系尚不成熟.目的:探讨肝细胞生长因子和表皮细胞生长因子体外诱导人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的可行性.方法:取食管癌手术患者肋骨,采用密度梯度离心联合贴壁筛选法获取人骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面分子的表达.取第3代人骨髓间充质干细胞,分为4组,肝细胞生长因子组加入20 μg/L肝细胞生长因子,表皮细胞生长因子组加入20 μg/L表皮细胞生长因子,联合组同时加入上述两种生长因子,空白对照组不加任何生长因子.倒置显微镜下观察细胞形态的变化,诱导7,14 d RT-PCR检测甲胎蛋白与白蛋白mRNA的表达.结果与结论:入骨髓间质干细胞不表达造血细胞标志CD34,CD45,强表达β1-整合素CD29和基质受体CD44.肝细胞生长园子组、表皮细胞生长因子组、联合组诱导后,细胞形态由长梭形变为类圆形或多角形,诱导第7,14天甲胎蛋白、白蛋白mRNA均呈阳性表达:空白对照组未见多角形细胞,甲胎蛋白、白蛋白mRNA均呈阴性表达.证明肝细胞生长因子、表皮细胞生长因子以及二者联合均具有诱导人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的能力,至于二者联合是否能增强其分化能力尚待进一步免疫细胞化学染色定量分析予以验证.     

重型肝病患者血清诱导脐血间充质干细胞表达白蛋白和细胞角蛋白18

背景:脐血富含间充质干细胞,刺激后进入细胞周期的速度以及自分泌生长因子的能力均强于骨髓及外周血干细胞。目的:观察肝衰竭患者血清对人脐血间充质干细胞的诱导分化作用。方法:密度梯度离心和贴壁培养法相结合分离纯化脐血间充质干细胞并鉴定,以20%肝衰竭患者血清诱导培养,培养7,14,21d采用免疫组织化学方法检测白蛋白和细胞角蛋白18的表达。结果与结论:实验分离获得了高纯度贴壁生长的间充质干细胞,人脐血间充质干细胞高表达CD44和CD29,不表达CD34,体外可以分化为脂肪细胞;人脐血间充质干细胞在肝病患者血清的低糖DMEM培养基中形态发生明显改变,镜下观察细胞变得稍大而扁平,呈类上皮样细胞,SP染色显示实验组培养7d时仅少数细胞表达白蛋白和细胞角蛋白18,培养14,21d,白蛋白和细胞角蛋白18表达阳性率逐渐升高,与对照组相比差异有显著性意义(P<0.05)。提示密度梯度离心和贴壁培养法相结合可以获得纯度较高的脐血间充质干细胞,肝衰竭患者血清可诱导间充质干细胞表达白蛋白和细胞角蛋白18。     

胚胎干细胞与生殖细胞

目的：探讨生殖细胞的发生和细胞标记及胚胎干细胞向生殖细胞分化的进展及其关系。 资料来源：检索Medline 1950-01／2005～12相关胚胎干细胞和生殖细胞的文献，检索词“embryonic stem cells，germ cells”，并限定文献语言种类为English。同时检索CNKI 1990-01／2005～12相关胚胎干细胞与生殖细胞方面的文献，检索词为“胚胎干细胞，生殖细胞”，并限定语言种类为中文。 资料选择：对资料初审，选取包括胚胎干细胞和生殖细胞方面的文献，开始查找文献。纳入标准：①胚胎干细胞。②生殖细胞。排除标准：综述、重复研究类文章。 资料提炼：共收集到714篇关于胚胎干细胞和生殖细胞的文献，纳入23篇符合标准的文献。 资料综合：胚胎干细胞是来源于着床前胚胎的一类未分化的全能性（多能性）干细胞。胚胎干细胞在一定条件下可以分化为包括生殖细胞在内的所有功能细胞。胚胎干细胞与各级生殖细胞及原始生殖细胞来源的胚胎生殖细胞具有一定的相似形。人类、小鼠和其它哺乳动物类胚胎干细胞的分离、建系和定向分化已经取得重要进展。而且胚胎干细胞可以诱导分化为包括生殖细胞在内的三个胚层的所有细胞类型。原始生殖细胞、胚胎干细胞和胚胎生殖细胞具有一些共同特性，可能共同来源于早期生殖细胞。 结论：胚胎干细胞在一定条件下可以分化为包括生殖细胞在内的所有类型细胞。胚胎干细胞与各级生殖细胞有一定的相似形。     

干细胞与肿瘤干细胞

目的:概述干细胞、肿瘤干细胞与肿瘤发生发展之间的关系,为肿瘤的研究及临床治疗提供参考。资料来源:检索PubMed1997-01/2007-02与干细胞和肿瘤干细胞相关的文献,检索词“stem cell,cancer stem cell,cancer,development,self-renewal,tumorigenesis”,并限定语言种类为英文。资料选择:对资料进行初审,纳入标准:①肿瘤干细胞目前研究的进展。②肿瘤干细胞在肿瘤治疗中的应用。排除标准:①文献中重复研究和综述文章。②肿瘤干细胞以外的文章。③Meta分析类文章。资料提炼:共收集到52篇关于干细胞治疗及研究现状的文章,通过查找全文重点引用30篇文章。资料综合:目前肿瘤的治疗方法主要是针对肿瘤组织内的大多数细胞,常有复发和转移,使治疗失败。随着白血病、乳腺癌及脑肿瘤的干细胞的分离纯化,肿瘤干细胞学说逐渐成熟起来。肿瘤细胞来源于肿瘤干细胞,是肿瘤复发和转移的根源,可靶向性杀伤肿瘤干细胞从而使根治肿瘤和防止肿瘤复发和转移成为可能。结论:只有小部分肿瘤干细胞才有成瘤及维持恶性显型的作用,因此肿瘤的治疗关键应是针对肿瘤干细胞的治疗,肿瘤干细胞的起源、研究方法及研究内容均需进一步研究探讨,而实际上如果肿瘤是源于肿瘤干细胞,先前诸多关于肿瘤发生发展的机制、细胞信号途径等的研究成果需要重新评价,对传统的肿瘤治疗方式提出了巨大的挑战。     

胚胎干细胞与生殖细胞

目的:探讨生殖细胞的发生和细胞标记及胚胎干细胞向生殖细胞分化的进展及其关系。资料来源:检索Medline1950-01/2005-12相关胚胎干细胞和生殖细胞的文献,检索词“embryonicstemcells,germcells”,并限定文献语言种类为English。同时检索CNKI1990-01/2005-12相关胚胎干细胞与生殖细胞方面的文献,检索词为“胚胎干细胞,生殖细胞”,并限定语言种类为中文。资料选择:对资料初审,选取包括胚胎干细胞和生殖细胞方面的文献,开始查找文献。纳入标准:①胚胎干细胞。②生殖细胞。排除标准:综述、重复研究类文章。资料提炼:共收集到714篇关于胚胎干细胞和生殖细胞的文献,纳入23篇符合标准的文献。资料综合:胚胎干细胞是来源于着床前胚胎的一类未分化的全能性(多能性)干细胞。胚胎干细胞在一定条件下可以分化为包括生殖细胞在内的所有功能细胞。胚胎干细胞与各级生殖细胞及原始生殖细胞来源的胚胎生殖细胞具有一定的相似形。人类、小鼠和其它哺乳动物类胚胎干细胞的分离、建系和定向分化已经取得重要进展。而且胚胎干细胞可以诱导分化为包括生殖细胞在内的三个胚层的所有细胞类型。原始生殖细胞、胚胎干细胞和胚胎生殖细胞具有一些共同特性,可能共同来源于早期生殖细胞。结论:胚胎干细胞在一定条件下可以分化为包括生殖细胞在内的所有类型细胞。胚胎干细胞与各级生殖细胞有一定的相似形。     

Perivascular cells as mesenchymal stem cells

Importance of the field: Mesenchymal stem cells are multipotent adult stem cell populations that have broad differentiation plasticity and immunosuppressive potential that render them of great importance in cell-based therapies. They are identified by in vitro characteristics based on their differentiation potential for clinical approaches while their biological properties and in vivo identities are often less understood.

Areas covered in this review: Recent research carried out in the last decade on mesenchymal stem cell biology suggests that mesenchymal stem cells from various tissues reside in a perivascular location and these can be identified as pericytes that function as mural cells in microvessels.

What the reader will gain: This review covers recent progress on understanding the link between pericytes and mesenchymal stem cells discussing specific points such as response to injury and tissue-specific functions.

Take home message: Despite a long and controversial history, there is a growing acceptance that perivascular cells are connected with mesenchymal stem cells, all that is really lacking is genetic evidence to show differentiation of pericytes into different cells types.     

Hematopoietic stem cells and mature blood cells from pluripotent stem cells

Pluripotent stem cells such as embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells could be good sources for obtaining massive hematopoietic stem cells (HSC) and mature blood cells. Coculture with feeder cells and embryoid body formation are two major strategies to induce hematopoietic differentiation from pluripotent stem cells. Derivation of HSC with ability of reconstituting human hematopoiesis in immunodeficient mice has been achieved. It is also possible to generate mature blood cells such as neutrophils, erythrocytes, and platelets from pluripotent stem cells. Their morphologies, phenotypes, and functions are usually very similar to those of normal counterparts. However, a breakthrough is needed to overcome the issue of "yield", which still stands as a high barrier to reach clinical applications.     

视网膜细胞诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的探索乳鼠视网膜细胞体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的可行性。方法以大鼠BMSCs为研究对象，利用分层共培养的乳鼠视网膜细胞作诱导剂，进行增殖培养、分化诱导；免疫组化法进行细胞性质鉴定。结果加入乳鼠视网膜细胞共培养第7天有神经元样细胞形成，经nestin、NF鉴定为神经元样细胞。结论BMSCs在体外培养条件下，经过新生乳鼠视网膜细胞诱导，可以分化为神经元样细胞。     

干细胞向生殖细胞的分化

学术背景:干细胞来源及数量成为其研究发展及造福人类的瓶颈。如果可以在体外就现有的干细胞资源获得全能的生殖细胞,则能够较大程度上满足人类研究与治疗的需要。目前生殖细胞分化的研究已取得一定进展,使体外途径获得生殖细胞成为可能。目的:阐述近年胚胎及成体干细胞向生殖细胞方向分化的相关研究进展。检索策略:由该论文的研究人员应用计算机检索Pubmed数据库2002-01/2007-06的相关文献,检索词"embryonic stem cells,stem cells,germ cells,oocyte,sperm,differentiation"并限定文章语言种类为English。共检索到487篇文献,对资料进行初审,纳入标准:①与胚胎及成体干细胞向生殖细胞方向分化密切相关。②同一领域选择近期发表或在权威杂志上发表的文章。排除标准:重复性研究。文献评价:文献的来源主要是通过对胚胎干细胞、成体干细胞向生殖细胞方向分化方面内容进行汇总分析。所选用的30篇文献中,14篇为综述,其余均为临床或基础实验研究。资料综合:①胚胎干细胞体外可分化为能迁移入胎儿生殖腺、且具有减数分裂及产生精子能力的原始生殖细胞,其衍生的精子细胞可成功发育成个体。②成体干细胞如骨髓干细胞可在体内外条件下分化为早期生殖细胞、原始生殖细胞、精原干细胞及精原细胞。③雌性哺乳动物具有卵母细胞再生能力,这一观点正逐渐被接受,尽管关于新生卵母细胞来源尚不确定,但胚胎干细胞因其全能性可体外培养分化为卵母细胞。④除卵巢自身外,骨髓、胰腺、皮肤来源的干细胞可通过不同的培养方式生成新的卵母细胞样细胞。干细胞向生殖细胞分化的研究进展为研究生殖细胞形成的分子基础及寻找治疗不孕的新方法提供了可能。结论:生殖细胞启动分化的分子机制、微环境对生殖细胞分化增殖的影响、生殖干细胞转化为卵原细胞或卵母细胞需要的诱导机制等尚不清楚。随着生命科学和干细胞研究技术的不断发展,这些问题终将会克服,体外培养获得生殖细胞的研究必将给人类生殖和生命带来重大影响。