壳聚糖作为组织工程软骨支架的实验研究

目的 探索壳聚糖作为组织工程技术中软骨细胞培养支架的可行性。方法 消化分离猪耳郭软骨细胞，接种于自制壳聚糖、壳聚糖-胶原复合多孔支架上培养，从光镜和扫描电镜观察其亲水性和对细胞吸附力，MTT检测软骨细胞在壳聚糖、壳聚糖-胶原上的黏附率及壳聚糖、壳聚糖-胶原复合多孔支架对细胞的增殖、功能的影响。结果 软骨细胞能够在壳聚糖、壳聚糖-胶原支架上黏附、伸展、增殖和发挥正常功能，MTT测得细胞黏附率分别为81.25%和87.50%，MTT测得软骨细胞在壳聚糖-胶原支架中的增殖能力较强。结论 壳聚糖、壳聚糖-胶原复合多孔支架与软骨细胞具有较好的相容性，壳聚糖-胶原复合多孔支架更适合作为软骨组织工程中的细胞培养支架。     

聚乳酸-聚羟基乙酸/Ⅰ型胶原复合支架的生物相容性研究

目的观察聚乳酸-聚羟基乙酸(poly-lactide-co-glycolide,PLGA)/Ⅰ型胶原复合支架的生物相容性,探讨其作为组织工程阴道支架的可行性。方法取经多聚赖氨酸包被的PLGA置于含0.25%Ⅰ型胶原的醋酸水溶液,制备PLGA/Ⅰ型胶原复合支架。取10~12周龄雌性SD大鼠阴道组织,采用酶消化法分离培养阴道上皮细胞,取第2代细胞进行实验。取复合支架浸提液培养阴道上皮细胞,观察材料细胞毒性。将阴道上皮细胞与复合支架共培养48 h(实验组),检测细胞黏附率;以单纯PLGA支架接种细胞作为对照组。将细胞-支架复合物埋植至SD大鼠皮下,于2、4、8周取材行HE染色、免疫组织化学染色,观察细胞在支架上生长情况。将细胞-支架复合物移植至6只切除阴道组织的SD大鼠阴道部位,于术后3、6个月观察阴道生长情况,6个月后取阴道组织进行组织学观察。结果大鼠阴道上皮细胞在PLGA/Ⅰ型胶原复合支架材料浸提液中生长、增殖良好,细胞毒性为1级。实验组细胞黏附率为71.8%±9.2%,显著高于对照组的63.4%±5.7%(t=2.195,P=0.005)。阴道上皮细胞能在PLGA/Ⅰ胶原复合支架材料上黏附、生长;大鼠皮下埋植2周后,细胞在支架孔隙内生长增殖,成纤维细胞生长;4周支架材料表面形成1~3层上皮;8周后支架材料部分降解,上皮层次增加,呈极性排列,角蛋白免疫组织化学染色呈阳性。细胞-支架复合物原位移植3个月后,大鼠阴道黏膜呈粉红色,有光泽,支架材料大部分降解;6个月时阴道深约1.2 cm,无明显狭窄,阴道黏膜外观类似正常阴道黏膜,皱襞较少,组织学观察示上皮层与正常阴道无明显区别,基底层可见钉状突起,数量少于正常阴道,角蛋白免疫组织化学染色呈阳性。结论 PLGA/Ⅰ型胶原复合支架具有良好的生物相容性,可作为构建组织工程阴道的支架材料。     

壳聚糖/亚磷酸化壳聚糖复合海绵复合人脐带间充质干细胞用于异位成骨的实验研究

目的通过构建壳聚糖/亚磷酸化壳聚糖复合海绵,与人脐带间充质干细胞(human umbilical cordmesenchymal stem cells,hUCMSCs)复合构建组织工程骨并行成骨诱导培养,探讨其异位成骨效果,为骨组织工程寻找理想支架材料。方法在壳聚糖分子中引入亚磷酸根基团,制备亚磷酸化壳聚糖,并进行表征。分别将浓度为2%的壳聚糖和亚磷酸化壳聚糖溶液,按1∶1体积比混合均匀,构建壳聚糖/亚磷酸化壳聚糖复合海绵;然后在模拟体液中进行原位矿化,通过扫描电镜观察矿化前后复合海绵的结构。用酶消化法分离培养hUCMSCs,取生长良好的第3代细胞与壳聚糖/亚磷酸化壳聚糖复合海绵复合培养,构建细胞-支架复合物,并行成骨诱导培养。成骨诱导培养1、2周,分别于光镜及扫描电镜下观察细胞黏附情况;培养1、2、3、4、5、6 d时,MTT法分析细胞增殖情况。取3～4月龄新西兰大白兔40只,雌雄不限,体重2.1～3.2 kg,平均2.5 kg;制备双侧竖脊肌肌袋,在每只兔右侧肌袋内植入细胞-支架复合物(A组,n=40),于其中20只兔左侧肌袋植入壳聚糖/亚磷酸化壳聚糖复合海绵(B组,n=20),剩余20只兔左侧肌袋不植入材料(C组,n=20)。术后观察动物一般情况,4周后处死动物取材,行大体及组织学观察。结果亚磷酸化壳聚糖分析表明亚磷酸化反应主要发生在羟基上,其质子类型和化学位移强度与化学结构一致。扫描电镜观察到壳聚糖/亚磷酸化壳聚糖复合海绵孔洞均匀,孔壁较薄;原位矿化后孔壁表面有钙磷涂层,晶体颗粒生成;细胞在壳聚糖/亚磷酸化壳聚糖复合海绵支架上黏附、生长良好。体内实验大体观察A组可见细胞-支架复合物大小、形态基本保持原状,质地有所增韧,材料周围有薄层结缔样组织;B组复合海绵体积缩小,质地松软;C组肌袋手术创口已愈合。组织学观察A组支架材料部分吸收,边缘有均质类骨物质出现,并见成骨细胞;B组植入区形成圆形空腔,残留壳聚糖支架网络;C组创面基本愈合,肌肉纤维间可见少量淋巴细胞浸润。结论壳聚糖/亚磷酸化壳聚糖复合海绵是一种具有良好生物相容性的支架材料,与hUCMSCs复合构建的组织工程骨在兔体内可异位成骨。     

动态力学加载下MC3T3-E1细胞在3D打印三维仿生复合支架上的成骨效应研究

目的观察动态力学加载对低温3D打印联合冷冻干燥法制备的三维仿生复合支架材料内MC3T3-E1细胞增殖、分化、成骨特异性基因表达的影响。方法将丝素蛋白、Ⅰ型胶原、羟基磷灰石按质量比3∶9∶2混合后,采用低温3D打印联合冷冻干燥技术制备三维仿生复合支架;大体观察支架外形,Micro-CT观察支架孔径及孔隙率,测定吸水膨胀率以及应力、应变、弹性模量。取MC3T3-E1细胞接种至三维仿生复合支架,随机分成两组:实验组培养期间行动态力学加载,每天1次、每次15 min、频率1 Hz、应变3 500με;对照组不作力学加载。培养7、14 d,分别对细胞-支架复合物行HE染色及扫描电镜观察细胞在支架上生长情况;Western blot以及实时荧光定量PCR检测Ⅰ型胶原、BMP-2、骨钙素(osteocalcin,OCN)蛋白及m RNA表达。结果制备的三维仿生复合支架为白色立方体网格,Micro-CT检测见支架材料内部呈孔隙网状结构,孔隙连通性良好;大孔径直径为(506.37±18.63)μm,微孔径直径为(62.14±17.35)μm,孔隙率为97.70%±1.37%,吸水膨胀率为1 341.97%±64.41%。力学测试示,支架压缩至10%时,支架压缩位移为(0.376±0.004)mm、压缩应力为(0.016±0.002)MPa、弹性模量为(162.418±18.754)k Pa。复合培养7、14 d,两组HE染色及扫描电镜均见细胞在支架内部生长,主要分布在支架孔壁周围,其中实验组细胞较对照组增多,且细胞由梭形变为扁平状。除200倍镜下14 d时两组细胞计数差异无统计学意义(t=–2.024,P=0.080)外,其余不同放大倍数(40、100、400倍)下各时间点实验组细胞数均显著高于对照组(P0.05)。实时荧光定量PCR检测示:实验组培养7、14 d时Ⅰ型胶原、OCN m RNA相对表达量显著高于对照组(P0.05),但BMP-2 m RNA相对表达量与对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。Western blot检测示,实验组培养7、14 d时Ⅰ型胶原、BMP-2、OCN蛋白相对表达量均显著高于对照组(P0.05)。结论动态力学加载后,接种于三维仿生复合支架的MC3T3-E1细胞BMP-2、Ⅰ型胶原、OCN表达明显上调,表明适当力学载荷有利于MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化。     

胶原凝胶构建神经组织工程支架的实验研究

目的研究胶原凝胶支架对大鼠BMSCs增殖和分化的影响,探讨其作为神经组织工程支架的可行性。方法利用Ⅰ型胶原制备胶原凝胶支架。采用密度梯度离心法分离培养大鼠BMSCs,取第5代细胞制备胶原凝胶-BMSCs复合体。采用扫描电镜、HE染色观察胶原凝胶支架的形态结构及复合培养后细胞形态;MTT检测该支架对BMSCs增殖的影响。取绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)阳性(GFP~+)BMSCs于胶原凝胶支架中培养24 h,通过激光共聚焦显微镜及活细胞工作站观察细胞生长及与材料的黏附情况。结果激光共聚焦显微镜及活细胞工作站观察示,GFP~+BMSCs均匀分布于胶原凝胶支架内,大部分GFP~+BMSCs呈梭形,部分细胞伸出突起,部分细胞间形成连接,提示BMSCs在三维空间中生长良好。扫描电镜示胶原凝胶支架为多孔纤维网状结构,BMSCs可黏附于该支架材料上,细胞形态良好。MTT检测示,BMSCs于胶原凝胶支架中培养后3、5、7 d的吸光度(A)值均高于单纯BMSCs培养,其中5、7 d时组间差异有统计学意义(t=4.472,P=0.011;t=4.819,P=0.009)。HE染色示,胶原凝胶支架呈均质淡粉染细丝样物质。BMSCs在胶原凝胶内培养24 h后均匀分布其中;7 d时BMSCs形态多样,部分细胞伸出细长突起,具有体外培养的神经元样形态。结论胶原凝胶支架制备简便,具有良好的生物相容性,可作为神经组织工程支架材料。     

重组人BMP-2修饰的β磷酸三钙/胶原材料制备及其诱导成牙性能的初步研究

目的构建重组人BMP-2(recombinant human BMP-2,rhBMP-2)修饰的β磷酸三钙(βtricalciumphosphate,β-TCP)/胶原生物支架材料,初步探讨其在牙组织工程中发挥的作用,评价其作为牙组织工程支架材料的可行性。方法将纳米级β-TCP粉末与胶原在强碱性水溶液中复合,制备β-TCP/胶原生物支架材料,并与rhBMP-2复合,制备牙组织工程支架材料。SPF级8～10周龄SD大鼠46只,雄性34只,雌性12只,体重250～300 g。体视显微镜下分离新生SD大鼠的下颌骨,取牙胚消化成细胞悬液,与支架材料复合培养制备组织工程牙胚。通过扫描电镜观察、细胞黏附率测定和MTT测定细胞增殖情况评价支架材料对牙胚细胞体外生长的影响。将组织工程牙胚植入SD大鼠肾被膜下作为实验组(n=12),另分别植入单独牙胚细胞团块(细胞对照组,n=12)及单独支架材料(材料对照组,n=4)作为对照,4、8周时取出标本行大体及组织学观察。结果扫描电镜示β-TCP/胶原生物支架材料呈疏松多孔状,质地柔软,亲水性良好;复合培养3 d后牙胚细胞可紧密贴附于支架材料,生长状态良好。牙胚细胞接种至支架材料上经4、8、12 h孵育后,细胞黏附率分别为27.20%±2.37%、44.52%±1.87%、73.81%±4.15%。MTT检测示牙胚细胞在β-TCP/胶原生物支架材料上的增殖情况与未放置支架材料相似,差异无统计学意义(P>0.05)。各组植入物移植于大鼠肾被膜下4、8周后大体观察可见白色钙化物形成;植入后4周,实验组镜下可见明显牙样形态及典型的釉质和牙本质样结构形成,细胞对照组可见釉质和牙本质样结构,但排列相对紊乱;植入后8周,实验组釉质及牙本质样结构较4周成熟,层次也更加清晰,细胞对照组也可见较为成熟的釉质和牙本质样结构;植入后4、8周,材料对照组均未见牙样结构形成。结论 rh BMP-2修饰的β-TCP/胶原生物支架材料与牙胚细胞生物相容性良好,可作为牙组织工程支架材料的良好选择。     

骨骺干细胞复合壳聚糖/纳米羟基磷灰石支架体外培养的实验研究

目的 探讨免疫磁珠分选的骨骺干细胞(PSCs)经诱导后向软骨细胞方向分化的性能,及其与壳聚糖/纳米羟基磷灰石(CS/nHA)支架材料复合培养构建组织工程化软骨的可行性.方法 用显微手术器械剪取新生24 h内的清洁级SD大鼠股骨下端骺板两端的La Croix环处组织,应用免疫磁珠分选系统分离纯化PSCs,免疫荧光染色观察PSCs成纤维细胞生长因子受体-3(FGFR-3)的表达情况.体外培养并诱导PSCs向软骨细胞特性方向分化,免疫细胞化学、甲苯胺兰及番红O染色检测诱导后细胞Ⅱ型胶原及软骨基质的表达情况.以诱导后接种于CS/nHA支架培养的PSCs为实验组,以诱导后未接种支架的细胞为对照组.扫描电镜观察细胞的黏附及形态学改变,MTT法检测细胞增殖情况,阿辛蓝法测定细胞合成的糖胺多糖(GAG)情况.对两组间不同培养时间的吸光度值及GAG进行比较.结果 免疫磁珠分选的PSCs体外培养增殖迅速,免疫荧光染色显示FGFR-3阳性表达.诱导后的PSCsⅡ型胶原免疫细胞化学染色、甲苯胺兰染色及番红O染色均旱阳性.细胞接种CS/nHA支架后1、4 d,实验组与对照组吸光度值比较差异无统计学意义(P>0.05),而7 d实验组与对照组吸光度值比较筹异有统计学意义(t=-2.786,P=0.024).培养14 d后培养液GAG含量为(89.66±6.52)μg/106个细胞,高于对照组[(78.62±4.63)μg/106个细胞)],差异有统计学意义(t=-3.084,P<0.05).结论 免疫磁珠分选的PSCs经诱导后可向软骨细胞功能方向分化,诱导后的PSCs与CS/nHA分层支架复合有望构建组织工程化软骨.     

3D打印PLA-HA复合材料与骨髓基质细胞的相容性研究

目的 探讨骨髓基质细胞与3D打印聚乳酸-羟基磷灰石(Three-dimensional printed polylactic acid-hydroxyapatite,3D printed PLA-HA)复合支架材料的相容性,为骨组织工程选择合适的支架材料提供理论依据。方法将标记绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的骨髓基质细胞分别与3D打印PLA-HA复合材料和β-磷酸三钙(betatricalcium phosphate,β-TCP)材料体外复合培养,采用荧光显微镜观察细胞在支架材料上的生长黏附情况,并通过扫描电镜观察细胞在支架中的形态变化;CCK8(Cell Counting Kit8)法检测细胞于不同时间点在材料上的黏附率以及增殖情况;碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性测定法检测3 d、7 d、14 d的碱性磷酸酶活性变化。结果 骨髓基质细胞能够在3D打印PLA-HA复合材料和β-TCP材料上黏附生长;β-TCP组细胞黏附率高于3D打印PLA-HA组(P<0.05),但3D打印PLA-HA组在12 h细胞黏附率可达到60%以上;细胞增殖实验显示,3D打印PLA-HA组在体外培养第4天和第7天的细胞增殖量(OD值)均高于β-TCP组与对照组(P<0.05);3D打印PLA-HA组以及β-TCP组在第3天、第7天和第14天的ALP含量均高于对照组,且3D打印PLA-HA组第7天ALP含量较β-TCP组增多(P<0.05)。结论 3D打印PLA-HA复合材料具有良好的细胞相容性,可作为骨组织工程的支架材料。     

脂肪间充质干细胞复合壳聚糖-胶原-硫酸软骨素多孔支架体外成软骨能力的实验研究

目的 制备壳聚糖-胶原-硫酸软骨素三维支架,并与大鼠脂肪间充质干细胞复合培养,探讨其作为软骨组织工程支架的可行性.方法 冷冻干燥法制备壳聚糖-胶原-硫酸软骨素复合多孔海绵支架材料,采用体积法和称重法测定支架的孔隙率和吸水性,扫描电镜观察支架材料的形态结构.分离培养大鼠脂肪间充质干细胞,流式细胞学检测大鼠脂肪间充质干细胞的表面标志CD29、CD34、CD44、CD45,将传至3代的细胞,以2×106/ml的密度接种于自制的壳聚糖-胶原-硫酸软骨素三维支架上.实验组为含TGF-β1的培养基,对照组无TGF-β1,培养3周后,通过免疫组织化学,RT-PCR及westenblot方法对诱导后的细胞进行鉴定.结果 制备的壳聚糖-胶原-硫酸软骨素三维支架具有合适的三维多孔结构,孔隙率为(92.23±1.68)%,孔径为100～130 μm.复合培养3周后,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色成阳性,RT-PCR结果表明有蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA的表达,westenblot检测出Ⅱ型胶原蛋白的表达.结论 壳聚糖-胶原-硫酸软骨素复合支架材料可为脂肪间充质干细胞生长分化及组织形成提供一个良好的环境, 在软骨组织工程的支架材料领域有较广泛的应用前景.     

壳聚糖-胶原复合载体对肝内胆管上皮细胞生长的影响

目的探讨壳聚糖-胶原复合载体对肝内胆管上皮细胞生长的影响,为构建组织工程胆管提供理论与实验准备。方法应用光镜技术及CCK-8试剂测定细胞活力来观察比较肝内胆管上皮细胞裸细胞培养法、壳聚糖培养法、Ⅰ型胶原培养法及壳聚糖-胶原复合载体混合培养法的生长情况。结果壳聚糖-胶原复合载体组细胞生长旺盛,活力优于裸细胞组(P<0.05)、壳聚糖组(P<0.05)及Ⅰ型胶原组(P<0.05)。结论壳聚糖-胶原复合载体对肝内胆管上皮细胞生长有明显促进作用。     

煅烧骨与诱导的MSCs复合的实验研究

目的：观察大鼠骨髓基质干细胞（MSCs）与经胶原涂层处理的煅烧骨（CCB）复合行体外培养时贴附、增殖能力的变化,探讨构建组织工程骨体外培养的最适时间。方法：制备鼠尾胶原（I型胶原）,无菌条件下,将煅烧骨置于胶原液中,2h后取出骨块,置滤网中将孔内外的胶原溶液沥干。体外培养的大鼠MSCs经矿化液诱导向成骨细胞分化。将分化后的成骨细胞滴加到涂胶原的煅烧骨块上,同时以未涂胶原的煅烧骨块为对照组。3天,7天时取材,扫描电镜下观察实验组与对照组成骨细胞在煅烧骨表面的贴附数量及形态,用细胞计数法测定细胞在两组材料的生长曲线,组织化学方法检测成骨细胞的ALP活性。结果：扫描电镜发现实验组成骨细胞的贴附数量显著高于对照组（P〈0．01）。细胞计数认为实验组细胞在材料上粘附数量多,增殖速度快。实验组ALP活性明显高于对照组（P〈0．01）。结论：胶原修饰的煅烧骨具有良好的组织相容性,能明显提高成骨细胞的贴附,并且促进成骨细胞活性维持,体外培养7～8天时,材料上的细胞数达到最大,应尽快植入体内。     

膨体聚四氟乙烯（ePTFE）内支撑组织工程软骨的构建实验研究

目的：探讨骨髓间充质干细胞和软骨细胞混合培养体外构建ePTFE软骨复合体的可能性。方法：实验组：分离、获取、扩增兔骨髓间充质干细胞和软骨细胞,二者按7：3比例混和,接种到以膨体聚四氟乙烯（ePTFE）为内支撑外裹聚羟基乙酸（PGA）支架上,体外培养8周后,行大体、组织学、Ⅱ型胶原免疫组织化学和生物化学检测。对照组：利用实验组支架单纯接种骨髓间充质干细胞行体外培养。结果：实验组：体外培养8周后形成形态良好的软骨样组织复合体,组织学可见成熟软骨陷窝、异染基质、Ⅱ型胶原表达阳性。对照组：无软骨形成。结论：兔骨髓间充质干细胞和软骨细胞混合培养,可以在体外构建出特定形状、结构组织学良好的ePTFE软骨复合体。     

不同浓度重组人BMP-7促进骨髓间充质干细胞复合组织工程支架材料TCP-COL体外构建组织工程软骨的研究

目的观察比较不同浓度重组人BMP-7对骨髓间充质干细胞复合组织工程支架材料TCP-COL体外构建组织工程软骨的影响。方法用梯度离心法获取人骨髓间充质干细胞（hMSCs）,将扩增的第3代hMSCs以1×10~7/ml的细胞浓度接种在支架材料TCP-COL上,分为三组进行培养：对照组（成软骨诱导液培养）,BMP-7（50）组（成软骨诱导液基础上加入50ng/ml的BMP-7）,BMP-7（100）组（成软骨诱导液基础上加入100ng/ml的BMP-7）。培养2周后进行扫描电镜观察（SEM）,苏木素伊红染色（HE）,阿尔新蓝染色,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色（IHC）,荧光定量PCR（RT-PCR）,糖胺多糖定量（GAG quantification assay）研究。结果扫描电镜与苏木素伊红染色结果显示细胞在TCP-COL生物支架中分布均匀且紧密粘附在材料表面。阿尔新蓝染色,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,二型胶原（F=76.931,P〈0.05）,糖胺多糖（F=63.158,P〈0.05）荧光定量PCR,糖胺多糖定量（F=8.981,P〈0.05）结果显示BMP-7能有效促进人骨髓间充质干细胞复合支架材料TCP-COL体外成软骨,且100mg/ml的浓度应用效果大于50mg/ml。但在COL1基因的表达上,BMP-7（50）组和BMP-7（100）组都显著大于对照组（F=34.823,P〈0.05）。结论 BMP-7能有效促进人骨髓间充质干细胞复合支架材料TCP-COL体外成软骨,且100mg/ml的浓度应用效果大于50mg/ml,但应注意其促进骨质增生的作用。TCP-COL是一种有应用前景的生物支架材料。     

力学刺激促进软骨细胞与骨髓基质干细胞共培养体外软骨分化

目的：研究不同的应力刺激对软骨细胞与骨髓基质干细胞（BMSCs）共培养体外构建组织工程化软骨的影响。方法：分离、培养、扩传兔MSCs及软骨细胞,二者按7：3比例混和,以5．0×107／ml的细胞密度接种于聚羟基乙酸（PGA）支架上,一周后根据不同的施加力分为4组：离心组、摇床组、搅拌组,静止培养作为对照组。6周后取材行相关检测。结果：三受力组形成的细胞材料复合物基本保持原来的体积与外形。HE染色结果显示大量成熟软骨陷窝形成,细胞外基质沉积均匀;Safranin-O及甲苯胺兰染色显示有大量的GAG形成,免疫组化检测II型胶原表达强阳性。三受力组标本组织湿重、体积、GAG含量等指标均优于对照组。结论：力学刺激有利于促进少量软骨细胞与BMSCs共培养体外软骨分化;并在三维支架材料上构建组织工程化软骨。     

构建生物可降解性复合支架修复腹壁缺损的可行性研究

目的:探讨采用聚乳酸(polylactic acid,PLA)、甲壳素与明胶为原料,构建生物可降解性复合支架,修复腹壁缺损的可行性。方法:采用1%戊二醛交联的明胶作为支架内芯,PLA和甲壳素以7∶1比例纺丝编织构建支架的外网套,将明胶嵌入外网套,以构建生物可降解性复合支架。将支架浸于磷酸盐缓冲溶液(PBS)中震荡,以检测支架的降解时间;采用直接接触和MTT法检测支架的细胞毒性;通过拉伸、胀破实验测定其力学性能;将密度为1×107/mL的成纤维细胞种植至支架上,观察细胞的黏附、增殖、分化及基质分泌情况。结果:交联明胶的降解时间为(54.8±0.5)d,可适应在细胞长入后的早期降解。外网套的降解时间为(312.5±6.5)d,可维持较长时间的力学强度;横向断裂强度为(319.2±37.8)N,纵向断裂强度为(620.4±45.2)N,可以满足修复腹壁缺损的力学要求。细胞毒性实验显示支架细胞毒性为0～1级,增殖良好;与未交联组(对照组)相比,无统计学差异(P0.05)。成纤维细胞种植在支架上培养5 d后长满支架表面;细胞种植7 d后,开始分泌胞外基质。结论:由交联明胶作为内芯,PLA及甲壳素编织物作为外网套构建的生物可降解性复合支架具有良好的机械性能、降解性、生物相容性,体外实验结果证实其可满足腹壁缺损修复的要求。     

表皮细胞、成纤维细胞和几丁质-胶原蛋白复合人工皮的体外构建

目的 探讨几丁质—胶原蛋白膜作为表皮细胞、成纤维细胞培养支架的可能性，体外构建包含双层细胞的复合皮。方法 取健康成人环切包皮，分离成纤维细胞、表皮细胞，分别制成单细胞悬液，将几丁质-胶原蛋白膜(有孔面向上)平铺于60mm培养皿中，首先接种成纤维细胞，培养2d后，将含10％小牛血清的DMEM更换成完全型DMEM，翻转膜，使光滑面朝上，再种植表皮细胞，每日换液。定期观察细胞与材料的粘附、细胞贴壁及其生长增殖情况。结果 几丁质—胶原蛋白膜对成纤维细胞、表皮细胞无明显毒性作用，成纤维细胞培养1d后，细胞贴附于材料支架，细胞胞体较大，呈典型的梭形。加入表皮细胞复合培养2d示表皮细胞贴壁生长，并分化、增殖。复合皮构建2周，网格支架及孔内均有大量细胞生长，膜表面细胞融合成片，表皮细胞分化形成复层。结论 几丁质—胶原蛋白膜对细胞无毒性，有利于培养细胞的粘附、生长。在体外可以构建成功类似生理性皮肤的人工皮肤。     

人胚胎成纤维细胞作为组织工程皮肤种子细胞的可行性研究

目的：评估人胚胎成纤维细胞（human embryonic fibroblasts,HEF）作为组织工程皮肤种子细胞的可行性和优越性。方法：取人流产胚胎皮肤、正常儿童皮肤,相同条件下分离培养成纤维细胞,比较两组细胞镜下、超微结构以及增殖特性,异体淋巴细胞混合实验对比其抗原性。以第三代细胞复合鼠尾胶原构建三维培养,ELASA法分别测定两组三维构建培养液中IL-6,TGF-β1含量。结果：与普通成纤维细胞相比,胚胎成纤维细胞扩增后具有更好的细胞形态和功能,生长速度快,分裂指数高,几乎不刺激异体淋巴细胞增殖。在鼠尾胶原支架中成纤维细胞生长状态良好,并且具有一定的组织强度。胎儿成纤维细胞组培养液中的TGF-β1和IL-6在各个时相上分别显著低于和高于普通成纤维细胞组。结论：胚胎成纤维细胞是组织工程皮肤较理想的种子细胞。     

牛肌腱复合胶原与人牙周膜成纤维细胞培养的实验研究

目的　观察牛肌腱复合胶原三维支架材料 (tendon mixed extraction of bovine collagen,t MEBC)与人牙周膜成纤维细胞的生物相容性 ,探讨其应用于牙周组织工程的可行性。　方法　胎牛肌腱经脱细胞、冷冻 -干燥方法构建复合胶原三维支架载体 ,取 4～ 6代人牙周膜成纤维细胞 (human periodontal ligament fibroblasts,HPDL Fs) ,接种浓度 5× 10 6 / ml与 t MEBC复合材料共培养 ,于培养第 1、3、5及 10天 ,细胞计数法了解细胞附着及增殖情况 ;培养第 5、10天 HE染色、扫描电镜行形态学观察。　结果　 t MEBC具有良好的多孔网状结构 ,HPDL Fs黏附良好 ,复合培养 1d细胞密度达 0 .5 5 6× 10 4 / ml,随培养时间延长细胞增殖明显 ,培养第 10天细胞密度达 3.94 4× 10 4 / ml;组织学检测显示细胞均匀分布于材料内部 ,形成良好的细胞材料复合体。　结论　 t MEBC具有良好的生物相容性 ,可作为支架材料复合HPDL Fs应用于牙周组织工程研究。     

尿道移行上皮细胞与生物可降解尿道支架体外复合培养的研究

目的：研究体外培养的兔尿道上皮细胞在生物可降解性网状尿道支架上的贴附和生长增殖情况,观察其对尿道上皮细胞形态和功能的影响,利用组织工程技术培养种植细胞的尿道内支架。方法：应用机械分离与酶消化法分离培养兔尿道移行上皮细胞,并在体外行原代培养与扩增后制成细胞悬液接种在网状尿道支架上,形成尿道移行上皮细胞-支架复合物。采用免疫组织化学、荧光染色法鉴定尿道上皮细胞及其活性;采用倒置显微镜、扫描电镜观察尿道上皮细胞在支架表面吸附与生长状态。结果：网状尿道支架具有良好的生物相容性,能使尿道移行上皮细胞增殖,不影响其活性。尿道移行上皮细胞在尿道支架上贴附生长良好,1～2天后完全贴壁,3～7天细胞生长增殖活跃,支架网眼内充满上皮细胞,长期培养仍保持尿道移行上皮细胞特性,扫描电镜可见上皮细胞与网状支架贴附紧密,适度伸展并有基质分泌。结论：网状尿道支架适合尿道移行上皮细胞黏附生长．可作为尿道组织工程的细胞载体,利用组织工程方法可获得适于移植尿道细胞的组织工程化尿道。