蛋白C P275S突变导致遗传性蛋白C缺陷症的分子机制研究

目的研究蛋白C（PC）基因P275S突变导致遗传性PC缺陷症的分子机制。方法构建PC基因野生型和P275S突变型表达质粒,并瞬时转染HEK293T细胞和COS 7细胞进行体外表达。ELISA检测转染细胞上清液和细胞裂解液的PC抗原;实时荧光RT-PCR（real time,RT-PCR）检测转染细胞PC mRNA表达量的改变;细胞免疫荧光染色检测PC在内质网和高尔基体内的分布。结果转染细胞上清液和细胞裂解液中的PC P275S抗原分别为野生型PC抗原的22.6%和78.9%;实时RT-PCR结果显示,与野生型PC相比,PC P275S突变体在mRNA水平没有减少;细胞免疫荧光染色显示,野生型PC蛋白在内质网和高尔基体中均有大量分布,而PC P275S突变蛋白主要位于内质网中。结论分泌障碍和细胞内降解是PC P275S导致PC缺陷症的原因。     

复合杂合蛋白C基因突变致静脉血栓的分子发病机制研究

目的对2个复合杂合的蛋白C(PC)基因突变致静脉血栓的家系进行临床表型、基因型和分子发病机制的研究。方法对血浆蛋白C活性(PC:A)和抗原(PC:Ag)分别用发色底物法和ELISA法进行测定,以凝血酶生成试验检测患者凝血功能的变化。PCR法扩增先证者PC基因的9个外显子及其侧翼序列,PCR产物纯化后直接测序,检测其基因突变。RT-PCR法结合定点突变法构建PC基因野生型和突变型表达质粒(PCwt、PCR178W、PCD255H、PCL-34P、PCT295I),瞬时转染COS-7细胞,检测细胞内、外PC:Ag的含量。利用细胞免疫荧光染色观察内质网和高尔基体中PC蛋白的定位。结果先证者1,28岁青年男性,临床诊断为下肢深静脉血栓和肺栓塞,PC:A21%,PC:Ag18.36%,为I型蛋白C缺陷症,基因分析显示在其PC基因7号和9号外显子分别存在R178W和D255H的复合杂合突变,其中D255H来自其父亲;先证者2,男,16岁,PC:A21%,PC:Ag20.04%,Ⅰ型PC缺陷症,在其PC基因的2号和9号外显子分别存在L-34P和T295I的复合杂合突变,其中L-34P来自其母亲,T295I来自其父亲。凝血酶生成试验显示其父母的抗凝功能减弱,凝血酶调节蛋白(TM)抑制凝血酶生成的能力降低。体外表达研究显示,PCL-34P只有7%分泌至细胞外,细胞内PC:Ag也只有8.72%,说明存在严重的分泌障碍和细胞内降解加速现象;PCR178W只有极少量(8%)从细胞内分泌,而PCD255H和PCT295I分别有57%和34%分泌至细胞外,细胞内PC:Ag含量分别是44.38%、38.05%和61.57%。细胞免疫荧光染色显示,PCT295I突变蛋白在内质网中滞留,在高尔基体中定位减少导致分泌减少。结论复合杂合性PC基因突变(R178W和D255H、L-34P和T295I)是导致此两例先证者1型遗传性PC缺陷症的原因。R178W、D255H、L-34P是国内首次报道的PC基因突变,T295I是国际首次报道的PC基因突变,分泌障碍和细胞内降解是R178W、D255H、L-34P和T295I导致PC缺陷症的分子机制。     

抗凝血酶基因T98I和A404T突变导致抗凝血酶缺陷症的分子机制研究

目的研究抗凝血酶（AT）基因T98I和A404T突变致AT缺陷症的分子机制。方法构建AT野生型和突变体表达质粒（ATwt、ATT98I、ATA404T）并瞬时转染至COS-7细胞或CHO细胞,进行体外表达试验、脉冲-追踪试验和细胞免疫荧光染色;用荧光实时PCR（RT—PCR）检测转染细胞ATmRNA表达量的改变;蛋白降解抑制实验检测突变蛋白在细胞内的降解途径。结果ATT98I未从转染细胞内分泌且在细胞内逐渐降解,ATA404T仅部分从细胞内分泌、大部分未分泌并在细胞内逐渐降解。RT—PCR显示,与野生型ATmRNA相比,突变体ATmRNA不降低。脉冲-追踪试验发现,这两种AT突变体分泌障碍,未在细胞内聚集而是降解。蛋白降解抑制实验显示,突变体ATT98I通过蛋白体酶途径进行细胞内降解。转染细胞荧光染色显示,转染ATT98I质粒的CHO细胞内荧光强度明显减弱、无明显核周聚集,而转染ATA404T质粒的CHO细胞内荧光减弱且弥散分布于胞质、核周有轻度聚集。结论分泌障碍和细胞内降解是AT基因T98I和A404T突变导致AT缺陷症的分子病理机制。     

利拉鲁肽对Kir6.2基因E23K位点突变β细胞胰岛素分泌功能的影响

目的 Kir6.2编码基因多态与糖尿病、胰岛素抵抗相关,本研究旨在探讨高糖环境下,利拉鲁肽对Kir6.2基因E23K位点突变的胰岛β细胞胰岛素分泌功能的影响及机制。方法 以NIT-1细胞为研究对象,构建Kir6.2基因过表达野生型和E23K突变型NIT-1细胞,并用利拉鲁肽在高糖环境下进行24 h干预。采用流式细胞仪检测NIT-1细胞凋亡率、细胞膜电位及钙离子浓度,Western blotting和免疫荧光检测细胞内胰岛素含量,ELISA检测培养液中胰岛素含量,并以此间接研究胰岛素的分泌情况。结果 NIT-1细胞最适高糖培养浓度为60 mmol/L,在此浓度下胰岛素合成量最高,利拉鲁肽体外干预浓度选择10 mmol/L。过表达野生型Kir6.2基因NIT-1细胞的胰岛素分泌高于Kir6.2基因E23K突变型NIT-1细胞。过表达野生型Kir6.2基因NIT-1细胞在高糖环境中细胞膜电位进一步降低,细胞内Ca²⁺含量增加,而Kir6.2基因E23K突变型NIT-1细胞与单纯高糖培养相比无显著改变。利拉鲁肽在高糖环境中可有效减少野生型和突变型NIT-1细胞的凋亡,降低...     

蛋白C p.Ala333Thr突变引起遗传性蛋白C缺陷症的分子机制

目的：探讨蛋白C（PC）p.Ala333Thr突变导致遗传性蛋白C缺陷症（IPCD）的分子机制。方法：使用氨基酸多序列比对工具T-Coffee评估突变氨基酸位点的保守性,使用突变有害性评分工具PolyPhen-2预测突变对PC结构和功能的危害性。利用定点突变试剂盒QuickMutationTM构建PC基因（PROC ）野生型和p.Ala333Thr突变型质粒,并瞬时转染入HEK-293T细胞进行体外表达,RT-qPCR检测突变PC转录24 h后的mRNA水平变化,利用蛋白印迹法（Western blot）和ELISA分别检测突变PC胞内外水平变化,并对细胞内质网、高尔基体PC进行免疫荧光染色,初步探讨p.Ala333Thr突变导致IPCD的分子机制。结果：多序列比对结果显示PC的Ala333位点保守性不高,PolyPhen-2对PROC 的p.Ala333Thr突变评分为0.763。成功转染野生型与p.Ala333Thr突变型PROC 质粒后,突变型PROC 转录水平无明显变化;Western blot结果显示,突变型PROC的PC表达量明显下降;免疫荧光染色结果显示,野生型PC在内质网和高尔基体均有大量分布,而p.Ala333Thr突变型PC主要分布于内质网。结论：PROC p.Ala333Thr突变可能导致了PC的错误折叠和加工障碍,造成胞外PC表达量下降,最终引起了IPCD的发生。     

蛋白C基因复合杂合突变导致的肺栓塞及家系研究

目的了解1例肺栓塞患者及其家系成员发生蛋白C缺陷症的分子发病学机制。方法收集先证者及其家系成员的枸橼酸钠抗凝血,采用发色底物法检测PC活性(PC∶A)、蛋白S活性(FPS∶A)和抗凝血酶活性(AT∶A),采用ELISA方法检测PC抗原(PC∶Ag)水平。采用PCR方法对先证者PC基因所有9个外显子及其侧翼序列进行扩增、测序,发现突变后,对先证者家系成员的PC基因有关外显子片段进行PCR扩增和测序。结果先证者及其父亲、母亲和妹妹均为Ⅱ型PC缺陷症患者。PC基因测序结果显示先证者的PC基因分别出现了位于3号外显子第5540位碱基的G→A的杂合突变和位于第7号外显子第10230位碱基C→T的杂合突变,导致PC E29K和R147W双杂合突变。先证者父亲携带PC E29K杂合突变,而先证者母亲和妹妹均为PCR147W杂合突变的携带者。结论先证者为PC E29K和R147W基因复合杂合突变携带者,且这两种突变分别遗传自其父母。其中,PC E29K错义点突变为目前国际上尚未见报道的新突变,而PC R147W是一种已报道的常见于遗传性易栓症患者的可导致Ⅱ型PC缺乏的错义点突变。     

KATP通道E23K突变对阿霉素诱导的细胞凋亡的影响

目的 研究ATP敏感性钾通道Kir6.2亚基E23K突变对阿霉素诱导的心肌细胞凋亡的影响。方法 （1）在心肌组织中提取总RNA,RT-PCR法获取cDNA,合成特异性引物,用PCR法获得kir6.2、SUR2A的ORF片段,用T4DNA连接酶将上述片段与线性化的pEGFP-C1连接,重组的pEGFP-C1/kir6.2用PCR法进行E23K定点突变,获得真核表达质粒pEGFP C1/kir6.2,pEGFP C1/kir6.2（E23K）及pEGFP C1/SUR2A。（2）重组质粒采用脂质体法瞬时共转染H9C2细胞,使其在H9C2细胞中表达。（3）生理盐水与1mg/L阿霉素（Adriamycin,ADR）分别处理转染后细胞,分为4组：A组为野生型重组质粒+生理盐水处理组（WT+NS）;B组为含E23K突变重组质粒+生理盐水处理组（E23K+NS）;C组为野生型重组质粒+阿霉素损伤组（WT+ADR）;D组为含E23K突变重组质粒+阿霉素损伤组（E23K+ADR）。（4）采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数（AI）。（5） Western blot法测定caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达。AlphaEase FC软件取值读取各样品条带灰度值。结果 （1） TUNEL结果示,应用ADR后凋亡比例升高,与WT+ADR组相比,E23K+ADR组凋亡比例更高（P<0.05）。（2）阿霉素处理后,所有组促凋亡相关蛋白（caspase-3、Bax）表达均增高,抗凋亡蛋白（Bcl-2）表达降低,且E23K+ADR组caspase-3与Bax蛋白表达均大于WT+ADR组,Bcl-2蛋白表达低于WT+ADR组（P<0.05）。结论 K_ATP通道kir6.2亚基E23K突变加重阿霉素诱导的细胞凋亡。     

蛋白C基因复合杂合突变导致的肺栓塞及家系研究

摘要：目的了解1例肺栓塞患者及其家系成员发生蛋白C缺陷症的分子发病学机制。方法收集先证者及其家系成员的枸橼
酸钠抗凝血,采用发色底物法检测PC活性（PC∶A）、蛋白S活性（FPS∶A）和抗凝血酶活性（AT∶A）,采用ELISA方法检测PC抗原
（PC∶Ag）水平。采用PCR方法对先证者PC基因所有9个外显子及其侧翼序列进行扩增、测序,发现突变后,对先证者家系成员
的PC基因有关外显子片段进行PCR扩增和测序。结果先证者及其父亲、母亲和妹妹均为Ⅱ型PC缺陷症患者。PC基因测序
结果显示先证者的PC基因分别出现了位于3号外显子第5540位碱基的G→A的杂合突变和位于第7号外显子第10230位碱基
C→T的杂合突变,导致PC E29K和R147W双杂合突变。先证者父亲携带PC E29K杂合突变,而先证者母亲和妹妹均为PC
R147W杂合突变的携带者。结论先证者为PC E29K和R147W基因复合杂合突变携带者,且这两种突变分别遗传自其父母。
其中,PC E29K错义点突变为目前国际上尚未见报道的新突变,而PC R147W是一种已报道的常见于遗传性易栓症患者的可导
致Ⅱ型PC缺乏的错义点突变。
     

Annexin A11 G38R及D40G突变通过降低蛋白稳定性引起肌萎缩侧索硬化症的发生

目的：探讨Annexin A11(ANXA11) G38R及D40G突变引起肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)的发病机制。方法：构建编码ANXA11 G38R,ANXA11 D40G突变蛋白及ANXA11野生型蛋白真核表达载体pANXA11- G38R-Flag,pANXA11-D40G-Flag和pANXA11-Flag;将其转染至HEK293细胞后,用放线菌酮分别处理0,2,4,8 h;收 集蛋白采用Western印迹检测3种蛋白的含量变化情况,比较目标蛋白的半衰期;构建稳定表达ANXA11 G38R,ANXA11 D40G突变蛋白及ANXA11野生型蛋白的NSC-34细胞系,用Western印迹检测上述蛋白在NP-40裂解液中的溶解情况。结 果：ANXA11 G38R,ANXA11 D40G突变蛋白的半衰期较野生型蛋白缩短(P<0.05),ANXA11 G38R蛋白和ANXA11 D40G 蛋白半衰期无明显差异(P>0.05);ANXA11 G38R,ANXA11 D40G突变蛋白与ANXA11野生型蛋白在NP-40裂解液中均 未发现不可溶成分。结论：G38R和D40G突变降低了ANXA11蛋白的稳定性;G38R和D40G突变不影响ANXA11蛋白在 NP-40裂解液中的可溶性。     

CD2AP突变对肾小球足细胞骨架蛋白F-actin分布的影响

目的 构建突变型CD2相关蛋白（CD2AP）荧光表达载体并转染肾小球足细胞,观察细胞内骨架蛋白F-actin分布的变化.方法 定点诱变真核表达质粒pcDNA6-V5-CD2AP致CD2AP第2外显子160G＞A杂合突变,测序鉴定.利用野生型和突变型质粒和pEGFP-C1荧光表达载体,分别构建野生型和突变型重组质粒pEGFP-C1-CD2AP荧光表达载体并转染小鼠肾小球足细胞,荧光显微镜观察处于不同细胞周期的足细胞内F-actin分布情况.结果 测序结果显示,pcDNA6-V5-CD2AP真核表达载体CD2AP的2号外显子第160位碱基G诱变为A,而其他碱基未发生改变.在细胞分裂间期,未转染足细胞内F-actin平行排列成纤维束;野生型重组质粒转染足细胞内F-actin在细胞核周围呈点、块状浓聚;而突变型重组质粒转染足细胞内F-actin主要在细胞膜上勾出轮廓.在细胞分裂中期,野生型重组质粒转染足细胞内F-acin纤维丝呈粗纤维状,环细胞浓聚;突变型重组质粒转染足细胞则仅见胞质内F-acin纤维丝增多,部分区域浓聚.结论 成功构建野生型和突变型重组CD2AP荧光表达载体.CD2AP基因160G＞A杂合突变使肾小球足细胞分裂间期和分裂中期的F-actin纤维骨架发生改变.     

带信号肽人胰岛素原突变体的构建及在COS-7细胞中的表达

目的:构建带信号肽人胰岛素原突变体的真核表达载体并在COS-7细胞表达出成熟的人胰岛素.方法:采用PCR体外定点突变技术(PCR-SDM),将普通细胞内furin蛋白酶的识别和切割位点Arg-X-Lys-Arg-样序列,引入人胰岛素原C肽两端,同时加上信号肽、Kozak序列和限制性内切酶的酶切位点并克隆至载体pcDNA3.1( )中,构建成人胰岛素原突变体的真核表达载体,经测序验证后转染COS-7细胞,RT-PCR、Western印迹、放射免疫法检测其在COS-7细胞中的表达.结果:DNA测序结果表明在预期位点突变符合要求,经RT-PCR、Western印迹、放射免疫鉴定,构建的人胰岛素原突变体的真核表达载体转染的COS-7细胞可表达、分泌人成熟胰岛素.结论:构建了人胰岛素原突变体的真核表达载体,并成功地在COS-7细胞中获得人胰岛素的分泌表达.     

真核表达质粒pDisplay-hGITRaa1-165构建及其在COS-7细胞中的表达

目的:构建含有人GITR胞外段的真核表达质粒pDisplay-hGITRaa1-165,并检测其在真核细胞内的表达。方法:将带有信号肽的GITR基因片段克隆至真核表达载体pDisplay,经酶切鉴定及测序分析,脂质体介导法转染COS-7细胞,通过蛋白质印迹法检测其在COS-7细胞内的表达水平。结果:所构建的真核表达质粒pDisplay-hGI-TRaa1-165转染COS-7细胞后,在其培养上清中检测到目的蛋白的表达。结论:成功表达pDisplay-hGITRaa1-165蛋白,为GITR的生物学功能研究奠定了基础。     

稳定表达绿色荧光蛋白的COS7细胞系的筛选和鉴定

目的 构建稳定表达绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的COS-7细胞系,为相关实验对照提供方便. 方法 常规方法培养COS-7细胞,将含pEGFP-N3基因的质粒转染COS-7细胞,G418抗性筛选,并用荧光显微镜进行跟踪检测,挑选耐药单细胞克隆并扩大培养至稳定细胞株. 结果 G418筛选的最适浓度为500 μg/mL.筛选到的COS7 -GFP克隆荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光,细胞的生物学性状保持稳定,通过Western blot能检测到GFP蛋白. 结论 成功筛选并建立了稳定表达的COS7 -GFP细胞系.     

野生型MLK3真核表达载体的构建及其表达

目的构建野生型MLK3真核表达质粒并转染至COS-7细胞中表达。方法以大鼠海马总RNA为模板,通过RT-PCR分段扩增MLK3的序列,采用酶切、链接的方法先将目的基因克隆至pGEM-T,筛选正确的质粒后,再亚克隆至pcDNA3.1（＋）。以脂质体转染法将构建好的重组质粒转染至COS-7细胞,通过免疫印迹鉴定重组质粒的表达。结果限制性内切酶酶切和测序结果表明,扩增出的野生型MLK3的序列正确。免疫印迹显示,转染的重组质粒在相对分子质量92×103处有相应条带出现。结论成功构建了MLK3的真核表达质粒,重组质粒在COS-7细胞中高效表达。     

鼠内皮细胞抑制素的克隆及在COS-7细胞中的分泌表达

目的从小鼠肝脏中克隆出ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ并在ＣＯＳ－７细胞中分泌表达,为其在肿瘤抗血管基因治疗中的应用打下基础。方法用ＲＴ－ＰＣＲ从鼠肝脏扩增出内皮细胞抑制素ｃＤＮＡ并克隆入测序载体ＰＵＣ－Ｔ测序证实后,装入分泌表达载体ｐＳＥＣ－ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ,用ＤＥＡＥ－葡聚糖转染ＣＯＳ－７细胞,从ｍＲＮＡ水平及蛋白水平检测内皮细胞抑制素的表达。结果测序结果显示所克隆的小鼠ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ ｃＤＮＡ     

Eukaryotic Expression of Human Arresten Gene and Its Effect on the Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells

Arresten,human noncollagenous domain 1 oftheα1 chain of type Ⅳcollagen,is derived fromthe carboxy terminal of type Ⅳcollagen[1].It wasidentified as a powerful inhibitor of angiogenesisrecently .In earlier studies , human arresten wassuccessfully amplified from placenta tissue , andmolecular cloning and DNA sequencing verifiedthat the coding sequence obtained was correct[2].Prokaryotic expression vector of arresten gene hasbeen constructed[3]. Excessive proliferation andmigration to endome…     

转染人血纤溶酶原Kringle 5基因对人胰腺癌PC3细胞的影响

目的　将人血纤溶酶原Kringle 5基因导入人胰腺癌PC3细胞 ,观察其对人胰腺癌PC3细胞系的基因治疗作用。方法　将外源性Kringle 5通过脂质体转染法导入人胰腺癌PC3细胞 ,筛选阳性克隆 ,同时设空质粒组及PC3细胞为对照。采用RT PCR、免疫组织化学、MTT、电镜、流式细胞术等方法 ,鉴定及检测转染前后细胞超微结构、细胞周期及Kringle 5蛋白表达情况 ,并用血管内皮细胞增殖实验及裸鼠接种检测目的胰腺癌细胞株表达的Kringle 5蛋白抑制血管内皮细胞生长的活性及裸鼠移植瘤生长情况。结果　人血纤溶酶原Kringle 5基因及蛋白水平在胰腺癌PC3细胞系均可以稳定表达 ,能抑制ECV30 4血管内皮细胞生长及具有抑制裸鼠移植瘤生长的作用。结论　成功转染人Kringle 5基因的人胰腺癌PC3细胞可稳定表达Kringle 5蛋白 ,且具有抗血管内皮细胞增殖活性的良好作用 ,为进一步进行体内抗血管生成基因治疗奠定了基础。     

血管活性肠肽真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建一种具有生物学活性的血管活性肠肽(VIP)的真核表达质粒.方法:利用RT-PCR从小鼠胸腺淋巴细胞中克隆有信号肽序列的VIP cDNA,插入真核表达载体pcDNA3.1,构建含VIP的重组质粒pcDNA3.1-VIP,转染COS-7细胞,用ELISA和Western blot鉴定表达的蛋白,细胞因子释放抑制法测定生物学活性.结果:经酶切和基因测序证实,克隆的基因片段为带有信号肽序列的VIP基因;经转染的COS-7细胞表达VIP蛋白,并能有效地抑制巨噬细胞的TNF-α释放.结论:成功构建了能够表达具有生物学活性的真核表达质粒pcDNA3.1-VIP.