SD大鼠Müller细胞的原代培养

目的:原代分离培养SD大鼠Müller细胞,在实验室建立Muller细胞株.方法:采用改良的酶消化法培养新生大鼠的视网膜Müller细胞,免疫组化法进行鉴定.结果:原代培养的Muller细胞胞体狭长,胞浆丰富,经过3～5次传代后逐渐变得胞体宽大,出现微丝和突起.免疫组化显示,95%以上的细胞谷氨酰胺合成酶染色阳性.结论:改良的酶消化法是培养视网膜MUller细胞的简单有效的方法.     

SD大鼠Müller细胞的原代培养

目的:原代分离培养SD大鼠Mller细胞,在实验室建立Mller细胞株。方法:采用改良的酶消化法培养新生大鼠的视网膜Mller细胞,免疫组化法进行鉴定。结果:原代培养的Mller细胞胞体狭长,胞浆丰富,经过3~5次传代后逐渐变得胞体宽大,出现微丝和突起。免疫组化显示,95%以上的细胞谷氨酰胺合成酶染色阳性。结论:改良的酶消化法是培养视网膜Mller细胞的简单有效的方法。     

豚鼠近视眼视网膜Müller细胞的原代培养

目的研究豚鼠近视眼视网膜Müller细胞原代培养的方法。方法用半透明眼罩遮盖法建立豚鼠的近视眼模型。采用酶消化法培养豚鼠近视眼视网膜Müller细胞,用倒置相差显微镜观察Müller细胞的生长状况,以GFAP、Vimentin免疫组化染色进行细胞鉴定。结果半透明眼罩遮盖豚鼠右眼2周后,遮盖眼眼轴延长,近视形成。原代培养的视网膜Müller细胞贴壁生长,胞体较大、扁平,GFAP、Vimentin免疫组化染色呈阳性。结论酶消化法是培养豚鼠近视眼视网膜Müller细胞的一种有效方法。     

人视网膜Mūller细胞培养及超微结构免疫组织化学观察

用酶消化法培养人视网腆Mūller细胞井传代，用电镜及免疫组织化学(免疫组化)技术对细胞进行鉴定。结果显示Mūller细胞贴壁生长，原代细胞胞体狭长，胞质丰富，细胞内含丰富的8~10nm直径的微丝及细胞连接结构。免疫组化显示细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白、波形蛋白阳性，证实为Mūller细胞。提示酶消化法培养是一种可靠的、大量获取人视网膜Mūller细胞的方法． （中华眼底病杂志，1995，11：178-180）     

新生大鼠视网膜Müller细胞原代培养纯化及鉴定

目的 探讨新生SD大鼠视网膜Müller 细胞原代培养的方法.方法 用酶消化法分离制备视网膜细胞悬液,采用分次贴壁和反复吹打法分离并纯化Müller 细胞,进行形态学观察及免疫组织化学染色.结果 光镜下培养细胞体较大,呈扁平不规则形状;免疫组织化学染色显示95%以上的原代细胞神经胶质纤维酸性蛋白染色阳性;电镜下细胞内可见丰富的线粒体、高尔基体和大量直径8～10 nm的微丝结构.结论 分次贴壁和反复吹打法是一种简单可靠的视网膜Müller 细胞原代培养的方法.     

改良的人视网膜Müller细胞的原代培养方法与鉴定

背景 视网膜Müller细胞是视网膜重要的胶质细胞,也是视网膜干细胞的来源之一,研究Müller细胞的生物学行为对研究视网膜的各种生理病理过程和视网膜干细胞治疗研究具有重要意义,而建立稳定的视网膜Müller细胞培养体系是相关研究的基础. 目的 优化分离培养和纯化人视网膜Müller细胞的方法,为相关的实验研究提供良好优质的Müller细胞来源. 方法 分离人供体眼视网膜组织,然后将剪碎的视网膜组织置入质量分数0.25％胰蛋白酶+100 U透明质酸酶混合溶液中进行消化,添加含体积分数10％胎牛血清的DMEM/F12培养液1～2 ml终止消化,然后加入含体积分数20％胎牛血清的RPMI1640培养液培养72 h,行半量换液,再以含10％胎牛血清的培养液进行传代.光学显微镜下根据细胞的形态特征进行细胞鉴定,并分别采用免疫荧光技术和免疫组织化学法检测胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和Müller细胞特异性标志物谷氨酰胺合成酶(GS)的表达,对培养的细胞进行鉴定.结果 应用0.25％胰蛋白酶+100 U(商品单位)透明质酸酶的混合酶消化法可成功获取人视网膜Müller细胞,原代培养后24 h细胞贴壁,培养后9～1Od细胞融合.培养的细胞胞体呈长圆形,细胞质丰富,部分细胞体两端锥状长突起,末端膨隆,细胞核大.传代后的细胞胞体大,呈扁平多角形,符合Müller细胞的形态.细胞免疫组织化学和免疫荧光技术检测显示95％以上的细胞中GFAP呈阳性表达,90％以上的细胞中GS呈强阳性表达. 结论 应用透明质酸酶和胰蛋白酶混合液消化法可以成功分离人视网膜Müller细胞,分别用含20％胎牛血清和含10％胎牛血清的RPMI1640培养液培养和传代的人视网膜Müller细胞产量高且纯度好.     

豚鼠近视眼视网膜Müller细胞的原代培养

目的 研究豚鼠近视眼视网膜Muller细胞原代培养的方法.方法 用半透明眼罩遮盖法建立豚鼠的近视眼模型.采用酶消化法培养豚鼠近视眼视网膜Müller细胞.用倒置相差显微镜观察Müller细胞的生长状况,以GFAP、Vimentin免疫组化染色进行细胞鉴定.结果 半透明眼罩遮盖豚鼠右眼2周后,遮盖眼眼轴延长,近视形成.原代培养的视网膜Müller细胞贴壁生长,胞体较大、扁平,GFAP、Vimentin免疫组化染色呈阳性.结论 酶消化法是培养豚鼠近视眼视网膜Müller细胞的一种有效方法.     

豚鼠近视眼视网膜Müller细胞中TGFβ2、VIP、DA的表达

目的 研究转化生长因子β2(TGFβ2)、血管活性肠肽(VIP)和多巴胺(DA)在原代培养的豚鼠近视眼视网膜Müller细胞中的变化.方法 眼罩遮盖诱导豚鼠近视眼,酶消化法原代培养其视网膜Müller细胞,GFAP、Vimentin免疫组织化学染色进行细胞鉴定.Westren blotting检测TGFβ2、VIP、酪氨酸羟化酶(TH)蛋白在正常对照眼、自身对照眼和近视眼视网膜Müller细胞中的表达情况.高效液相色谱-电化学法测定视网膜Müller细胞分泌DA的质量浓度变化.结果 眼罩遮盖14d后,豚鼠遮盖眼眼轴延长,近视形成.酶消化法成功培养出豚鼠视网膜Müller细胞,95%以上的培养细胞阳性表达GFAP和Vimentin.正常对照眼、自身对照眼和遮盖眼视网膜Müller细胞均阳性表达TGFβ2、VIP、TH蛋白,遮盖眼表达TGFβ2和VIP蛋白上调(P＜0.05)、TH蛋白下调(P＜0.05).与正常对照眼、自身对照眼比较,遮盖眼视网膜Müller细分泌DA减少.结论 Müller细胞是视网膜近视信号因子TGFβ2、VIP和DA的一个重要来源.在近视发生过程中Müller细胞可能通过合成、分泌这些近视信号因子,参与近视发生的调控.     

豚鼠近视眼视网膜Müller细胞的原代培养

目的研究豚鼠近视眼视网膜Müller细胞原代培养的方法。方法用半透明眼罩遮盖法建立豚鼠的近视眼模型。采用酶消化法培养豚鼠近视眼视网膜Müller细胞,用倒置相差显微镜观察Müller细胞的生长状况,以GFAP、Vimentin免疫组化染色进行细胞鉴定。结果半透明眼罩遮盖豚鼠右眼2周后,遮盖眼眼轴延长,近视形成。原代培养的视网膜Müller细胞贴壁生长,胞体较大、扁平,GFAP、Vimentin免疫组化染色呈阳性。结论酶消化法是培养豚鼠近视眼视网膜Müller细胞的一种有效方法。     

新生大鼠视网膜Müller细胞原代培养方法的改良

背景 目前,视网膜Müller细胞的干细胞特性日益受到关注,优化Müller细胞的培养方法对视网膜干细胞治疗的进一步研究具有重要意义. 目的 对视网膜Müller细胞的原代培养方法加以改良,建立一种简单、有效的实验室分离纯化Müller细胞的方法.方法 取新生SPF级SD大鼠眼球,培养基浸泡后室温条件下避光过夜,显微镜下分离视网膜,直接吹打成微小组织悬液后接种于培养瓶中,8～10d后行第1次换液,之后2～3d换液1次,至细胞完全融合后进行传代.细胞形态一致后于光学显微镜下观察细胞的形态特征,免疫荧光法检测Müller细胞标志物谷氨酰胺合成酶(GS)和波形蛋白(Vimentin)的表达,进行细胞鉴定;采用流式细胞术对所得细胞进行纯度检测. 结果 原代培养的Müller细胞胞体狭长,细胞质丰富.传至3代的细胞95％以上对GS和Vimentin反应阳性,阳性染色主要位于细胞质和细胞核.Vimentin阳性染色主要位于细胞质.流式细胞仪检测显示传3代后99.7％的细胞GS表达阳性. 结论 采用Müller细胞改良法-流式细胞术对所得细胞进行纯度检测,简单可行,收获的细胞数量多、纯度高.     

Transwell小室共培养条件下RPE促进Müiler细胞的增殖和迁移

目的：观察在体外共培养系统中RPE对Müiler细胞的影响。方法：Transwell小室共培养RPE和Müiler细胞，MTT法、细胞计数法，测定Müiler增殖和迁移的情况。结果：Müiler细胞增殖的实验：Müiler细胞的增殖。除了3h与6h，24h与48h之外，在其他各时间点之间差别有统计学意义。Müiler细胞与RPE共培养组和Müiler细胞单独培养组两组之间差别有统计学意义。Müiler细胞迁移的实验；Müiler细胞迁移，除了3h和6h之外，在其他各时间点之间差别有统计学意义。Müiler细胞与RPE共培养组和Müiler细胞单独培养组两组之间差别有统计学意义。在析因设计实验中，与RPE共培养、缺氧条件，这两个因素都可以分别作为独立的因素促进Müiler细胞的增殖和迁移，而两者不存在协同作用。结论：正常和缺氧条件下RPE促进Müiler的增殖、迁移，随共培养时间的延长RPE促进Müiler增殖、迁移的作用加强。缺氧条件下RPE与Müiler细胞间的相互作用在视网膜增殖性疾病中起到了重要的作用。     

大鼠视网膜Mller细胞受刺激后具有神经干细胞的特性

目的:研究并验证成年哺乳动物视网膜中Mller细胞经刺激后可以产生神经干细胞特性。方法:对6周龄VC大鼠右眼玻璃体腔内注射神经毒素混合液(含NMDA,kainate,FGF2和insulin)刺激Mller细胞,左眼玻璃体内注射PBS作为对照眼。1wk后取眼并分离Mller细胞体外原代纯化培养7d。流式细胞技术鉴定Mller细胞纯度,通过细胞免疫荧光组织化学和流式细胞技术鉴定神经干细胞标志物nestin在Mller细胞上的表达。结果:流式细胞分析结果显示,本实验分离培养的原代Mller细胞纯度可达96%以上;细胞免疫荧光组织化学显示激活后Mller细胞能表达nestin,流式细胞技术证明,激活后培养的细胞中表达nestin的细胞可达总细胞量的53.5%。结论:成年大鼠视网膜Mller细胞经神经毒素在体刺激后可以产生神经干细胞特性。     

Modulation of TGFβ2 and dopamine by PKC in retinal Müller cells of guinea pig myopic eye

AIM: To investigate the effect of protein kinase C (PKC) on transforming growth factor-β2 (TGFβ2) and dopamine in retinal Müller cells of guinea pig myopic eye. METHODS: Myopia was induced by translucent goggles in guinea pig, whose retinal Müller cells were cultured using the enzyme-digesting method. Retinal Müller cells were divided into 5 groups: normal control, myopia, myopia plus GF109203X, myopia plus PMA, myopia plus DMSO. PKC activities were detected by the non-radioactive methods. TGFβ2 and tyrosine hydroxylase (TH) proteins were analyzed by Western Blotting in retinal Müller cells. Dopamine was determined by the high-performance liquid chromatography- electrochemical detection in suspensions. RESULTS: After 14 days deprived, the occluded eyes became myopic with ocular axle elongating. Müller cells of guinea pigs were obtained using enzyme digestion. Compared with normal control group, the increase in PKC activity and the up-regulation in TGFβ2 expression were found in retinal Müller cells of myopic eyes, with the decrease of TH and dopamine content (P <0.05). After PKC activated by PMA, TGFβ2 and TH content were up-regulated with the increase of dopamine content (P <0.05). While the PKC activities was inhibited by GF109203X, proteins of TGFβ2 and TH were down-regulated in the myopic eyes, with the decrease of dopamine content (P <0.05). CONCLUSION: TGFβ2 and dopamine are modulated by PKC in Müller cells of the myopic eyes in guinea pig.     

谷氨酸对视网膜Muller细胞超微结构和谷氨酰胺合成酶表达的影响

目的探讨谷氨酸对大鼠视网膜Muller细胞超微结构和谷氨酰胺合成酶（GS）表达的影响。方法取5～7d清洁级Wistar乳鼠视网膜,在含质量分数10%新生牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中传代培养大鼠视网膜Muller细胞。第3代Muller细胞培养基中加入终浓度分别为10、20、50、100、200μmol/L的谷氨酸作用10min。正常对照组Muller细胞培养基中未加入谷氨酸。通过免疫细胞化学法检测GS的表达鉴定视网膜Muller细胞。透射电镜观察各组Muller细胞超微结构的改变。采用Westernblot法半定量检测GS的表达。结果培养的Muller细胞中,GS阳性细胞达95%以上。透射电镜下正常对照组Muller细胞超微结构正常,谷氨酸10、20、50μmol/L组Mller细胞超微结构无明显改变。100μmol/L谷氨酸组可见Muller细胞线粒体肿胀和染色质的凝集、边聚。在200μmol/L谷氨酸组可见Muller细胞空泡样变性和凋亡小体。Westernblot结果显示,10、20、50μmol/L组GS在Muller细胞中表达较正常对照组升高,差异均有统计学意义（q=29.32、q=75.54、q=48.36、q=130.20,P〈0.01）,50μmol/L谷氨酸组GS的表达达高峰,100μmol/L谷氨酸组表达开始下降,200μmol/L谷氨酸组的表达低于正常对照组（q=46.67,P〈0.01）。结论谷氨酸浓度影响视网膜Muller细胞中GS的表达,谷氨酸浓度超过50μmol/L可引起视网膜Muller细胞超微结构的改变。     

表皮生长因子对人眼Müller细胞增生迁移的影响及其作用机制

背景研究证实表皮生长因子（EGF）可促进鼠视网膜Müller细胞的增生和迁移,但EGF能否促进人眼Müller细胞的增生迁移尚未见报道。目的探讨人眼Müller细胞能否自身表达和分泌EGF及EGF对Müller细胞增生迁移的影响及其作用机制。方法同一代人永生株Müller细胞系MIO—M1细胞用高糖DMEM进行培养,利用MTT比色法观察不同质量浓度EGF作用24、48、72h,不同浓度CoCl2作用12h和24h,加入导致Müller细胞半数致死量的CoCl,浓度前2h加入不同质量浓度EGF的Müller细胞增生情况;Transwell小室观察正常及CoCl2缺氧条件下用不同质量浓度EGF作用24、48、72h后Müller细胞的迁移情况;采用ELISA法观察Müller细胞表达和分泌EGF的情况;通过Westernblot法检测体外不同条件培养下EGF对ERK1/2及Akt信号转导通路的作用。结果正常培养条件下,不同质量浓度的EGF作用后Mfiller细胞的吸光度（A570）值的总体比较差异有统计学意义（F=123．765,P=0．000）,100mg／LEGF促Müller细胞增生作用最强,为对照组的1．6倍,10mg／LEGF促Müller细胞迁移的作用最强,为对照组的4．5倍。各EGF组Müller细胞的A570,值均明显高于对照组,差异有统计学意义（P〈O．01）。缺氧条件下培养,Müller细胞半数致死量的CoCl2浓度为600nmol／L,提前2h加入10～100阻g／LEGF后,EGF对抗缺氧所致Muller细胞的损伤作用最明显。700nmol／LCoCl2致Müller细胞损伤80％时其自身低分泌7．8ng／LEGF。10～100mg／LEGF作用Müller细胞促增生迁移作用信号最明显,600nmol／ LCoCl2作用Müller细胞24h后ERKl／2及Akt信号强度减弱,提前2h加入外源性EGF后,ERK1／2及Akt两条信号通路最明显。结论EGF能以剂量依赖的方式促进体外培养的Müller细胞增生及迁移。正常培养条件下的Müller细胞自身不表达,缺氧条件下Müller细胞自身可少量分泌EGF。EGF可能通过ERK1／2及Akt信号转导通路介导Müller细胞的增生和迁移,并对CoCl2损伤的Müller细胞发挥保护作用。     

利用流式细胞仪分选纯化大鼠视网膜Müller细胞

背景 在研究视网膜Müller细胞的病理生理过程中,建立Müller细胞的培养模型、获得高纯度的Müller细胞是基本步骤.目前使用的纯化培养Muller细胞的技术所获得的细胞纯度不够理想.目的 建立一种获得高纯度原代培养视网膜Müller细胞的技术方法.方法取5只新生SD大鼠的视网膜经质量分数0.01%胰蛋白酶消化制备细胞悬液,然后在含质量分数10%胎牛血清的DMEM培养基中进行原代培养,细胞扩增至大于6×105个时收集细胞,无菌条件下用流式细胞仪进行分选,将细胞悬液中体积最大、数量最多的一种细胞分选出来继续培养并传代,应用透射电镜和光学显微镜观察细胞的形态学变化,应用免疫组织化学技术鉴定培养和传代的细胞类型及纯度.结果 原代培养视网膜Müller细胞成功,其中混杂有其他类型的小细胞,生长缓慢,培养3周生长速度加快.用分次贴壁法清除成纤维细胞,经传代去除部分神经元,经流式细胞仪纯化后可获得细胞成分单一、体积最大的一批细胞.透射电镜下细胞内可见丰富的线粒体、高尔基体和大量直径8～10 nm的微丝.培养细胞的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组织化学染色细胞阳性率为100%.结论 利用流式细胞仪对培养的Müller细胞进行分选是可行的,能够获得高纯度的视网膜Müller细胞.

Abstract：

Background Establising the culture model of Müller cells for obtaining the highly putified target cells is essential for the study about the physiology and pathology of retinal Müller cells. The exsiting purifing method for culturing Müller cells is dissatisfactory. Objective This study was to establish a method to obtain high purifing Müller cells. Methods The retina from 5 clean newborn SD rats were isolated and digested by 0. 01% trypsin and cultured in DMEM containing 10% fetal bovine serum. The cellular suspension was then prepared,and the target cells were screened using flow cytometry based on the size and the quantity of cells. Cultured and passaged cells were identified by transmission electron microscope and light microscope. Immunocytochemistry was used to detecte the expression of GFAP in cultured cells for the determination of type and purity of the cells. Results The cells showed the similar shape to retinal Müller cells after primarily culture with the large volume, and some small other types of cells could been seen. The growth of cells was quickly 3 weeks later. The fibroblasts were removed using sticking-wall by steps,and neurons were eliminated following passage. Aboundent of cellular organs were seen under the transmission electron microscope. The positive response rate of the cells for CFAP was 100%. Conclution Flow cytometry offer a rapid and feasible approach for purifying Muller cell and it builds the foundation for further study about Müller cells.     

牛磺酸对高糖刺激大鼠视网膜Müller细胞GLAST和GS表达的影响

目的:通过检测牛磺酸对高糖刺激大鼠视网膜Müller细胞谷氨酸转运蛋白(glutamate-aspartate transporters,GLAST)和谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)表达的影响,探讨牛磺酸保护糖尿病引起视网膜损伤的机制。方法:高糖培养大鼠视网膜Müller细胞,分正常对照组(NC)、高糖组(high glucose,HG,25mmol/L)、高糖+0.1mmol/L牛磺酸(taurine,T)干预组(HG+0.1T)、高糖+1mmol/L牛磺酸干预组(HG+1T)、高糖+10mmol/L牛磺酸干预组(HG+10T)。用免疫荧光化学法和Western-blotting检测大鼠视网膜Müller细胞中GLAST和GS的表达。结果:高糖培养后,大鼠视网膜Müller细胞中GLAST和GS的表达明显减少(P<0.05),与高糖组相比,1mmol/L和10mmol/L牛磺酸干预可明显增加GLAST和GS的表达(P<0.05)。结论:牛磺酸增加Müller细胞中GLAST和GS的表达抑制糖尿病引起的视网膜Müller细胞功能改变。     

Transwell小室共培养条件下RPE促进Mller细胞的增殖和迁移(英文)

目的:观察在体外共培养系统中RPE对Mller细胞的影响。方法:Transwell小室共培养RPE和Mller细胞,MTT法、细胞计数法,测定Mller增殖和迁移的情况。结果:Mller细胞增殖的实验:Mller细胞的增殖,除了3h与6h,24h与48h之外,在其他各时间点之间差别有统计学意义。Mller细胞与RPE共培养组和Mller细胞单独培养组两组之间差别有统计学意义。Mller细胞迁移的实验:Mller细胞迁移,除了3h和6h之外,在其他各时间点之间差别有统计学意义。Mller细胞与RPE共培养组和Mller细胞单独培养组两组之间差别有统计学意义。在析因设计实验中,与RPE共培养、缺氧条件,这两个因素都可以分别作为独立的因素促进Mller细胞的增殖和迁移,而两者不存在协同作用。结论:正常和缺氧条件下RPE促进Mller的增殖、迁移,随共培养时间的延长RPE促进Mller增殖、迁移的作用加强。缺氧条件下RPE与Mller细胞间的相互作用在视网膜增殖性疾病中起到了重要的作用。