含人FcγRⅡB基因慢病毒的制备及其在HT-1080细胞中的表达

目的构建FcγRⅡB慢病毒诱导表达载体,并鉴定其在细胞中的表达。方法以人mRNA为模板逆转录获得FcγRⅡB基因片段,并将其克隆入慢病毒表达质粒TRE,构建TRE-FcγRⅡB慢病毒表达重组质粒。将慢病毒表达重组质粒TRE-FcγRⅡB、慢病毒可诱导质粒Tet分别与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞,分别包装表达病毒和可诱导病毒,分别测定表达病毒和可诱导病毒感染滴度。表达病毒和可诱导病毒共感染HT-1080细胞,经梯度浓度强力霉素(Dox)诱导,实时定量PCR检测FcγRⅡB mRNA表达,免疫荧光染色检测HT-1080细胞FcγRⅡB表达,Western blot法检测FcγRⅡB蛋白表达。结果重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定,测序结果显示插入片段碱基序列与GenBank提供FcγRⅡB基因序列同源性100%。表达病毒滴度达106TU/mL,可诱导病毒滴度达105TU/mL,感染性良好。HT-1080细胞被病毒感染后经Dox诱导表达FcγRⅡB,免疫荧光染色结果显示FcγRⅡB能够在HT-1080细胞中表达;实时荧光定量PCR和Western blot法结果显示FcγRⅡB表达水平与诱导剂浓度正相关。结论成功制备了FcγRⅡB慢病毒,感染HT-1080细胞后可实现FcγRⅡB的诱导表达。     

小鼠IL-10重组慢病毒载体的构建和病毒包装

目的:构建小鼠IL-10重组慢病毒表达载体并进行包装,为进一步研究IL-10基因修饰树突细胞在哮喘免疫耐受中的作用提供实验基础。方法:小鼠IL-10基因片段经PCR扩增后,与酶切线性化的慢病毒载体进行定向连接,获得PGC-LV-IL-10重组慢病毒并转化细菌感受态细胞。克隆菌落行PCR鉴定,对阳性的重组质粒进行测序并转入293T细胞,荧光显微镜下观察GFP表达并行Western blot鉴定。将重组质粒与慢病毒包装系统一同转染293T细胞进行病毒包装,Real-time定量PCR法检测病毒滴度。结果:DNA测序结果及Western blot鉴定证实成功构建小鼠IL-10重组慢病毒载体,对其进行包装后测定慢病毒滴度为2×108TU/ml。结论:成功构建并包装小鼠IL-10重组慢病毒表达载体。     

大鼠微小RNA miR-16的克隆及其慢病毒表达载体的构建

目的 克隆微小RNA rno-miR-16,构建其慢病毒表达载体pLV-miR-16并包装成慢病毒颗粒,为进一步研究miR-16的功能奠定了实验基础.方法 从大鼠细胞基因组中用PCR 的方法扩增miR-16 的前体,构建了miR-16的重组表达载体pLV-miR-16,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物(pPACK-GAG、pPACK-REV和pVSV)共转染包装细胞293TN细胞,包装产生慢病毒,以293TN细胞绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达水平测定病毒滴度.结果 经PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,成功构建携带大鼠miR-16基因重组慢病毒载体.倒置荧光显微镜下观察可见包装细胞293TN呈绿色荧光,并测得108＞ifu/ml.结论 成功构建大鼠慢病毒载体pLV-miR-16,为深入研究rno-miR-16的生物学功能奠定了基础.     

粒-巨噬细胞集落刺激因子与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体构建

目的：构建粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)与绿色荧光蛋白（GFP）融合基因慢病毒载体。 方法： 采用RT-PCR方法获得GM-CSF全外显子片段, 使之克隆到带GFP慢病毒表达载体质粒 FUGW中，经限制性酶切、PCR扩增和测序鉴定重组载体。在脂质体介导下将慢病毒包装系统的包装结构基因pCMV.△8.9、包膜基因VSVG、目的基因FUGW-GM-CSF导入病毒包装细胞293T，荧光显微镜检测基因的表达，包装成病毒后，收集病毒上清，浓缩，鉴定。用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测转染FUGW-GM-CSF细胞上清液 GM-CSF表达水平，电子显微镜观察293T细胞中的慢病毒。 结果： 限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实RT-PCR获得的GM-CSF/PCR产物与GenBank中的数据完全吻合; GM-CSF准确克隆入FUGW的多克隆位点。慢病毒的3种质粒可高效转染入293T细胞，荧光显微镜下观察可见大量绿色荧光。转染 FUGW-GM-CSF包装细胞上清液 GM-CSF酶联反应阳性。电子显微镜下见慢病毒颗粒位于293T细胞胞浆的内质网中。 结论： 成功构建了GM-CSF与GFP融合基因慢病毒载体，为诱导DC提供了适合的稳定转染的载体。     

大鼠ferroportin 1过表达慢病毒载体构建及其转染PC12细胞

目的:构建含大鼠ferroportin 1(FP1,膜铁转运蛋白1)基因和EGFP(绿色荧光蛋白)基因的过表达慢病毒载体并转染PC12细胞。方法:化学合成含有目的基因FP1的质粒,将酶切获得的目的基因连接入线性化慢病毒载体,构建重组质粒PGC-FU-FP1并进行测序鉴定;鉴定正确的阳性克隆采用Lipofectamine2000转染293T细胞,通过荧光显微镜和Western Blot检测FP1表达情况;在脂质体介导下将PGC-FU-FP1、pHelper1.0和pHelper2.0三质粒系统共转染入293T细胞,包装产生慢病毒,并通过实时荧光定量PCR法检测病毒滴度。以重组慢病毒载体质粒PGC-FU-FP1转染PC12细胞,荧光显微镜下观察EGFP的表达,实时荧光定量PCR和Western Blot法分别检测FP1mRNA和蛋白表达情况。结果:FP1基因序列经测序后与GeneBank报道的序列完全一致;重组质粒PGC-FU-FP1中携带有正确的FP1基因并能在293T细胞中表达;病毒滴度为2×108TU/ml。荧光显微镜、实时荧光定量PCR和Western Blot法证实目的基因FP1能被重组慢病毒高效导入PC12细胞并得到过表达。结论:成功构建携带FP1基因的慢病毒载体,并获得FP1基因修饰的PC12基因工程细胞。为进一步研究FP1在帕金森病中的作用及基因治疗奠定基础。     

小鼠BTLA慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的 构建小鼠BTLA慢病毒表达载体,并对表达产物进行鉴定.方法 以pET-28a-mBTLA质粒为模板,通过PCR技术构建pMD18-T-mBTLA质粒,将小鼠BTLA基因全长编码序列克隆到慢病毒转移载体,通过脂质体转染293T细胞包装成小鼠BTLA慢病毒颗粒.PCR技术和基因测序对重组质粒进行鉴定.荧光显微镜观察重组慢病毒感染293T细胞形态学变化.RT-PCR和Western blot法鉴定BTLA在重组慢病毒感染293T细胞中的表达.50％组织培养感染剂量法(TCID5o法)检测重组慢病毒滴度.结果 成功构建的pMD18-T-mBTLA质粒和pSL6-mBTLA质粒,经双酶切电泳后均出现大小约为1 kb的条带与mBTLA编码序列的大小相符.基因测序并比对分析进一步证实mBTLA编码序列成功整合到质粒载体.病毒上清PCR扩增和293T细胞形态学观察证实Lenti-mBTLA慢病毒包装成功.TCID50法测定Lenti-mBTLA慢病毒滴度为1.3×108 pfu/mL.RT-PCR和Western blot法证实Lenti-mBTLA慢病毒能有效表达mBTLA mRNA和蛋白质.结论 成功构建了表达小鼠BTLA的慢病毒.     

表达anti-CD19-CAR协同沉默PD-1的慢病毒载体重构

本研究通过PCR方法扩增含EF1a启动子的DNA片段,利用同源重组酶将该DNA片段整合到pGreenPuro-shRNA慢病毒载体CMV启动子下游,获得新的多启动子慢病毒载体pGreenPuro-Dual。同时,在改造的慢病毒载体的CMV启动子下游插入鼠源anti-CD19-CAR片段,并在H1启动子下游EcoRI和BamHI酶切位点之间插入PD-1shRNA片段,重组获得pGreenPuro-Dual/anti-CD19-CAR/shRNA PD-1慢病毒载体,重组质粒与2个辅助质粒共转染HEK293FT细胞包装重组慢病毒颗粒。利用包装病毒感染HEK293T细胞后,荧光观察病毒感染效率,并提取细胞总蛋白Western blotting检测antiCD19-CAR以及PD-1的表达。结果显示表达anti-CD19-CAR以及shRNA PD-1的重组慢病毒成功感染了HEK293T细胞,鼠源anti-CD19-CAR成功表达,同时PD-1蛋白被有效沉默。     

金黄色葡萄球菌肠毒素C3 过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建金黄色葡萄球菌肠毒素C3(SEC3)过表达慢病毒载体并体外检测其表达目的基因。方法:聚合酶链反应(PCR)扩增SEC3 基因片段;用AgeI 酶切线性化GV365 慢病毒载体,通过连接反应构建GV365-SEC3 载体,运用PCR方法鉴定阳性克隆载体;转染293T 细胞包装慢病毒,观察细胞荧光及Western blot 检测慢病毒载体表达,HIV-1 p24 ELISA 法测定慢病毒载体滴度。结果:获得目的基因,并成功构建GV365-SEC3 慢病毒载体,通过PCR 及DNA 测序鉴定,证明GV365-SEC3 质粒构建正确;转染293T 细胞后可观察到大量荧光细胞,经蛋白电泳得到29 kD 大小的蛋白条带,与目的基因蛋白相符合,ELISA 检测病毒载体滴度为5 108 TU/ ml。结论:成功构建GV365鄄SEC3 过表达慢病毒载体,为后期研究其体内外对抗肿瘤的作用与机制奠定基础。     

绿色荧光蛋白标记的人血管内皮生长因子165基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的构建与鉴定携带绿色荧光蛋白标记的人血管内皮生长因子165(hVEGF165)基因的重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-GFP。方法将hVEGF165基因进行扩增,并同源重组入表达质粒pAV-MCMV-HA-P2A-GFP,转化入DH5a感受态细胞,得到的转化子经菌落聚合酶链反应(PCR)鉴定和测序鉴定后,通过Ad Max腺病毒包装系统转染HEK293细胞,进行病毒的包装和扩增。包装后镜下观察HEK293细胞,测定腺病毒滴度,Western blot检测重组腺病毒的表达。结果成功构建了重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-GFP,重组腺病毒转染的HEK293细胞出现了明显的细胞病变效应;获得重组腺病毒的滴度为1.106×10~8 IFU/mL;Western blot检测重组腺病毒表达在23 000左右。结论成功获得重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-GFP,为进一步研究基因治疗脓毒症/感染性休克奠定了实验基础。     

mTOR shRNA慢病毒载体的构建及包装

目的:构建mTORshRNA慢病毒表达载体,为探讨RNA干扰技术抑制T细胞mTOR基因的相关研究奠定基础.方法:设计合成针对小鼠mTOR基因的shRNA片段,与酶切后的pLKD.UBC.GFP.U6载体片段进行连接并转化DH5α,提取阳性克隆质粒,测序,转染293T细胞.通过GFP表达水平测定病毒滴度.结果:DNA测序结果及PCR鉴定证实成功构建小鼠mTOR-shRNA重组慢病毒载体,对其进行包装后测定慢病毒滴度为1.38E+ 08 TU/ml.结论:成功构建并包装小鼠mTOR-shRNA重组慢病毒表达载体.     

携人PTHLH基因慢病毒表达载体的构建

目的构建携带人甲状旁腺相关激素（PTHLH）基因的慢病毒表达载体pGC-FU/PTHLH。方法酶切载体pGC-FU,根据人PTHLH基因合成特定引物,扩增目的基因片段,将其克隆到pGC-FU质粒（含EGFP基因）上,菌落PCR鉴定及测序分析重组载体,使用Lipofectamine 2000诱导转染pGC-FU、pHelper1.0和pHelper2.0载体三质粒进入293T细胞包装慢病毒,并用带PTHLH的慢病毒感染293T细胞和鼻咽癌CEN1细胞确认慢病毒包装是否成功。结果菌液PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定显示,与理论预计值阳性转化子735bp,阴性转化子198bp基本相吻合;PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,结果完全匹配,进一步鉴定载体构建成功。分别将质粒包装系统共转染293T细胞,包装产生空白对照慢病毒（pGC-FU）和过表达PTHLH的慢病毒（pGC-FU/PTHLH）;或用携带PTHLH和EGFP基因的病毒上清感染CNE1细胞,48h后,倒置荧光显微镜下观察293T和CNE1细胞,均可见绿色荧光,转染成功。结论成功构建携人PTHLH基因慢病毒表达载体,为进一步研究PTHLH基因在鼻咽癌转移中的作用及鼻咽癌发病分子机制奠定了基础。     

过表达ODC抑制氧化应激诱导大鼠心肌细胞凋亡的研究

目的构建过表达鸟氨酸脱羧酶（ODC）基因慢病毒载体,并研究其对氧化应激诱导大鼠H9C2心肌细胞凋亡的影响。方法构建大鼠ODC基因pHIV-ODC过表达质粒,与包装质粒psPAX2、pMD2G共转染293FT细胞,检测其侵染效率;包装慢病毒并侵染H9C2心肌细胞;72 h后观察其侵染效率,RT-PCR法检测细胞ODC mRNA的表达,利用CCK-8、Hochest33258染色检测ODC对H2O2诱导H9C2心肌细胞凋亡的影响。结果酶切及测序鉴定ODC序列正确插入慢病毒过表达载体。侵染H9C2细胞72 h后ODC mRNA水平较阴性慢病毒感染组显著升高。过表达ODC能抑制H2O2诱导的细胞活力下降,减轻H2O2诱导的心肌细胞凋亡,与H2O2组比较差异均有统计学意义（P〈0.001）。结论成功构建的过表达ODC慢病毒,上调H9C2细胞中ODC的表达,过表达ODC能显著抑制氧化应激诱导的H9C2心肌细胞凋亡。     

Nesprin基因RNAi慢病毒载体的构建

背景：Nesprin蛋白缺失将影响细胞骨架组织和动态平衡,引起细胞骨架刚性丧失或导致细胞过早成熟老化,其对间充质干细胞的作用如何？ 目的：构建Nesprin蛋白siRNA慢病毒载体,并转染骨髓间充质干细胞。 方法：针对Nesprin靶基因序列设计并合成4对miRNA oligo,将4种miRNA干扰质粒转入大鼠血管平滑肌细胞,筛选最有效干扰序列;将最佳干扰序列和pDONR221载体进行重组反应,获得含干扰序列的入门载体,再将入门载体和慢病毒表达目的载体pLenti6/V5-DEST进行重组反应,获得含干扰序列的慢病毒表达载体,转染包装细胞293T细胞,包装慢病毒,以293T细胞GFP蛋白水平测定病毒滴度。慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞。 结果与结论：测序证实合成的4对miRNA oligo正确,RT-PCR和western-blot筛选出最佳干扰miRNA质粒为SR-3,成功构建了Nesprin siRNA的慢病毒载体LV-siNesprin。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的活性滴度为10⁶ TU/mL。慢病毒成功了转染骨髓间充质干细胞细胞。     

小鼠B7-1 基因RNAi 慢病毒载体的构建及其沉默效应研究

目的:构建介导小鼠B7-1 基因RNAi 的慢病毒载体,研究其对L929 细胞表面B7-1 分子表达的沉默效应。方法:从小鼠B7-1 基因编码区选择3 段RNA 干扰靶序列,制备转录双发夹RNA 的前体DNA,并克隆至慢病毒穿梭质粒,构建B7-1 的RNAi 慢病毒穿梭载体,测序鉴定。将重组质粒及辅助质粒共转染293T 细胞产生慢病毒,经超速离心获得浓缩慢病毒颗粒。通过测定293T 细胞GFP 表达水平确定病毒滴度,流式细胞术检测感染效率以及对细胞表面B7-1 的干扰效率。病毒感染细胞经嘌呤霉素筛选及克隆培养获得小鼠B7-1 基因RNAi 慢病毒稳定感染的L929 细胞,流式细胞术分析细胞中GFP 及B7-1 分子表达的状况;将感染细胞与分离的小鼠脾脏T 细胞混合培养,分析B7-1 稳定沉默细胞刺激T 细胞增殖的能力。结果:成功了构建小鼠B7-1 基因RNA 干扰的重组慢病毒载体;获得了滴度达(3 ~ 5) 108 TU/ ml 的浓缩重组慢病毒,重组慢病毒可有效感染L929 细胞介导GFP 表达以及沉默其表面的B7-1。经筛选获得慢病毒稳定感染的L929 细胞,该细胞表面B7-1分子表达受到抑制,刺激T 细胞增殖的能力显著下降(P<0.05)。结论:构建了能够高效感染及沉默小鼠B7-1 分子的RNAi 慢病毒载体,该载体可稳定沉默L929 细胞表面B7-1 分子表达,抑制B7-1/ CD28 信号诱导的T 细胞增殖效应。     

Tet-on慢病毒调控系统的构建及其调控作用

Objective To establish Tetracycline-induced gene expression system for gene therapy based on third generation lentivirus system.Methods The mutant of the reverse Tet transactivator (rtTA and M2rtTA) was subcloned into a lentiviral vector with neo selection marker named as pELNS-rtTA-IRES-Neo and pELNS-M2rtTA-IRES-Neo. The Tet-responsive element (TETO and TREpitt) and green fluorescence proteint (GFP) were subcloned into a lentiviral vector with blasticidin selection marker named as plenti6-TETO-GFP and plenti6-TREpitt-GFP.293 cells were contransfect with pELNS-rtTA-IRES-Neo and plenti6-TETO-GFP, or with pELNS-M2rtTA-IRES-Neo and plenti6-TREpitt -GFP. Cells were treated by Dox to induce GFP expression. After 48hours, GFP expression in the co-transfected cells was observed under a fluorescent microscope.Results The first generation of Tetracycline-induced gene expression system named pELNS-rtTA-IRES-Neo and plenti6-TETO-GFP vectors were successfully set up. GFP expression in cotransfected cells induced with Dox was about 90% positive, while there was 30% positive GFP expression observed in no Dox inducing group. The second generation of Tetracycline-induced gene expression system named pELNS-M2rtTA-IRES-Neo and plenti6-TREpitt-GFP vectors were successfully set up. GFP expression in cotransfected cells induced with Dox was about 95% positive, while there was no positive GFP expression observed in no Dox inducing group.Conclusion Tetracycline-induced gene expression system based on lentivirus was successfully set up, which can induce gene expression effectively and tightly without obvious side-effects on cells by using the second Tetracycline-induced elements.     

构建内皮脂肪酶慢病毒表达载体及在HepG2细胞中的表达

背景：内皮脂肪酶主要由血管内皮细胞分泌并作用于血管内皮,内皮脂肪酶可能在动脉粥样硬化等疾病的发生发展中起重要作用,但目前机制尚不明确。 目的：构建内皮脂肪酶慢病毒表达载体,产毒感染HepG2细胞,评价重组载体提高内皮脂肪酶表达的效果。 方法：RT-PCR调取大鼠内皮脂肪酶基因,SpeⅠ、Eco RⅠ双酶切后,将内皮脂肪酶基因插入慢病毒载体PRRL.sin.CMV.eGFP中构建内皮脂肪酶过表达慢病毒表达载体PRRL.sin.CMV.EL-eGFP;使用PRRL.sin.CMV.EL-eGFP质粒及病毒包装系统于293FT细胞中包装产毒,用于感染HepG2细胞,RT-PCR及Western blot检测感染后HepG2细胞内皮脂肪酶mRNA及蛋白的表达。 结果与结论：酶切及测序鉴定证实内皮脂肪酶基因成功插入PRRL.sin.CMV.EL-eGFP慢病毒表达质粒;转染PRRL.sin.CMV.EL-eGFP慢病毒表达质粒后,HepG2细胞中可见内皮脂肪酶mRNA及蛋白的表达。说明重组PRRL.sin.CMV.EL-eGFP慢病毒可感染HepG2细胞,并使其表达内皮脂肪酶mRNA和蛋白。     

大鼠CD80基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建大鼠CD80基因的RNAi慢病毒载体并在大鼠NRK和IEC6细胞上鉴定其沉默效率.方法:将筛选获得的大鼠CD80基因特异性siRNA靶点,合成短发卡结构shRNA并退火成双链DNA,与pGCSIL-GFP慢病毒载体重组形成shRNA表达载体,利用PCR和测序鉴定获得连接正确的克隆.经由293T细胞包装shRNA慢病毒颗粒,随后将其感染大鼠NRK细胞、IEC6细胞和大鼠DC细胞(树突状细胞,Dentritic cell),分别采用Real-time PCR和Western blot方法检测靶基因在mRNA和蛋白质水平的沉默效率.结果:构建的慢病毒载体shRNA的PCR鉴定和测序正确,包装病毒后滴度达到4×10~8 TU/ml.shRNA慢病毒颗粒感染NRK和IEC6细胞后CD80基因的 mRNA表达量较阴性对照载体慢病毒感染组分别下降了66.9%和63.5%.结论:成功构建了大鼠CD80基因的shRNA慢病毒表达载体,能够在细胞水平有效沉默靶基因.     

构建含肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因慢病毒载体

背景：腺病毒的表达时间有限,会限制目的基因的表达时间和表达量,不利于实验的持续进行,故文章选择慢病毒作为载体,与目的基因大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因片段进行基因重组。 目的：探讨构建含有大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因慢病毒载体的方法。 方法：根据GenBank中大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体序列(NM 145681.1),设计出该基因的特异性引物Trail-AgeⅠ-F和Trail-AgeⅠ-R,用PCR法从大鼠cDNA文库中扩增出目的基因,AgeⅠ酶切将该基因克隆入真核表达载体GV218中,产生目的重组质粒,用脂质体 Lipofeetamine 2000包裹构建的重组质粒和辅助包装载体,3个质粒共同转染293T细胞,产生含有表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白的慢病毒颗粒,收集病毒进行滴度鉴定,收集细胞提取蛋白进行基因表达情况的检测。 结果与结论：筛选出的克隆阳性菌测序获得肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因,全长861 bp,与GenBank中发表的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体核苷酸序列完全一致。包装后的病毒LV-mTrail在转染2 d后收集病毒液,经PCR和Western blot方法鉴定,从基因和蛋白的层面均证实携带有目的基因肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因。孔稀释法及实时荧光定量PCR病毒滴度测定法测定结果为2×109 TU/mL。提示大肠杆菌同源重组法能有效和方便地构建出含有肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因的慢病毒载体。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

REST/NRSF基因shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

背景：神经元限制性沉默因子(REST/NRSF)能负向调控神经元及胰岛细胞分化相关基因的表达。 目的：构建并筛选能高效沉默大鼠REST/NRSF基因的shRNA慢病毒载体。 方法：针对REST/NRSF基因设计4组特异性siRNA靶点,合成靶序列的寡核苷酸序列,退火形成双链DNA,与经Hpa Ⅰ 和Xho Ⅰ双酶切后的pFU-GW-RNAi载体连接产生L-shREST/NRSF慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。包装产生慢病毒颗粒,随后将其感染大鼠骨髓间充质干细胞,采用 Real-time PCR方法检测靶基因在 mRNA 水平的沉默效率。 结果与结论：PCR和测序证实,构建出了REST/NRSF shRNA的慢病毒载体L-shREST/NRSF,并能稳定转染大鼠间充质干细胞,感染效率达100%。4组shRNA序列均有基因沉默效果,并以第3组shRN序列效果最为明显。结果表明,该慢病毒表达载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

携带小鼠IGF-1基因的慢病毒载体构建及其在神经干细胞中的表达

目的:构建含有小鼠胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因的慢病毒载体,鉴定其在神经干细胞(NSCs)中的表达。方法:采用RT-PCR方法从小鼠的骨骼肌细胞中扩增IGF-1基因,克隆入pcDNA3.1质粒,构建慢病毒载体pXZ9-IGF-1。用脂质体介导三质粒共转染法转染293FT细胞,获得病毒上清。分离培养神经干细胞,Nestin免疫荧光化学鉴定。慢病毒感染神经干细胞,显微镜下观察GFP表达情况,通过RT-PCR及ELISA试剂盒分别从mRNA和蛋白水平检测IGF-1的表达。结果:通过RT-PCR法从小鼠的骨骼肌细胞中扩增出IGF-1基因并克隆入pcDNA3.1载体,经亚克隆成功构建慢病毒质粒pXZ9-IGF-1。质粒经脂质体转染293FT细胞获高滴度慢病毒颗粒,体外高效感染神经干细胞。神经干细胞经感染后,IGF-1基因mRNA和培养基中蛋白水平均高表达。结论:成功构建含小鼠IGF-1基因的慢病毒载体pXZ9-IGF-1,并在神经干细胞内获得表达。