同期输注供者骨髓间充质干细胞对肝移植大鼠免疫的影响

目的 探讨肝移植同时输注供者骨髓间充质干细胞对受体肝移植免疫的影响.方法 实验分为空白对照组(A组)、移植组(B组)和输注供者骨髓间充质干细胞组(C组).A组SD大鼠5只,只行剖腹探查,B,C组Wistar和SD大鼠各10只.行Wistar-SD大鼠肝移植同时,C组提取供体骨髓间质干细胞同期输注给受者,B组给予输注生理盐水.观察术后第7天肝功能的变化、病理改变和受体生存期.结果 肝移植同时输注供者骨髓间充质干细胞,ALT,AST,TBIL,ALB较B组显著降低,生存期明显延长,病理改变仅呈急性轻度排斥反应,而单纯移植组呈急性重度排斥反应.结论 肝移植同时输注骨髓间充质干细胞促进受体对移植肝的免疫耐受.     

大鼠骨髓间充质干细胞活体示踪标记方法的研究现状

骨髓间充质干细胞(MSCs)具有很强的自我更新能力和多分化潜能,已经成为组织修复的理想种子细胞和基因治疗的靶细胞。当前细胞移植的一个障碍是体内示踪,从而制约了细胞移植的相关研究。标记移植细胞能对移植细胞在体内的存活、迁移、分布及增殖、分化转归等生物学行为进行检测,评估干细胞移植的效果,以及提供干细胞移植疗法的最佳信息。下面主要概述目前在大鼠MSCs移植研究中常用的示踪标记方法 。     

大鼠骨髓间充质干细胞移植后肝内定居的实验研究

目的探索大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)同种异体移植后在受体大鼠模型肝内定居分布情况。方法利用密度梯度离心法分离、纯化培养大鼠骨髓间充质干细胞。取第三代MSCs经CFSE标记后从门静脉植入同种异体正常组和肝损伤组大鼠体内,于移植后的第14d取出的肝脏,通过冰冻切片行荧光检测,研究MSCs在大鼠肝脏内定居分布情况。结果经门静脉移植的MSCs在正常组和肝损伤组的肝脏内均能定居,且定居的细胞数量上肝损伤组明显多于正常组。结论经门静脉移植的MSCs可以定居于肝脏内,且定于肝脏的干细胞数量与肝脏是否损伤密切相关。     

大鼠骨髓间充质干细胞植入大鼠脑内后的迁移

目的：研究大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）植入脑内后的存活和迁移性。方法：分离大鼠MSCs体外培养、纯化。Hoechst33342标记后立体定向植入大鼠海马CA4区,1、2、4周后处死大鼠取脑,制作冷冻切片;用荧光显微镜观察Hoechst33342阳性细胞。结果：原代、传代细胞贴壁生长,有较强的增殖能力;植入大鼠海马后沿针道及注射区可见多数存活细胞,散在分布,自植入区及针道向周围逐渐减少。结论：大鼠MSCs植入大鼠脑内后能够存活并具有向周围组织迁移的能力。     

输注自体骨髓间充质干细胞延长犬活体肝移植存活的实验研究

目的 探讨输注自体骨髓间充质干细胞延长犬活体肝移植存活的机制.方法 14只受体犬建立活体肝移植模型后,随机分为对照组和处理组,对照组仅做活体肝移植,处理组在活体肝移植的基础上,术中输注自体骨髓间充质干细胞,术后观察两组犬的生存时间、肝功能(AST、ALT)、组织病理变化及移植细胞的分化状况.结果 ①处理组比对照组的中位生存时间明显延长(P<0.01).②肝功能变化:术后两组AST、ALT总体相比较,处理组AST、ALT水平降低,有显著性差异(P<0.01).⑨组织病理变化:术后两组均出现不同程度的免疫排斥反应,且排斥程度相似.④移植细胞分化情况:输注的骨髓间充质干细胞向有功能的肝样细胞分化.结论 输注自体骨髓间充质干细胞可以延长活体肝移植受体犬的存活时间;经门静脉输注的自体骨髓间充质干细胞可向肝样细胞分化.     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养

目的 观察体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的生物学特性。方法 通过贴壁法培养、鉴定大鼠骨髓MSCs，观察其生长规律及光镜结构特点。结果 大鼠MSCs 7代以前增殖速度较快，细胞接种后1～2d为滞留期，3d后达对数生长期，第6天进入平台期。免疫组织化学染色显示MSCs表达CI）44，不表达CD45；光镜下可见MSCs呈梭形、纺锤形和多角形，核居中，有1～2个核仁。结论 培养的细胞为骨髓MSCs；在体外培养条件下细胞生长性状稳定，可作为组织工程的种子细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞培养方法的比较

目的：比较4种培养条件下大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的生长与增殖性差异。方法采用密度梯度离心法提取大鼠BMSCs ,分别在DMEM-LG培养基、DMEM/F12培养基、DMEM-LG＋10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（ bFGF）与DMEM/F12＋10 ng/mL bFGF培养条件下贴壁培养,观察各代细胞的形态特征,绘制第4代细胞的生长曲线,利用流式细胞仪对各培养条件下的BMSCs进行细胞表面标志CD45、CD29和CD90的检测。结果不同培养条件下的 BMSCs 生长速度不同。加入 bFGF 培养条件下细胞增殖速度较单用 DMEM -LG 或DMEM/F12培养条件下更快（P＜0．05）。 DMEM-LG＋10 ng/mL bFGF的培养效果最佳,细胞密度高,生长状态良好。4种条件下培养的细胞均阳性表达CD29及CD90,阴性表达CD45。结论短期培养过程中加入bFGF不引起BMSCs分化,DMEM-LG＋10 ng/mL bFGF是较理想的BMSCs培养条件。     

CM-Dil体外标记骨髓间充质干细胞及其在烧伤大鼠模型肠组织内的示踪

目的：探讨氯甲基苯甲酰胺（CM-Dil）对骨髓间充质干细胞（BMSCs）的体外标记及其在烧伤大鼠模型肠组织内的示踪能力。方法：采用贴壁培养法分离、纯化、扩增BMSCs。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子（EGF）和维甲酸（RA）诱导BMSCs向神经元样细胞分化,免疫细胞化学法检测神经元表面标志神经细胞特异性标志微管相关蛋白-2（MAP-2）和神经元特异核蛋白（NeuN）的表达。4、6和8 mg•L^-1 CM-Dil标记BMSCs,CCK-8法检测不同浓度CM-Dil对细胞的毒性作用,流式细胞仪检测其标记率。选用成年雄性Wistar大鼠,制备烧伤大鼠模型,经球后静脉注射1×107个CM-Dil标记的BMSCs。大鼠烧伤2周及6个月后取肠组织,制备冰冻切片,用激光共聚焦显微镜观察BMSCs在大鼠肠组织内的定植情况。结果：免疫细胞化学结果表明,BMSCs 诱导分化的神经元样细胞表达NeuN和MAP-2。CCK-8法结果表明,8 mg•L ^-1 CM-Dil组细胞毒性显著高于对照组（P<0.05）,4和6 mg•L^-1 CM-Dil与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。4 mg•L^-1 CM-Dil标记BMSCs对细胞无毒性,标记率达93.9%,细胞形态无改变。冰冻切片激光共聚焦显微镜观察,CM-Dil标记的BMSCs在大鼠烧伤后2周及6个月的肠组织内定植。结论：CM-Dil可以体外标记BMSCs,可以用于BMSCs在烧伤大鼠模型肠组织组织内的示踪研究。     

荧光染料CM-DiI标记大鼠骨髓间充质干细胞的体外实验

目的 探讨荧光染料CM-DiI标记大鼠骨髓间充质干细胞的效果及其对细胞活力、增殖能力、凋亡等生物学特性的影响.方法 用梯度离心加贴壁培养法获取、培养、扩增大鼠骨髓间充质干细胞.取第4代MSCs,分为实验组和对照组,用浓度为6 μmol/L的CM-DiI对实验组MSCs进行标记.用台盼蓝染色检测细胞的活力,CCK-8法检测细胞增殖能力,Hoechst 33258染色法检测细胞凋亡.细胞标记后用倒置相差荧光显微镜动态观察不同子代MSCs的阳性标记率、荧光衰减情况及细胞生长、形态变化.结果 CM-DiI标记后的MSCs发橙红色荧光,高倍镜下显示细胞上有密集排列明亮荧光颗粒.CM-DiI标记后1 d、4 d、8 d、16 d、24 d细胞标记阳性率分别为100%、(85.2±4.9)%、(42.3±5.1)%、(17.6±3.6)%、(4.4±1.3)%,细胞标记阳性率和荧光强度随传代次数和培养时间的增加而呈显著进行性下降.标记细胞的大小、形态、活力、增殖能力、细胞凋亡与未标记细胞相比无明显差异.结论 CM-DiI标记骨髓间充质干细胞简便、有效,对其生物学特性无明显影响,可用于MSCs的短期示踪.     

兔骨髓间充质干细胞分离方法的比较

目的:比较3种兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)分离方法的效率。方法:以12只3个月龄新西兰大白兔为实验对象,每只骨髓血平分3份,以全血细胞培养法、不连续Percoll分离液密度梯度离心法和Ficoll分离液密度梯度离心法进行分离,对克隆形成率、首次传代时间、16 d培养细胞数量等指标进行比较。结果:不连续Percoll分离液密度梯度离心法在各项指标中均优于Ficoll分离液密度梯度离心法及全血细胞培养法,且成功率最高。结论:不连续Percoll分离液密度梯度离心法是成年兔穿刺获取BMSCs最合适的分离方法。     

不同时期骨髓间充质干细胞移植对大鼠肝纤维化的作用

目的探讨骨髓间充质干细胞移植对大鼠肝纤维化的作用,并探索最佳移植时期。方法应用贴壁培养法分离SD大鼠MSCs,分别于肝硬化造模第6周,10周经尾静脉注射1×106MSCs。在移植4周后,评价移植组与对照组的生存状态,行肝功能检测(ALB,ALT,TBIL),肝脏HE染色。结果MSCs经尾静脉移植入肝硬化大鼠后,大鼠肝功能均明显改善,与对照组相比有统计学意义(P0.05),其中6周移植组较10周移植组效果更佳。结论MSCs移植可以改善大鼠外周血液的血生化特性和肝的组织学结构,且在肝纤维化早期进行移植效果更优。     

骨髓间充质干细胞

骨髓间充质干细胞是一群均一的细胞，具有自身的增殖特征及组织化学特征．它在适宜的微环境中能分化为成骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞和星状神经细胞等，它易于分离、扩增，易于外源基因导入表达，有望成为细胞治疗和基因治疗的新型靶细胞，具有广阔的应用前景。     

Apelin-13促进骨髓间充质干细胞增殖

目的 探讨apelin-13是否促进骨髓间充质干细胞增殖。 方法 分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞,用不同浓度apelin-13（0.1 μmol/L、1.0 μmol/L和10.0 μmol/L）处理细胞24 h后,分别用流式细胞术和噻唑蓝比色法（MTT）,观察apelin-13对骨髓间充质干细胞增殖的影响。 结果 倒置显微镜下观察到apelin-13促进大鼠骨髓间充质干细胞增殖,流式细胞术检测结果表明,apelin-13刺激后处于S期和G2-M期的细胞数目显著增加,G0-G1期的细胞数目显著减少。进一步MTT结果表明,apelin-13处理后大鼠骨髓间充质干细胞增殖显著增加,并呈浓度依赖性。 结论 apelin-13能促进骨髓间充质干细胞增殖。     

大鼠骨髓间质干细胞的体外分离培养与鉴定

目的：体外培养大鼠骨髓间质干细胞（BMSCs）,并进行形态学观察、表面分子标记和多向分化能力的检测鉴定。方法采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs,显微镜下进行形态学观察,流式细胞仪检测细胞表面标记物CD29、CD44、CD45,并诱导大鼠BMSCs向成骨和成脂分化。结果分离培养的细胞以梭形细胞为主,呈漩涡状生长。 CD29、CD44均呈阳性表达,而CD45呈阴性。成脂成骨诱导后,油红O和茜素红S染色均呈阳性。结论全骨髓贴壁培养法分离培养的细胞具有间质干细胞的生物学特性,具有多向分化潜能。     

骨髓间充质干细胞移植和动员对重症急性胰腺炎大鼠肝肾细胞凋亡的保护作用

目的探讨自体骨髓间充质干细胞移植和干细胞动员对重症急性胰腺炎大鼠肝肾细胞凋亡的保护作用。方法腹腔注射L-精氨酸制备大鼠SAP模型,随机分为假手术组、模型组、骨髓干细胞移植(mesenchymal stem cells,MSC)组、重组人粒细胞集落刺激因子组(G-CSF)及MSC+G-CSF组(n=48),各组再按术后不同观察时间段分为12、24、48、72h亚组(n=12)。MSC组造模后6h经股静脉注入自体骨髓间充质干细胞1.2ml,G-CSF组造模前连续3天皮下注入G-CSF 40μg/kg,MSC+G-CSF组则联合应用,假手术组仅腹腔注射等体积生理盐水。在术后相应时间点观察各组大鼠的死亡率,肝肾脏组织的病理变化,比较Bax、Bcl-2蛋白水平和细胞凋亡指数差异。结果各治疗组48h前未见死亡,72h死亡率与模型组比较无显著差异(P>0.05);肝脏、肾脏病理变化均较模型组减轻;治疗组各时间点肝肾细胞Bax表达较模型组下调,Bcl-2蛋白上调,凋亡指数较模型组有明显下降。MSC+G-CSF组24h点后Bax含量,48h、72h点Bcl-2含量,24h/48h点后细胞凋亡指数与MSC组和G-CSF组比较差异显著(P<0.05),MSC组和G-CSF组各时间比较无显著差异(P>0.05)。结论联合自体骨髓MSC移植与动员能有效抑制重症急性胰腺炎时肝脏和肾脏的细胞凋亡。     

静脉移植和动员骨髓间充质干细胞对胰腺炎肝肾功能损害的保护作用

目的探讨自体骨髓间充质干细胞静脉移植和骨髓干细胞动员在重症急性胰腺炎肝肾功能损害中的作用及可能机制。方法制备SAP大鼠模型240只,随机平分为对照组、SAP模型组、MSC组、G-CSF组和MSC+G-CSF组,各组术后再平分为12、24、48、72h组。MSC组在SAP模型6h后注射MSC 1.2ml,G-CSF组在SAP前3天每天预注射G-CSF 40μg/kg,MSC+G-CSF组联合使用G-CSF和MSC方法,对照组注射等量NS。比较各组病死率,观察肝脏和肾脏大体及镜下病理改变,比较血清肝肾功能指标ALT、AST、Bun、Cr、LDH和炎症因子TNF-α、IL-6、CRP含量,比较肝肾组织细胞凋亡指数。结果各组大鼠均存活超过48、72h病死率与SAP组比较差异无显著;肝、肾组织大体及镜下病理变化均轻于SAP模型组;治疗组血清肝肾功能指标,炎症细胞因子含量较SAP模型组不同程度减低,其中MSC+G-CSF组部分指标与单独治疗组比较有显著差异(P<0.05),细胞凋亡指数与单独治疗组比较有显著差异(P<0.05),但MSC与G-CSF组比较差异无统计学意义。结论静脉移植MSC和G-CSF骨髓动员均能有效保护重症急性胰腺炎时肝肾损害,其中联合治疗效果最佳,其中对炎症反应及细胞凋亡的调控机制存在。     

不同途径移植大鼠骨髓间充质干细胞对大鼠肝硬化的作用研究

目的探索不同途径移植绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记的大鼠骨髓间充质干细胞（rat bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs）在慢性肝纤维化中的作用,以及移植后细胞在肝脏组织内的存活、分布情况。方法全骨髓差速贴壁法分离、培养BMSCs,利用携带GFP基因的慢病毒载体感染P3代BMSCs,建立四氯化碳慢性肝纤维化大鼠模型,通过不同途径移植GFP标记的BMSCs,移植后维持四氯化碳肝损伤,1月后处死大鼠,行肝脏功能相关指标白蛋白（albumin,ALB）、谷丙转氨酶（alaninotransferase,ALT）和谷草转氨酶（aspartate aminotrans-ferase,AST）检测,观察肝脏局部组织标本苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining,HE）、胶原纤维染色和荧光分布情况。结果不同途径BMSCs移植对大鼠四氯化碳所致慢性肝纤维化肝脏功能无明显改善,移植后GFP标记的BM-SCs均可向损伤肝脏迁移或停留,不同途径移植的BMSCs在肝脏内分布不同。结论大鼠骨髓间充质干细胞移植对大鼠慢性肝纤维化无明显治疗作用,可能参与了肝纤维化的形成。     

骨髓和脐血间质干细胞联合移植治疗杜氏型进行性肌营养不良症269例疗效研究

目的 观察骨髓间质干细胞(BMSCs)和脐血间质干细胞(CMSCs)联合移植治疗杜氏型进行性肌营养不良症(DMD)的临床疗效.方法 2007年6月-2009年3月对269例DMD患者行自体BMSCs和CMSCs联合移植方案进行治疗,患者均使用重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF),5～10 μg/kg,2次/d,皮下注射动员骨髓干细胞4 d,于第5天行骨髓采集术,局部麻醉下从髂后上棘抽取骨髓100～180 ml.将采集的骨髓液经Ficoll密度梯度离心后,分离单个核细胞2.0×109,用Uitra cul Ture 培养液调节细胞数量为1×105/ml～1×106/ml,接种于75 mm2培养瓶中,24 h换液,7～10 d后收集全部细胞,总数为4.0×108/ml～1.5×109/ml.将BMSCs移植到患者四肢近端肌肉内.采集脐血80～160 ml,Ficoll密度梯度离心,分离单个核细胞并诱导分化为CMSCs.将CMSC(1.0～4.8)×107细胞悬液,经静脉缓慢输注,每5～7 d 1次,共3次.移植后6个月对患者的肌力、步行10 m和推轮椅10 m所需时间、肌酸激酶水平、肌电图等进行观察.结果 269例患者移植后6个月时随访,218例患者(81.0%)肌力有不同程度的增加.干细胞移植后235例患者复查心肌酶谱,其中188例(80%)患者步行10 m及推轮椅10 m所需时间明显缩短,与移植前比较差异有统计学意义(P<0.05),干细胞移植后患者肌酸激酶水平较移植前明显下降(P<0.01).51例患者复查肌电图,32例(62.7%)患者波幅不同程度增高,运动单位增多,多相波减少.47例患者复查大腿肌肉磁共振成像,肌肉影像较移植前变化不明显.结论 BMSCs和CMSCs移植治疗DMD,对肌肉组织有一定的修复作用,使DMD患者的运动功能得到改善,肌力有所提高,肌酸激酶较移植前下降.移植后复查肌电图波幅不同程度增高,运动单位增多,多相波减少.MSCs移植无不良反应,患者依从性好,是治疗DMD的新手段.     

骨髓基质干细胞移植对糖尿病大鼠血糖的影响

目的研究骨髓基质干细胞移植对糖尿病大鼠的降血糖作用。方法单次链脲霉素腹腔注射建立糖尿病大鼠模型;糖尿病大鼠分为对照组和移植组,对照组腹腔注射等体积培养液,移植组将骨髓基质干细胞移植至糖尿病大鼠胰腺组织中,测定大鼠血糖变化,评价骨髓基质干细胞移植对大鼠血糖的影响。结果骨髓基质干细胞移植后,糖尿病大鼠血糖水平明显下降,由17.58±2.46 mmol/L降至5.94±2.25 mmol/L,移植组和对照组大鼠血糖水平差异有显著性(P<0.01)。结论骨髓基质干细胞移植后可降低糖尿病大鼠血糖。