生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物的制备

目的 制备生物素化的HLA-A＊2402-抗原肽复合物。方法 将原核高效表达的sHLA-A＊2402-BSP融合蛋白及β2m和HLA-A＊2402限制性抗原肽EB病毒BRLF1蛋白中的九肽NH2-TYPVLEEMF-COOH进行稀释、复性、折叠,形成HLA—A＊2402-抗原肽复合物单体,并在BirA酶作用下进行生物素化,使生物素结合到HLA-A＊2402-抗原肽复合物中H链C端的BSP序列上形成生物素化的sHLA—A＊2402-抗原肽复合物单体。利用特异性单克隆克体（W6／32和兔抗人β2微球蛋白抗体）及链霉亲合素进行ELISA和Westem blot,检测稀释复性和生物素化的折叠产物。结果 折叠复合物中,主要含有HLA—A＊2402-肽复合物单体及β2两种成分,其中HLA-A＊2402-肽复合物单体可生物素化。结论 成功制备出生物素化的HLA—A＊2402-抗原肽复合物单体,为进一步构建四聚体及制备人工抗原提呈细胞奠定了基础。     

sHLA-A*020-1抗原肽复合物的构建

以原核表达的sHLA A 0 2 0 1 BSP为重链 ,β2 m为轻链 ,与人工合成的EBV抗原肽LMP2A (4 2 6 4 34、NH2 CLGGLLTMV COOH )利用稀释法进行共折叠复性 ,形成可生物素化的可溶性HLA A 0 2 0 1抗原肽复合物。并利用仅与天然构象HLAI类分子结合的单抗W6 / 32 ,通过Dot ELISA和Westernblot对折叠产物的构象进行鉴定 ,证实复性后成功获得了天然构象的sHLA A 0 2 0 1 抗原肽复合物。为进一步组装可溶性HLA/抗原肽四聚体以及制备人工抗原提呈细胞奠定基础。     

三种常见HBV抗原肽-HLA-A*0201复合物四聚体的构建及初步检测应用

目的 体外构建三种常见HBV抗原肽-HLA-A*0201复合物四聚体,并初步用该三种四聚体对抗原肽特异性的细胞毒性T细胞(CTL)进行了初步检测.方法 原核高效表达的HLA-A*0201-BSP和β2m蛋白,分别和三种HBV抗原肽(HBVCore18-27,Env335-343,Po1575-583)体外复性折叠成可溶性的HLA-A*0201抗原肽复合物单体,经BirA酶作用并通过凝胶过滤层析法纯化复合物单体,分别将复合物单体与藻红蛋白标记的链霉亲和素按一定比例耦合构建成相应的三种抗原肽四聚体.最后进行流式细胞仪检测.结果 Dot-ELISA和ELISA检测显示获得了三种具有天然构象的生物素化的HBV抗原肽-HLA-A*0201复合物单体.构建的三种四聚体均可以检测到相应特异性的CTL,在自限性感染患者体内针对乙肝核心抗原(core18-27)的CTL细胞频数(0.18%)高于针对聚合酶抗原(po1575-583)(0.08%)和包膜抗原(env335-343)(0.06%).结论 成功构建了三种具有完整构象的生物素化HBV抗原肽-HLA-A*0201复合物单体,所构建的三种四聚体都可以检测到抗原特异性的CTL.     

可溶性HLA-A2-肽复合物的体外折叠与生物素化

目的 :可溶性HLA A2 抗原肽复合物的体外折叠复性与生物素化。方法 :原核高效表达的HLAH链及 β2m,在抗原肽 (EB病毒的膜潜伏蛋白LMP2A的NH2 CLGGLLTMV COOH残基 )的存在下 ,通过稀释复性折叠成HLA A2 抗原肽复合物 ,并在BirA酶的作用下进行生物素化 ,使生物素结合到HLA A2 抗原肽复合物中的H链C端。利用特异性抗体 (mAbW6 / 32和兔抗人 β2m抗体 )及链霉亲合素进行ELISA和Westernblot,检测稀释复性和生物素化的折叠产物。结果 :折叠复合物中 ,主要含有HLAH链聚合体、HLA A2 肽复合物单体及 β2m3种成分 ,其中H链聚合体与HLA A2单体可生物素化。结论 :成功地获得生物素化的HLA A2 抗原肽复合物单体 ,为进一步构建四聚体及制备人工抗原提呈细胞奠定了基础 ,也为过程复杂的HLA 抗原肽四聚体的制备提供了可行的免疫学监控方法     

HBc-HLA-A*1101-β2m复合物单体及其四聚体的制备和鉴定

目的制备HBc-HLA-A ＊ 1101-β2m复合物单体和四聚体,并对其特异性进行了鉴定。方法原核高效表达的HLA-A ＊ 1101-BSP和β2m蛋白,在抗原肽（乙型肝炎病毒的核心蛋白HBc88-96）的存在下,体外复性折叠成可溶性的HLA-A ＊ 1101抗原肽复合物单体,经BirA酶作用并通过凝胶过滤层析法纯化复合物单体;然后将此复合物单体与藻红蛋白标记的链霉亲和素按一定比例耦合构建成四聚体;最后用流式细胞仪检测分析该四聚体结合特异性CTL的能力。结果Western blot和Dot-ELISA检测显示所制备的HLA-A ＊ 1101抗原肽复合物单体具有天然构象,且可被生物素化;流式细胞仪分析显示所制备的四聚体可与HLA-A11^＋供者的抗原特异性CTL结合。结论成功制备了具有完整构象的生物素化HLA-A ＊ 1101抗原肽复合物单体;此四聚体可以特异检测抗原特异性的细胞毒性T细胞。     

BirA酶基因表达载体的构建、原核表达及表达产物的活性鉴定

目的:构建生物素-蛋白连接酶(BirA酶)基因的表达载体,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中表达具有生物学活性的BirA酶。方法:用PCR法扩增BirA酶基因。将PCR产物克隆入pGEX-4T-2中构建BirA酶-GST融合蛋白基因的重组表达载体pGEX-BirA。经测序验证后,在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,表达产物采用谷胱苷肽-琼脂糖层析柱进行纯化。以带有生物素酶底物肽(BirAsubstratepeptide,BSP)的HLA-A2-肽复合物为底物,用ELISA和Westernblot鉴定表达产物的生物素化活性。结果:构建了pGEX-BirA原核表达质粒,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达Mr为61300的BirA酶-GST融合蛋白,表达产物经谷胱苷肽-琼脂糖层析柱纯化后,得到N端带有GST标签的BirA酶蛋白。ELISA和Westernblot的结果显示,表达产物能使HLA-A2-肽复合物生物素化。结论:成功地制备了具有生物学活性的Bi-rA酶,为研究蛋白质分子的相互作用提供了有效的制剂。     

HBV抗原肽-HLA-A*2402复合物四聚体的构建及初步检测应用

目的：构建2种HBV抗原肽-HLA-A＋2402复合物四聚体，并初步用该2种四聚体检测针对不同抗原肽特异性的细胞毒性T细胞（CTL）。方法：原核高效表达HLA-A＋2402-BSP和β2m蛋白后，分别与乙型肝炎病毒抗原肽P01756-764和Corell7-125在体外复性折叠成可溶性的HLA-A＋2402抗原肽复合物单体，经BirA酶作用并通过凝胶过滤层析法纯化复合物单体，分别将复合物单体与藻红蛋白标记的链霉亲和素按一定比例耦合构建成2种HBV抗原肽四聚体。最后进行流式细胞术检测。结果：Dot-ELISA和ELISA检测显示获得了2种具有天然构象的生物素化的HBV抗原肽-HLA-A＋2402复合物单体。结论：构建的2种四聚体可以检测乙型肝炎感染者体内特异性的CTL。     

人Ⅱ型胶原的HLA-A*0201限制性CTL表位的预测及初步鉴定

目的预测和初步鉴定类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)主要自身抗原Ⅱ型胶原(CollagenⅡ,CⅡ)的HLA-A*0201限制性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)表位,为基于CⅡ抗原表位的特异性免疫治疗奠定基础。方法选取BIMAS、SYFTEPITHI、IEDB、SVMHC、AntiJen预测工具预测该抗原HLA-A*0201限制性结合肽;人工合成待测表位肽,利用T2细胞株通过直接免疫荧光法测定各肽与HLA-A*0201分子的结合力。利用酶联免疫斑点检测(enzyme-linked immunospotassay,ELISPOT)方法检测候选肽刺激关节滑液单个核细胞(synovial fluid mononuclear cell,SFMC)分泌IFN-γ的能力。结果综合BIMAS、SYFTEPITHI、IEDB、SVMHC、AntiJen预测结果筛选出来可能与HLA-A*0201结合的5条肽。MHC亲和力实验表明,在候选的5条肽中,P1261、P1365及P1399具有与HLA-A*0201分子结合的能力,平均荧光强度分别为:1.35、2.53、1.78。ELISPOT试验结果表明,P1365具有刺激SFMC分泌IFN-γ的能力。结论表位预测结果与初步鉴定结果具有一致性,两者联合应用初步认为P1365是HLA-A*0201限制性CTL表位的可能性最大,为下一步表位鉴定及基于人CⅡ抗原表位的特异性免疫治疗奠定理论基础。     

人锌转运蛋白8的HLA-A~*0201限制性CTL表位的预测及初步验证

目的预测和初步鉴定1型糖尿病(T1DM)主要自身抗原锌转运蛋白8(ZnT8)的HLA-A*0201限制性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)表位,为基于ZnT8抗原表位的特异性免疫治疗奠定基础。方法选取BIMAS预测工具预测该抗原HLA-A*0201限制性结合肽,人工合成待测表位肽,利用T2细胞株测定各肽与HLA-A*0201分子的结合力。利用酶联免疫斑点检测(enzyme-linked immunospotassay,ELISPOT)方法检测候选肽刺激T1DM患者外周血单个核细胞分泌IFN-γ和IL-2的能力,利用标准51Cr释放试验检测特异性CTL诱导活性。结果在所筛选的5个候选CTL表位中,ZnT8(107-115)、ZnT8(115-123)及ZnT8(145-153)与HLA-A*0201分子具有较高的结合荧光强度,可在体外有效诱导抗原特异性CTL的产生,刺激T1DM患者PBMC分泌IFN-γ和IL-2,并对抗原肽负载的T2细胞具有明显的杀伤效应。结论 ZnT8(107-115)、ZnT8(115-123)及ZnT8(145-153)可能是HLA-A*0201限制性CTL表位,为基于人ZnT8抗原表位的特异性免疫治疗奠定理论基础。     

负载HCMV pp65抗原肽的HLA-A*1101-GPI四聚体的制备和鉴定

为体外复性制备负载人巨细胞病毒(HCMV)pp65抗原肽的HLA-A*1101-GPI四聚体,研究优化HLA-A*1101重链与生物素化酶底物肽融合蛋白(HLA-A*1101-BSP)在大肠杆菌中的诱导表达的温度、时间和诱导剂IPTG浓度,并以抗HLA-A*0201抗血清进行免疫印迹鉴定HLA-A*1101-BSP的表达水平。将初步纯化的HLA-A*1101-BSP与β2-微球蛋白(β2m)和HCMV抗原肽pp6516-24(GPISGHVLK,简称GPI)一起利用稀释法进行重折叠复性,获得可溶性HLA-A*1101-GPI单体,经生物素化和纯化后,与Streptavidin-PE结合成四聚体。流式细胞仪分析显示HLA-A*1101-GPI四聚体具有与特异性细胞毒T细胞(CTL)的结合活性,表明成功获得可溶性HLA-A*1101-GPI四聚体,为研究HLA-A*1101限制性CTL的免疫应答打下基础。     

Construction and Functional Test of HLA-A＊2402-Peptide Tetramer

HLA-A~*2402 is one of the most frequent HLA-A allele in Asian population.To construct HLA-A~*2402-peptidetetramers,the transmembrane and intracellular segments of HLA-A~*2402 cDNA were replaced with BSP sequenceto form a fusion gene of sHLA-A~*2402-BSP.The sHLA-A~*2402-BSP fusion protein and β2m were high-levelexpressed as insoluble aggregates in E.coli,and refoided to form an HLA-A~*2402-peptide monomeric complex bydilution method in the presence of an antigenic peptide.The HLA-A~*2402-peptide monomeric complex wasbiotinated and tetramized to prepare HLA-A~*2402-peptide tetramer.Then using the HLA-A~*2402-peptidetetramers to detect antigen-specific cytotoxic T lymphocyte(CTL)induced by artificial antigen presenting cell(aAPC)in vitro.The results showed that HLA-A~*2402-peptide tetramer was prepared correctly,and functional indetecting antigen-specific CTL in vitro,HLA-A~*2402-peptide monomeric and its multimeric complexes areexpected to provide a powerful tool for studying mechanisms of immune-related diseases in Asian populations.Cellular & Molecular Immunology.2005;2(2):145-149.     

A PCR-SSP method to specifically select HLA-A*0201 individuals for immunotherapeutic studies

HLA-A*0201 is an important restriction element for peptide presentation to T cells in disease and cancer. Mutation studies and analyses using cytotoxic T lymphocytes have shown the functional relevance of subtype-specific differences in HLA-A2 molecules for peptide binding and T-cell receptor recognition. Therefore, many immunotherapeutic studies need to accurately select HLA-A*0201-positive individuals. We designed an easy, robust approach based on the polymerase chain reaction using sequence-specific primers (PCR-SSP) to specifically distinguish A*0201-positive individuals from other HLA-A2 subtypes described to date. The first step includes reactions that give information whether the sample donor is HLA-A2 and, if so, whether the individual is homozygous or heterozygous for HLA-A2. Further, it is determined whether the sample has an HLA-A*0209 or an HLA-A*0201 sequence at the corresponding position in exon 4. Samples that may contain an HLA-A*0201 allele according to the results of this first step are subtyped in a second step nested PCR. Here the strategy is focussed on the discrimination of HLA-A*0201 from the other subtypes by considering divergent nucleotide positions in two ways. One SSP combination amplifies the HLA-A*0201 sequence while a corresponding SSP combination specifically amplifies the subtype or group of subtypes differing from HLA-A*0201 at this position. Thus, at relevant polymorphic nucleotide positions the HLA-A*0201 sequence is both directly and indirectly confirmed. This strategy strongly enhances the reliability of the subtyping and allows better verification of HLA-A*0201-positive patient selection for clinical studies.     

基于SCORE函数估算HLA-A*0201限制性CTL表位亲和性

目的 建立HLA-A*0201限制性CTL表位亲和性的定量预测方法。方法基于SCORE打分函数,运用定量构效关系的理论和方法研究了HLA-A*0201限制性CTL表位九肽结构与亲和性间的定量关系,并建立了SCORE得分与亲和性的定量关系模型,并用外部样本(5个HLA-A*0201限制性CTL表位九肽)作为预测集用于检验模型的预测能力。结果基于SCORE打分函数建立的定量模型具有较好的相关性(r=0．9165,RMS=0．38)和对外部样本的预测能力(rpred=0.9847,RMS=0.135)。结论基于SCORE打分函数,运用定量构效关系研究的理论和方法建立了HLA-A*0201限制性CTL表位亲和性的定量预测方法,为实验鉴定高亲和性HLA-A*0201限制性CTL表位提供了理论依据。     

整合法预测HBV相关抗原的HLA-A* 0201限制性结合肽

目的 预测HBV的相关抗原HBsAg、HBcAg、DNA polymerase新的HLA-A*0201限制性结合肽.方法 选取SYFPEITHI、BIMAS、SVMHC、IEDB、EpiJen预测工具以及整合法预测抗原对应蛋白序列P03146,P03138,P03156的HLA-A*0201限制性结合肽,并与现有表位数据库中的结合肽比较.结果 整合法与单个预测算法相比提高了预测的灵敏度和特异性,对3种抗原的预测准确性均有提高,MR(misclassification rate)值分别降为1.14%、3.41%、1.46%;利用此方法发现3种抗原尚未得到实验验证的HLA-A*0201结合肽,分别为,HBcAg:ELMTLATWV(64-72)、LMTLATWVGV(65-74);HBsAg:LMT-LATWVGV(246-254)、IIFLFILLL(244-252)、FLFILLLCU(246-255)、SLYSILSPFL(367-375)以及LLCLIFLLvL(251-260);DNA polymerase:SLFTAVTNFL(513-522)、GLLGFAAPFT(554-563);在HBsAg蛋白序列中发现了31个氨基酸的免疫热点区域FIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLI(243-273).结论 整合法比单个预测算法性能更好,能够更准确地预测抗原的HLA限制性结合肽,采用该方法所发现的9条可能表位和1个免疫热点区域为后续HBV新表位的鉴定及其功能研究提供了有价值的线索.     

HLA-A*0206-BSP和-A*0207-BSP融合基因的构建与表达

采用RT-PCR技术从HLA-A*0206和-A*0207阳性个体的PBMC中分别克隆出HLA-A*0206和-A*0207基因的全长cDNA序列,构建HLA-A*0206和-A*0207克隆载体。再利用PCR技术从构建的克隆载体中扩增HLA-A*0206和-A*0207的α链(重链)胞外段序列,分别经双酶切置换本室保存的HLA-A*0201-BSP重组体中的HLA-A*0201胞外段序列,使HLA-A*0206和-A*0207与BirA酶底物肽(BirA substrate peptide,BSP)序列融合,构建HLA-A*0206-BSP和-A*0207-BSP融合基因的表达载体,经限制性酶切和DNA测序证实。然后将该表达载体转化E.coliBL21(DE3)后获得表达产物,通过体外稀释复性,初步纯化的表达产物通过ELISA和Western blot检测证明能够与β2微球蛋白(HLA I类分子轻链)及HLA-A2限制性抗原肽(HBV core 18-27)折叠形成具有HLA I类分子天然构象的抗原肽/HLA-A2复合物单体。为进一步构建HLA-A*0206和-A*0207四聚体,探讨相应HLA-A2亚型的功能特点提供了物质基础。     

CT抗原KM-HN-1 HLA-A * 0201限制性表位预测及其与HLA-A * 0201结合强度分析

目的通过对CT抗原（cancer-testis antigen）KM-HN-1进行HLA-A＊0201限制性表位预测,并对候选表位肽与HLA-A＊0201分子结合亲和力及复合物稳定性进行分析,为探索基于KM-HN-1的免疫治疗奠定基础。方法利用基于蛋白酶体剪切位点特异性的算法PAProc及基于肽MHC-I结合的算法BIMAS和SYFPEITHI对KM-HN-1进行HLA-A＊0201限制性表位预测．合成KM-HN-1相关候选表位肽KM-HN-I321-329（KLLPFRETV）,KM-HN-I303-211,（FLPTAPPNV）,KM-HN-I629-637。（TLLQIIETV）,KM-HN-I87-95（ILNKSIIEV）,KM-HN-I538-596。（QMMEALDQL）及阳性对照肽HBVcAg18-27（FLPSDFFPSV）;对这些合成肽与HIA-A＊0201分子结合亲和力及其复合物稳定性根据文献报道的方法进行分析。结果KM-HN-I321-329（KLLPERETV）结合亲和力最低,KM-HN—I203-211（FLPTAPPNV）结合亲和力最高,其余3条肽结合亲和力介于2者之间;稳定性实验（DC50）结果显示：KM-HN-I538—546（QMMEALDQL）DC50小于2h,KM—HN-I321-329（KLLPERETV）的DC50介于2～4h之间,KM-HN-I87-95。（ILNKSIIEV）的DC50介于6～8h之间,KM-HN-I233-211（HLPTAPPNV）及KM-HN-I629—633（TLLQIIETV）的DC50均大于8h。结论基于蛋白酶体剪切位点特异性的算法及基于肽MHC-I结合的算法对KM-HN-1进行HLA-A＊0201限制性表位预测,结合候选表位肽与HLA-A＊0201分子结合的亲和力与复合物稳定性实验分析,为该抗原HLA-A＊0201限制性表位的鉴定奠定了基础。