阳离子脂质体介导端粒酶反义寡核苷酸促进对HeLa细胞生长的抑制作用

目的 考察阳离子脂质体(CL)为载体的反义寡核苷酸(ASODN)序列对HeLa细胞的抑制作用.方法 选择以人端粒酶模板RNA(hTR)和人逆转录酶催化亚基(hTERT)为靶点的两种ASODN,用3β[N-(N‘,N‘-二甲氨基乙基)氨甲酰基]-胆固醇(DC-Chol)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)制备CL,考察其形态和粒径分布,并用其介导反义寡核苷酸转染HeLa细胞,通过噻唑蓝比色法(MTT)研究对细胞的抑制作用.结果 CL外观呈圆形,粒径均匀,在体外能够有效转染反义hTR和反义hTERT寡核苷酸序列(anti-hTR,anti-hTERT).CL/ASODN处理后的HeLa细胞,72 h后的存活率为(19.82±12.19)%(antihTR,2.0 μmol·L-1)和(16.59±4.10)%(anti-hTERT,2.0 μmol·L-1),而相同浓度游离的ASODN没有发现抑制作用.CL/ASODN复合物能够在120 h内持续抑制HeLa细胞的生长.结论 CL能够有效提高ASODN对HeLa细胞的抑制作用,作为端粒酶抑制剂的新型非病毒载体,具有良好的应用前景.     

脂质体介导hTERT反义寡核苷酸对HL60细胞增殖及凋亡的影响

目的 研究经脂质体介导转染端粒酶逆转录酶(hTERT)反义寡核苷酸(ASODN)对HL-60细胞增殖、凋亡的影响.方法 运用四唑盐比色(MTT)法检测HL-60细胞的增殖、Annexin VFITC/PI双标记法细胞早期凋亡流式检测法检测HL-60细胞的凋亡.结果 hTERT ASODN组(终浓度10 μmol/L)、脂质体介导hTERT ASODN组(终浓度0.5 μmol/L)均能抑制HL60细胞增殖,诱导HL-60细胞凋亡,两组比较差异无显著性.各ASODN组对HL-60的抑制作用及诱导凋亡作用均弱于阿糖胞苷(终浓度10 μmol/L)(P<0.01).结论 脂质体的介导增强了hTERT AS0DN抑制HL-60细胞增殖及诱导凋亡的作用效果.脂质体介导hTERT ASODN有可能成为化疗外治疗急性白血病的有益补充.     

阳离子脂质体介导的TGFβ1反义寡核苷酸对大鼠肝脏星状细胞激活的抑制作用

为探讨阳离子脂质体介导的TGFβ1反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides, ASON)对大鼠肝脏星状细胞激活及其胶原生成的作用,作者合成了特异性的针对TGFβ1 mRNA转译起始区的硫代磷酸ASON及其对照(正义、错义寡核苷酸),并和阳离子脂质体形成复合物.通过测定细胞内32P标记的ASON的放射量来观察ASON的细胞摄入率,用细胞免疫化学分析α-SMA的表达来观察星状细胞的激活 .结果显示:阳离子脂质体可以明显增加TGFβ1 ASON的细胞摄入率(P＜0.05);阳离子脂质体-TGFβ1 ASON复合物和单独使用TGFβ1 ASON相比,在相同浓度下(ASON浓度为1μmol/L)可以明显增高ASON对星状细胞激活的抑制作用,而单独使用阳离子脂质体或阳离子脂质体-正义或错义TGFβ1寡核苷酸复合物在相同浓度下未见抑制效应.ASON或阳离子脂质体-ASON复合物均无细胞毒性作用.由此提示,阳离子脂质体-ASON复合物可能发展成一种治疗肝纤维化的药物.     

阳离子脂质体介导的反义c-myb寡核苷酸对脑胶质瘤生长的抑制作用研究

目的　观察阳离子脂质体 lipofect AMINE介导的反义 c- myb寡核苷酸 (L ipo AON)对肿瘤生长的影响。方法　取雄性 Wistar大鼠 48只 ,行脑内 C6胶质瘤接种 ,术后 6天 ,将携瘤大鼠随机分成 L ipo AON组、反义 c- myb寡核苷酸组 (AON组 )、阳离子脂质体 lipofect AMINE组 (L ipo组 )和生理盐水对照组 (NS组 ) ,每组各 12只。经大鼠右股静脉给药 ,间隔 1天后 ,再次用同法经大鼠左股静脉等量给药。给药后严密观察各组大鼠饮食、四肢活动及体重变化情况 ,并于给药后第 4天和第 10天每组分别处死 6只大鼠 ,进行肿瘤的生长情况和大体形态学观察。结果　 L ipo AON组在静脉给药期间及停药后的短期内其肿瘤生长被明显抑制 ,c- m yb表达下调 ;而 AON组、L ipo组与 NS组相比 ,其肿瘤生长未见抑制现象 ,c- myb表达亦未见下调。但随着停药时间的延长 ,L ipo AON对肿瘤的抑制作用下降。结论　 1阳离子脂质体 L ipofect AMINE作为 c- m yb AON转移载体 ,使水溶性 c- myb AON容易透过 BBTB进入瘤内发挥治疗作用 ,且具有操作简单、安全、转染率高等特点 ;2 L ipo AON对 C6胶质瘤生长有明显抑制作用 ,用反义技术抑制 c- myb的表达在胶质瘤的治疗中具有研究前景 ;3 L ipo AON对胶质瘤生长的抑制作用随时间延长而下降 ,如何让     

脂质体介导的c-myc反义硫代寡核苷酸诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡

目的　探讨c myc反义硫代寡核苷酸 (antisensephosphorothioateoligodeoxynucleotide ,APSODN)对胃癌SGC 790 1细胞凋亡的影响。方法　人工合成c mycAPSODN ,通过脂质体转染法处理人胃癌细胞系SGC 790 1后 ,于不同时间收集细胞 ,采用Northernblot、Westernblot检测c myc基因mRNA及蛋白表达 ,采用TUNEL方法检测凋亡指数 ,以流式细胞仪检测细胞周期。结果　TUNEL显示c mycAPSODN可诱导胃癌SGC 790 1细胞凋亡 ,并与APSODN的浓度和处理时间有关。流式细胞仪检测显示细胞阻滞于G0 /G1期。结论　c mycAP SODN可诱导胃癌细胞凋亡。     

乳腺癌细胞中CD_(44)的表达及其反义寡核苷酸抑制乳腺癌细胞粘附侵袭的相关研究

乳腺癌是我国女性常见的恶性肿瘤,近年来发病率呈上升趋势，在上海已经成为女性恶性肿瘤之首，而且发病年龄趋于年轻化。远处转移是乳腺癌患者的主要死亡原因，CD44是一个近年来倍受关注的与肿瘤细胞侵袭转移相关的细胞表面粘附分子．它主要介导细胞与细胞，细胞与基质之间的粘附，进而参与肿瘤的侵袭和转移。我们尝试以CD44反义寡苷酸（antisense oligodexynucleotide，ASON）体外转染乳腺癌细胞系MCF-7，观察其对癌细胞粘附和侵袭能力的影响。     

卵巢癌细胞体外粘附腹膜模型的建立及CD44表达对粘附能力影响的研究

研究卵巢癌细胞表达ＣＤ４４与其粘附腹膜能力的关系。方法建立卵巢癌细胞体外粘附腹膜模型,比较３ＡＯ细胞和Ｍ９５１细胞的粘附差异,并用抗ＣＤ４４单抗和秀明质酸酶进行阻断实验。结果腹膜上的透明质酸和卵巢癌细胞上的ＣＤ４４分子与癌细胞的粘附能力密牙亲。结论卵巢癌细胞上的ＣＤ４４分子参与了其粘附腹膜的过程。     

MMP7反义寡核苷酸对肺腺癌A549细胞粘附和侵袭能力的影响

目的:观察基质溶解素(Matrilysin,MMP7)反义寡核苷酸(Antisense oligodeoxynucleotide)对肺腺癌A549细胞体外粘附和侵袭能力的影响.方法:采用硫代磷酸修饰的MMP7 ASODN,通过脂质体导入A549细胞,RT-PCR检测MMP7 mRNA表达;平板粘附模型和Boyden chamber模型比较A549细胞的粘附和侵袭能力.结果:MMP7 ASODN转染A549细胞后,与未转染组和脂质体组比较,RT-PCR电泳条带相对光密度值显著降低(P<0.01).粘附于平板和穿过Boyden chamber的细胞数有明显下降(P<0.01).结论:MMP7 ASODN可以有效抑制肺腺癌A549细胞株MMP7基因的表达,降低细胞粘附和侵袭能力.     

阳离子脂质体对反义寡核苷酸抗乙型肝炎病毒作用的促进

目的 :考察阳离子脂质材料 3β [N (N′,N′ 二甲基胺乙基 )胺基甲酰基 ]胆固醇 (3β [N (N′,N′ dimethylaminoethane) carbamoyl]cholesterol,DC chol)与反义寡核苷酸 (antisenseoligodeoxynucleotide ,asODN)的结合能力及asODN阳离子脂质体的细胞毒性和抗病毒活性。方法 :以DC chol从水相中萃取asODN的萃取率评价不同条件下DC chol与asODN的作用力 ;通过四唑盐比色法检测含DC chol的阳离子脂质体对HepG2 2 .2 .1 5的细胞毒性 ;以酶联免疫法 (ELISA)检测细胞上清培养液中HBsAg和HBeAg的含量 ,考察不同asODN阳离子脂质体的抗病毒活性。结果 :当正负电荷比 >0 .6时 ,DC Chol能有效的从水相中萃取asODN (萃取率 80 %～ 1 0 0 % ) ;碱性条件和强离子 (Na+ /Cl-)的存在不利于DC Chol与asODN的作用 ;DC chol阳离子脂质体具有一定的细胞毒性 ,在低质量浓度时 (0 .84～ 2 6 .94mg·L-1 )脂质体的细胞毒性与DC chol浓度成正比 ;当asODN在 1 .2 5～ 5 .0 0 μmol·L-1时 ,其抗病毒活性与剂量相关 ;脂质体可提高asODN对乙肝病毒的抗病毒活性 ,其中阳离子脂质体对asODN抗病毒活性的促进作用较明显 (从 6 0 %到 95 % )。结论 :表面修饰DC Chol阳离子脂质体能有效地促进asODN的抗乙肝病毒活性。     

Effect of CD44 Suppression by Antisense Oligonucleotide on Attachment of Human Trabecular Meshwork Cells to HA

The effects of suppression of CD44 by CD44-specific antisense oligonucleotide on attachment of human trabecular meshwork cells to hyaluronic acid (HA) were observed and the possible relationship between CD44 and primary open-angle glaucoma (POAG) investigated. CD44-specific antisense oligonucleotide was delivered with cationic lipid to cultured human trabecular meshwork cells. The expression of CD44 suppressed by CD44-specific antisense oligonucleotide was detected by RT-PCR and Western blotting. The effect of CD44 suppression by specific antisense oligonucleotide on attachment of trabecular meshwork cells to HA was measured by MTT assay. Results showed that expression of CD44 was suppressed by CD4 , specific antisense oligonucleotide. Antisense oligonucleotide also suppressed the adhesion of human trabecular meshwork cells to HA in a concentration dependent manner. It was concluded that attachment of human trabecular meshwork cells to HA was decreased when CD44 was suppressed by specific antisense oligonucleotide. CD44 might play a role in pathogenesis of POAG by affecting the adhesion of trabecular meshwork cells to HA.     

体外培养人眼小梁细胞黏附分子CD44s的表达

目的 探讨黏附分子CD44s在体外培养人眼小梁细胞（HTC）的表达及其与小梁细胞结构和功能的关系。方法 对体外培养的HTC应用流式细胞术和RT-PCR法检测CD44s的表达。结果 HTC高表达CD44s黏附分子，阳性细胞数达92％以上，而且均表达CD44s mRNA。结论 体外培养的HTC表达CD44s黏附分子。CD44s与其配体透明质酸（HA）的协同性调节HTC的内环境并在维持其结构和功能方面起重要作用。     

人眼小梁网细胞的体外培养

目的 探讨体外培养人眼小梁网细胞的方法并观测其生物学特性。方法 采用组织块培养方法进行体外细胞培养，二甲基噻唑二苯基四唑溴盐比色法、倒置显微镜、透射电镜，免疫细胞化学等方法观察体外培养细胞的生物学特性并进行鉴定。结果 组织块培养7～15d后可见细胞从其边缘向外生长。倒置显微镜下成梭形、圆形、椭圆形、并有多个突起；电镜可见小梁网细胞表面有较多微绒毛，细胞间缝隙连接，胞质内见很多次级溶酶体。免疫细胞化学检测纤维黏连蛋白、层黏连蛋白和神经元特异性烯醇化酶染色阳性。这些特征可与角膜内皮细胞和巩膜成纤维细胞相鉴别。结论 组织培养方法能够成功体外培养人眼小梁网细胞。     

体外培养的人眼小梁细胞的观察

自1986年来，我们共培养99只人眼的小梁组织，原代培养成活率为18.2％，其中供体年龄小于2岁者成活率22.5％；在24h内取材者为27.3％。共传14～16代，细胞生长呈有限性。成活的小梁细胞在第3～7代生长最快，细胞形态与活体小梁细胞相似。研究这些细胞将有助于我们了解小梁细胞形态和功能变化的特点。     

压力对人眼小梁细胞自分泌TGF-β2的影响

目的 采用开放式压力控制培养系统研究压力对体外培养的人眼小粱细胞自分泌转化生长因子-β2（TGF-β2）的影响，探讨TGF-β2在原发开角型青光眼发病机制中的作用。方法 体外培养人眼小梁细胞并传至第5代。对照组不施加压力（0mmHg，1mmHg=0．133kPa），实验组施加20、40、60及80mmHg压力，分别持续0、12、24、36h。采用双抗体夹心酶联免疫吸附（ELISA）法测定细胞上清液中TGF-β2浓度。结果 小梁细胞自分泌TGF-β2随压力增高而增加，与对照组比较，差异有显著性意义（P〈0．05）；在20～60mmHg范围内，加压时间越长，TGF-β2增高越明显；虽然80mmHg压力水平下TGF-β2增高幅度下降，但加压12和24h组TGF-β2水平仍明显高于对照组（P〈0．05）。结论随压力增高，小梁细胞自分泌TGF-β2增多，其水平与压力大小及作用时问相关，推测TGP-β2分泌异常可能是原发开角型青光眼病理进程中的重要机制之一。     

Apoptosis of Human Trabecular Meshwork Cells Induced by Transforming Growth Factor-p2 in vitro

Summary: Whether transforming growth factor-β2 (TGF-β2) induces apoptosis of human trabecular meshwork cells was investigated in vitro. Cultured 3-5 passage human trabecular meshwork cells were treated with 0 (control), 0.32, 1, 3.2 ng/ml TGF-β2 for 48 h and divided into control group and experimental group. The apoptosis of human trabecular meshwork cells was examined by transmisson electron microscopy, TUNEL technique and flow cytometry. The results showed characteristic morphologic changes of apoptotic cells were observed under transmission electron microscopy.DNA fragmentation of human trabecular meshwork cells was found by TUNEL technique. Quantitative analysis of flow cytometry showed that percentages of apoptotic human trabecular meshwork cells were (2.79±0.44) %, (4.43±1.17) % and (9. 60±2.05) % respectively with different concentrations [1 ng/ml (P＜0. 05), 3.2 ng/ml (P＜0.01)] of TGF-β2 with the difference being significant between experimental group and control group[(1. 41±0.34) %]. It was concluded that TGF-β2 can induce apoptosis of human trabecular meshwork cells in vitro and may be involved in the decrease of trabecular meshwork cells in the patients with primary open angle glaucoma and aging of normal people.     

开放式压力控制培养系统对人眼小梁细胞超微结构及纤维连接蛋白合成的影响

目的采用开放式压力控制培养系统，研究压力对人眼小梁细胞（HTMCs）超微结构及纤维连接蛋白（FN）合成的影响。方法组织块法体外培养HTMCs，选取第5代细胞分为实验组和对照组。对照组不施加压力，实验组采用开放式压力控制培养系统分别施加20、40、608、0 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）的压力，压力作用时间分别为12、24、36 h。在光学显微镜、透射电镜下观察HTMCs形态及超微结构的变化。采用免疫组化方法和图像分析法检测FN的表达变化。结果透射电镜显示：20 mmHg压力作用12、24、36 h后与对照组比较，HTMCs超微结构未见明显改变；40mmHg压力作用12、24、36 h后HTMCs胞质内出现大小不等的空泡；60、80 mmHg压力作用12、24、36 h后，HTMCs出现线粒体嵴变得短而少或者丧失、溶酶体髓样结构增多等不可逆性改变。免疫组化结果显示体外培养的HTMCs均阳性表达FN；图像分析显示：20 mmHg压力作用12、24、36 h后HTMCs合成FN与对照组比较差异均无显著性意义（均P〉0.05）；40 mmHg压力作用12、24、36 h后HTMCs合成FN明显增加，差异均有显著性意义（均P〈0.01）；而60、80 mmHg压力作用12、243、6 h后HTMCs合成FN则逐渐下降（均P〈0.01），但与对照组比较仍有不同程度增高（均P〈0.01）。结论环境压力升高可以引起小梁细胞形态、超微结构以及FN的表达发生变化，从而可能在原发性开角型青光眼的发生和发展过程中发挥重要作用。     

体外培养人眼小梁细胞血红素氧合酶-1的表达及其抗氧化损伤作用

目的探讨体外培养人眼小梁细胞是否存在血红素氧合酶-1（HO-1）的表达及其抗氧化损伤作用。方法体外培养人眼小梁细胞，应用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测小梁细胞中HO-1 mRNA的表达，免疫组织化学和Western blot方法对HO-1蛋白进行检测。向细胞培养液中加入H2O2，RT—PCR和Western blot检测小梁细胞HO-1 mRNA和蛋白的变化。分别预先加入HO-1诱导剂氯化血红素（Hemin）和抑制剂锌原卟啉Ⅸ（ZnPP—Ⅸ）1h后，通过MTT法检测小粱细胞在400μmol／L H2O2作用时的存活率。结果人眼小梁细胞存在HO-1 mRNA和蛋白。H2O2对小梁细胞HO-1 mRNA和蛋白的诱导呈浓度依赖性。Hemin可浓度依赖性地提高小梁细胞在H2O2作用时的存活率，HO-1抑制剂ZnPP—Ⅸ则浓度依赖性地降低小梁细胞在H2O2作用时的存活率。结论人眼小梁细胞存在HO—1，并可被H2O2所诱导。HO-1表达升高可提高小梁细胞抗氧化损伤的能力。     

丝裂霉素C对体外培养牛眼小梁细胞毒性的研究

向第3～4代牛眼小梁细胞（bovinetrabecularmeshworkcell，BTMcell）体外培养液内加入不同浓度的丝裂霉素C（MitomycinC，MMC），通过光镜、电镜等观察该药对细胞的形态、结构及吞噬功能的影响.发现MMC可以引起细胞皱缩变形，超微结构中出现线粒体及科面内质网扩张、核固缩或核碎裂等，细胞吞噬微球的数目也有所减少。苔盼蓝染色结果显示MMC不影响小梁细胞存活的浓度为1×10(-7)g／L，半数致死量为1×10(-4)～1×10(-3)g／L。MMC的临床应用是否会对小梁细胞造成损伤值得进一步研究。     

人眼正常前房角小梁网凝集素亲和组化研究

使用七种对N－乙酰氨基葡萄糖或半乳糖有特异亲和性的凝集素，对9只人眼正常小梁网进行亲和组化研究。结果证实人眼正常小梁网细胞外基质和内皮细胞胞浆中，分布有N－乙酰氨基葡萄糖和N－乙酰氨基半乳糖：ConA对N－乙酰氨基葡萄糖的亲和力较强，DBA和PNA对N－乙酰氨基半乳糖的亲和力较强，提示小梁网内皮细胞具有合成氨基己糖多糖的功能，具有同一单糖特异亲和性的凝集素，对小梁网的亲和力有差异。