1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶诱导的帕金森病小鼠模型多巴胺能神经元的缺失方式

目的:观察1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyritine,MPTP)诱导的帕金森病小鼠急性模型与亚急性模型多巴胺能神经元的缺失方式。方法:实验于2004-11/2005-02在华北煤炭医学院解剖教研室实验室完成。①C57bl小鼠30只,随机分为3组:对照组、急性模型组、亚急性模型组,每组10只。②给予模型组小鼠腹腔注射MPTP,其中亚急性组30mg/(kg·d),连用5d;急性组一天内给药4次,每次20mg/kg,间隔时间一两个小时;对照组给予等量生理盐水。③最后一次注射后24h内取脑,制备石蜡切片。应用原位末端标记法、酪氨酸羟化酶、原癌基因蛋白Bcl-2和细胞色素C蛋白免疫组化染色观察多巴胺能神经元凋亡和改变。结果:30只小鼠均进入结果分析。经免疫组化法发现酪氨酸羟化酶、原癌基因蛋白Bcl-2、细胞色素C蛋白染色阳性细胞数在急性模型组与亚急性模型组之间差别具有显著意义[(22.40±2.06),(68.20±3.61)个/切片;(20.60±2.41),(66.80±2.12)个/切片;(93.0±2.24),(23.2±2.58)个/切片,P<0.001]。④应用原位末端标记法在急性模型组未发现凋亡,而亚急性模型组存在凋亡现象。结论:MPTP诱导的帕金森病小鼠急性模型多巴胺能神经元的缺失可能通过坏死实现,而亚急性模型则是通过凋亡来实现的。     

哌替啶类衍生物造模帕金森病小鼠的最佳剂量

目的：比较不同剂量哌替啶类衍生物1-甲基-4-苯基-1,2，3，6-四氧吡啶（1-methy-4-phenyl—1，2，3，6-tetrahydropyfindine，MPTP）建立的帕金森病小鼠模型对小鼠纹状体多巴胺含量的影响。 方法：实验于2003-11／2004-07在北京宣武医院神经生物学实验室完成。选择C57BL/6L。小鼠60只，采用不同剂量MPTP建立帕余森病小鼠模型，随机分6组，MPTP40mg／kg皮下注射1次组10只；MPTP20mg／kg腹腔注射，每2h1次，注射3次组10只；MPTP25mg／kg腹腔注射，每2h1次，注射3次组10只；MPTP45mg／kg皮下注射1次组10只；MPTP35mg／kg皮下注射1次组10只；正常对照组10只。采用Lowry法测定纹状体组织中多巴胺含量／蛋白质含量。 结果：纳入动物60只，52只进入结果分析，其中8只均在处死前死亡。MPTP使小鼠纹状体多巴胺含量显著性下降。正常埘照组多巴胺含量为（136．39&;#177;41．61）μg/g；MPTP35，40，45mg／kg皮下注射1次组分别为（107．97&;#177;26．92），（85．91&;#177;24．60），（74．13&;#177;12．49）μg/g，分别是正常对照组的79．16％，62．99％，54．35％；MPTPP20，25mg／kg腹腔注射每2h1次，注射3次组分别为（44．90&;#177;18.41），（44．30&;#177;29．44）μg／g，分别是正常对照组的32．92％，32．48％。5个模型组与正常对照组比较差异均显著（P〈0．01）。 结论：MPTP20mg／kg腹腔注射每2h1次，注射3次和MPTP40mg／kg皮下注射1次两种模型是对帕金森病不同研究方向的理想模型。     

脑池内预应用肿瘤坏死因子-α对帕金森病小鼠黑质多巴胺神经元的影响及其机制

目的：研究脑池内预应用肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor—alpha，TNF—α)对1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1-methy-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)诱导的帕金森病小鼠黑质多巴胺神经元的影响及可能作用机制。方法：实验于2003—09／2004—03在哈尔滨医科大学动物实验中心及病理实验室进行。以MPTP诱导小鼠帕金森病模型，各干预组脑池内预注入TNF—α(0，1，2，0，100．0ng)，24h后皮下注射MPTP40mg／(kg&;#183;d)，连用5d，并设对照。观察小鼠行为学改变，免疫细胞化学染色法检测黑质区酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元及活化型caspase-3阳性细胞。结果：模型组小鼠黑质TH阳性神经元[(22.429&;#177;7．254)／个]比对照组[(64.286&;#177;13.487)个]明显减少(t=66764，P&;lt;0.001)，模型组与对照组相比活化型caspase-3表达上调(P&;lt;0．001)；各干预组与模型组相比，黑质TH阳性神经元明显减少(P&;lt;0.05)，而且活化型caspase-3阳性细胞表达上调(P&;lt;0．05)。结论：脑池内以TNF—α预处理MPTP小鼠，使黑质多巴胺神经元损伤加重，其途径可能与caspase-3引起的细胞凋亡相关。     

烟酰胺对帕金森病小鼠黑质细胞凋亡的影响

目的：探讨黑质细胞凋亡在帕金森病发病机制中的作用及烟酰胺对帕金森病小鼠黑质细胞凋亡和Bax蛋白表达的影响。方法：给C57BL小鼠腹腔注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)制备帕金森病小鼠模型。利用原位缺口末端标记法(TUNEL)及Bax免疫组化方法观察黑质细胞凋亡情况及烟酰胺干预的影响。结果：帕金森病小鼠黑质致密带可见大量凋亡细胞[(19.43&;#177;3．33)个／视野]Bax蛋白表达(Bax阳性细胞平均灰度值80.59&;#177;3.73)。预先应用烟酰胺能使凋亡细胞减少[(6.33&;#177;2．35)个／视野]，烟酰胺+MPTP甲组与MPTP组间比较差异有显著性意义(q=9．23，P&;lt;0.05)。预先应用烟酰胺也能使Bax蛋白表达降低(Bax阳性细胞平均灰度值107．59&;#177;2.50)，烟酰胺+MPTP组与MPTP组间比较差异有显著性意义(q=7.44，P&;lt;0．05)结论：烟酰胺可降低MPTP诱导的C57BL小鼠黑质细胞Bax蛋白表达，减少黑质细胞凋亡。     

MPTP诱导多巴胺能神经元凋亡规律和尼古丁神经保护作用的研究

目的:探讨1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导小鼠多巴胺能神经元凋亡的规律以及尼古丁对其的保护作用。方法:取28只小鼠(PD组)腹腔注射MPTP 30 mg/(kg·d),共7 d,建立小鼠帕金森病模型;取4只小鼠(Nic组)腹腔注射尼古丁(2 mg/kg,每天5次,共17 d);取4只小鼠(Nic+MPTP组)给予尼古丁预处理和MPTP;取4只小鼠(对照组)仅给予等量生理盐水。应用酪氨酸羟化酶(TH)免疫组织化学染色和TUNEL染色,观察各组黑质多巴胺能神经元数目改变和凋亡细胞的变化规律。结果:慢性MPTP处理过程中,小鼠黑质TH阳性细胞数逐渐减少,于MPTP注射第3天开始出现TUNEL阳性细胞,并于第8天达到高峰。与PD组相比,Nic+MPTP组TH阳性细胞丢失和TUNEL阳性细胞增多的程度显著降低(P<0.05)。结论:采用慢性MPTP处理的模式,可诱导小鼠黑质多巴胺能神经元凋亡;尼古丁对这类神经元具有明显保护作用。     

环氧合酶2表达对帕金森病模型小鼠黑质细胞凋亡的影响

目的：观察环氧合酶2表达对帕金森病模型小鼠中脑黑质细胞凋亡的影响。方法：实验于2005—01／08在华北煤炭医学院解剖学教研室实验室完成。健康雄性C57BL／6N小鼠45只随机分为3组，每组15只。①模型组：皮下注射神经毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢毗啶（1-methyl-4-phenyl—1，2，3，6-tetrahydropyri-dine，MPTP）（30mg／kg，盐水溶），1次／d，连续5d。②环氧合酶2抑制剂组：在MPTP注射前3d经口给予环氧合酶2抑制剂Celecoxib（250mg／kg），1次／d，连续3d，随后在每天注射MPTP前3．0h给予1次Celecoxib，连续5d。③对照组：注射与模型组等体积生理盐水。所有动物于最后一次注射后24h处死。通过免疫组织化学和免疫蛋白印记法，观察帕金森病模型小鼠多巴胺能神经元数量和黑质环氧合酶2、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和多（ADP-核糖）聚合酶免疫反应阳性细胞数量的变化及腹侧中脑环氧合酶2、凋亡蛋白酶活化因子1和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达水平的变化；观察给予环氧合酶2抑制剂Celecoxib后对上述变化的影响。结果：与对照小鼠相比，模型组小鼠多巴胺能神经元数量下降约63％（P〈0．01），黑质环氧合酶2、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和多（ADP-核糖）聚合酶免疫反应阳性细胞数量增加（P〈0．01），腹侧中脑环氧合酶2、凋亡蛋白酶活化因子1和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达水平大幅升高（P〈0．01）。环氧合酶2抑制剂组小鼠黑质多巴胺能神经元数量仅较对照组下降约37％（P〈0．01）。与模型组小鼠比较，黑质环氧合酶2、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和多（ADP-核糖）聚合酶免疫反应阳性细胞数量减少（P〈0．01），腹侧中脑环氧合酶2、凋亡蛋白酶活化因子1和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达水平明显下降（P〈0．01）。结论：帕金森病小鼠黑质细胞凋亡可能与环氧合酶2表达有关；环氧合酶2抑制剂Celecoxib对帕金森病小鼠具有神经保护作用。     

雌激素对MPP诱导的PC12细胞损伤后Bcl-2蛋白含量的影响

目的：观察雌激素在1-甲基-4-苯基-1，2，3．6-四氢吡啶（1-Methyl-4-phenyl-1，2，3,6-tetrahydropyridine，MPP^＋）引起PC12细胞损伤的过程中对凋亡抑制蛋白Bcl-2的影响，从而阐明雌激素对帕金森病的保护作用。 方法：实验于2004—03在华中科技大学同济医学院神经科实验室完成。①细胞分组：对照组；雌激素组；雌激素＋MPP^＋组；MPP^＋组。②帕金森病细胞模型的建立：用250μmol／L的MPP^＋处理细胞，造成细胞凋亡的帕金森模型。（3）应用SABC法检测PC12细胞内的Bcl-2蛋白表达，反转录-聚合酶链反虚检测Bcl-2基因表达产物的mRNA的水平，Westem blot检测Bcl-2蛋白的水平。 结果：①雌激素组Bcl-2阳性PC12细胞平均吸光度（0.438&;#177;0.065）明显高于空白对照组（0．216&;#177;0.067），雌激素＋MPP^＋组（0.283&;#177;0.036），MPP^＋组（0．112&;#177;0．034），SABC显色明显增强（P〈0．05）。②雌激素组Bcl-2基因表达产物的mRNA的水平（1.30&;#177;0．19）明显高于空白对照组（0．70&;#177;0．15），雌激素＋MPP^＋组（0.66&;#177;0.26）。MPP^＋组（0．29&;#177;0.08）（P〈0．05）。③雌激素组Bcl-2蛋白的水平（129&;#177;19）明显高于空白对照组（81&;#177;23），雌激素＋MPP^＋组（72&;#177;12），MPP^＋组（48&;#177;11）；雌激素＋MPP^＋组与空白对照组相比差异无显著性（P〉0．05）。 结论：在MPP^＋对PC12细胞损伤的过程中，雌激素通过促进凋亡抑制蛋白Bcl-2的增高，对神经细胞起保护作用。     

胰岛素对大鼠脑缺血后记忆力损害的保护

目的：观察胰岛素对大鼠脑缺血后酪氨酸羟化酶和多巴胺-β-羟化酶表达及学习记忆能力的影响。方法：实验于2001-01／2003—05在解放军第四军医大学完成。①选用纯种健康雄性SD大鼠54只，随机数字表法分为3组：假手术组6只、缺血对照组24只、胰岛素治疗组24只。Y型迷宫箱（张家港生物医学仪器厂制造，MGM-2型）。②缺血对照组、胰岛素治疗组采用改良四血管闭塞法建立大鼠全脑缺血模型。假手术组仅暴露双侧翼孔及颈动脉，各血管不行闭塞。⑧各组大鼠在麻醉状态下钻开颅骨，于前囟后1．2mm、左旁1．5—nm处用微量加样器进针3．5mm穿刺脑室。成功后胰岛素治疗组于开放动脉夹行再灌注后立即注入1&;#215;10^5U／L的速效基因合成人胰岛素10μL，假手术组、缺血对照组注入等量生理盐水。④分别于全脑缺血再灌注1，3，5d，假手术组（1只／时相点）、缺血对照组（6只／时相点）、胰岛素治疗组（6只／时相点）大鼠断头取脑，行免疫组化染色，光镜下观察海马CA1区神经元酪氨酸羟化酶和多巴胺-β-羟化酶表达的变化。⑤全脑缺血再灌注8周后，用Y型迷宫箱对假手术组（3只）、缺血对照组（6只）、胰岛素治疗组（6只）大鼠的学习记忆能力进行检测，以其测试时达到连续lO次中9次正确反应所需的电击次数表示。并计数海马CA1区正常神经元。结果：实验选用纯种健康雄性SD大鼠54只，全部进入结果分析。①全脑缺血再灌注后不同时间点各组脑海马CA1区神经元酪氨酸羟化酶和多巴胺-β-羟化酶的表达：假手术组海马CA1区神经元酪氨酸羟化酶和多巴胺-β-羟化酶呈阴性表达。缺血对照组于缺血再灌注1d海马CA1区神经元酪氨酸羟化酶和多巴胺-β-羟化酶表达阴性；3，5d时均呈阳性表达。而胰岛素治疗组于缺血再灌注1，3，5d海马CA1区神经元酪氨酸羟化酶和多巴胺-β-羟化酶表达均呈阴性。②全脑缺血再灌注8周后各组大鼠学习记忆能力的变化：胰岛素治疗组记忆力损害较轻，达到9／10正确反应所需电击次数明显少于缺血对照组（9．43&;#177;1.8），（18．6&;#177;2．7）次，P〈0.01]。③全脑缺血再灌注8周后各组大鼠脑海马CA1区正常神经元计数结果：假手术组神经元形态正常，细胞核无固缩或溶解，正常神经元计数为（174.6&;#177;10．7）个／mm。缺血对照组神经元大部分死亡，正常神经元计数为（10．6&;#177;0．6）个／mm。胰岛素治疗组可见部分神经元死亡，死亡神经元胞体缩小或脱失，正常神经元计数为（113．4&;#177;9．1）个／mm，明显高于缺血对照组（P〈0，01）。结论：胰岛素可通过调节儿茶酚胺合成与分解酶系的活性及含量来影响脑组织中单胺类神经递质的成分，纠正其代谢紊乱，减少神经元的凋亡，减轻脑缺血造成的学习记忆能力损害，从而发挥中枢的直接保护作用。     

内毒素预处理对大鼠急性局灶脑缺血的影响

目的：观察经内毒素预处理后急性局灶脑缺血大鼠脑梗死体积、凋亡细胞数和凋亡抑制基因Bel-2蛋白表达的变化。探讨内毒素预处理对急性局灶脑缺血损伤大鼠脑功能的保护作用。方法：实验于2004-11／2005-02在沈阳市第五人民医院动物室完成。采用Haruo Nagasawa法制作大鼠局灶脑缺血模型。将48只健康成年Wistar大鼠随机分为3组：生理盐水对照组、内毒素预处理组、缺血预处理组，每组16只。内毒素预处理组大鼠在局灶脑缺血模型制备前3d，皮下注射内毒素0．05mg／kg；缺血预处理组大鼠在第一次缺血预处理再灌注3d后再次麻醉大鼠，把插线再次推进到第一次插线深度，停留60min后，将线退出；生理盐水对照组大鼠在局灶脑缺血模型制备前3d，皮下注射生理盐水0．2mL。各组大鼠在局灶脑缺血1h再灌注23h后断头取脑，红四氯氮唑染色观察大鼠脑梗死的体积；多聚甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，原位细胞凋亡检测法观察神经细胞凋亡情况，免疫组化染色观察Bel-2蛋白表达的变化。结果：各组大鼠在实验过程中无死亡，均进入结果分析。①红四氯氮唑染色显示缺血预处理组和内毒素预处理组的梗死体积较生理盐水对照组明显减小，差异有显著性意义[（64&;#177;14．74），（71．3&;#177;10．35），（159&;#177;9．79）mm^3,P〈0．01]。②缺血预处理组和内毒素预处理组仅可见散在的凋亡细胞出现于皮质、胼胝体及基底节区。生理盐水对照组梗死灶周围的半暗带内可见大量神经元胶质细胞及部分血管内皮细胞发生凋亡。缺血预处理组和内毒素预处理组梗死灶周围的凋亡细胞数较生理盐水对照组明显减少[（33．5&;#177;7．45），（35．6&;#177;4．18），（57．88&;#177;0．96）个／切片，P〈0．01]。③缺血预处理组和内毒素预处理组缺血侧大脑半球Bel-2阳性细胞数明显增加，生理盐水对照组在缺血侧梗死周边区Bel-2蛋白表达也增加。但缺血预处理组和内毒素预处理组缺血侧大脑半球Bel-2阳性细胞数比生理盐水对照组增加明显[（111．38&;#177;13．59），（105．88&;#177;9．99）（47．5&;#177;11．43），P〈0．01]。结论：小剂量内毒素预处理可以通过调节细胞内凋亡抑制基因Bel-2蛋白的表达诱导抗凋亡，启动内源性保护机制，产生缺血耐受，从而减少梗死面积。     

辅酶Q10对多巴胺损伤的PC12细胞凋亡的影响

目的：观察辅酶Q10在以PC12细胞建立的多巴胺神经元凋亡细胞模型中的作用。 方法：实验于2003-04／2004-04在锦州医学院科技试验中心进行。取体外培养的Pcl2细胞分为3组：①辅酶Q10组：加450μmol／L辅酶Q10和0．3mmol／L多巴胺。②多巴胺组：加0．3mmol／L多巴胺。③空白对照组：只加等量RPM11640。24h后进行流式细胞仪测试DNA含量，检测细胞凋亡率。 结果：多巴胺组细胞凋亡率明显高于空白对照组[（30．66&;#177;1．90）％，（0．82&;#177;0．07）％，P〈0．011，辅酶Q10组细胞凋亡率[（16．05&;#177;2．16）％1明显低于多巴胺组（P〈0．01）。 结论：辅酶Q10能显著降低多巴胺引起的PC12细胞凋亡，提示辅酶Q10作为神经保护性药物对保护多巴胺能神经元，防治帕金森病可能有实际应用价值。