犬骨髓基质干细胞体外定向分化为软骨细胞

背景:骨髓基质干细胞的多向分化性不利于向软骨细胞单一方向分化,植入体内后成骨系细胞分泌的骨形态发生蛋白作用于非定向分化的前体细胞,使其向成骨细胞分化,而已定向分化的细胞则不受骨形态发生蛋白的影响,形成相应的组织.目的:体外诱导犬骨髓基质干细胞定向分化为软骨细胞,探讨体外诱导成软骨的方法和条件.设计、时间及地点:单一样本观察,于2005-03/2006-01在中山大学组织工程实验室完成.材料:选取4个月龄雄性家犬1只,骨髓基质干细胞取自犬肋骨.方法:自犬肋骨取骨髓2.0～3.0mL行体外原代骨髓基质干细胞分离培养.8～11d细胞接近融合时,加入胰酶消化,用含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM合成培养液终止消化,收集细胞悬液,离心后,用培养液悬浮细胞,按1:3接种传代.取第3代细胞培养扩增,换液时加入10μg/L碱性成纤维细胞生长因子2mL,换液2次后,再加入1mg/L转化生长因β1 2mL诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化.主要观察指标:行甲苯胺蓝、阿新蓝染色检测软骨基质的分泌,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达.结果:骨髓基质干细胞体外行原代和传代培养至P4代生长良好,经碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因β1扩增诱导的细胞甲苯氨蓝异染性、阿新蓝染色阳性;Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性,显示被诱导的骨髓基质干细胞具备软骨细胞特性.结论:应用碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因β1体外可以诱导犬骨髓基质干细胞分化为软骨细胞,诱导的软骨细胞可作为软骨组织工程较理想的种子细胞.     

转化生长因子β3诱导骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞

背景: 转化生长因子β是一族多肽类生长因子,胚胎形成期可诱导原始的间充质干细胞分化形成软骨组织,有研究报道转化生长因子β3和碱性成纤维细胞生长因子可促进软骨细胞的代谢和增殖.目的: 验证转化生长因子β3体外诱导骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的可行性.方法: 骨髓来源于髋关节手术时的松质骨碎片或于下肢骨开放性手术时收集,分离培养骨髓间充质干细胞,鉴定其表面抗原,用含体积分数10%胎牛血清以及10μg/L转化生长因子β3的条件培养基诱导,诱导后细胞通过软骨细胞特征性染色,即甲苯氨蓝染色以及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色鉴定.结果与结论: 骨髓间充质干细胞表面抗原CD73,CD90,CD105阳性,CD14,CD34,CD45,CD106以及HLA-DR阴性.诱导后细胞形态明显改变,甲苯氨蓝以及Ⅱ型胶原染色结果阳性.提示骨髓间充质干细胞在转化生长因子β3作用下,体外可分化为软骨细胞,可以作为组织工程种子细胞的一种有效来源.     

茶黄素和转化生长因子β1对兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞增殖及诱导分化的影响

背景:已有大量的实验报道,转化生长因子β1能体外促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞转化,而茶黄素在细胞转化过程中起重要作用.目的:拟验证在茶黄素和转化生长因子β1的协同作用下,骨髓间充质干细胞向软骨细胞转化是否优于单纯使用转化生长因子β1.设计、时间及地点:干细胞生物学实验,于2008-05/08在安徽省立医院中心实验室完成.材料:健康8剧龄新两兰人白兔,获取骨髓间充质干细胞进行分离和原代培养.方法:取第3代骨髓间充质干细胞,分为3组:对照组:完全培养基加地塞米松108mmol/L、维生素C10 mmol/L.转化生长因子组:完全培养基加地塞米松10-8mmol/L、转化生长因子β15 μg/L、维生素C10 mmol/L.茶黄素组:完全培养基加地塞米松108mmol/L、转化生长因子β1 5 ng/mL、维生素C10 mmol/L、茶黄素30 mg/L.主要观察指标;倒置显微镜下观察细胞生长状况及形态变化,甲苯胺蓝染色、阿利新蓝比色法测定各板每孔中葡萄糖氨基聚糖含量、免疫检测仪测定3组的吸光度值.结果:骨髓中分离获得的骨髓间充质干细胞在体外增殖旺盛,转化生长因子β1和茶黄素诱导后细胞生长明显减缓.加入诱导液后,转化生长因子组和茶黄素组,可见细胞小结形成,茶黄素组细胞小结明显增多并在局部形成多个呈放射状细胞集落,而对照组未见明显变化.免疫组化染色后转化生长因子组细胞呈阳性、茶黄素组细胞呈强阳性,对照组未见阳性细胞.与对照组比较,转化生长因子组、茶黄素组吸光度值明显增(P＜0.01),茶黄素高于转化生长因子组(P＜0.05),差异有统计学意义.结论:茶黄素在转化生长因子β1存在的条件下能有效促进骨髓间充质干细胞在体外向软骨细胞分化.     

骨髓间充质干细胞和关节软骨细胞共培养与转化生长因子β1诱导的比较

背景:应用生长因子可诱导骨髓间充质干细胞向软骨样细胞分化,但诱导后的细胞在生物体内很难形成成熟的软骨细胞且仍具有分泌软骨基质及抗压,抗摩擦的能力.目的:对比分析骨髓间充质干细胞与关节软骨细胞共培养诱导、转化生长因子β1诱导骨髓间充质干细胞的效果.方法:提取SD大鼠关节软骨细胞与第3代骨髓间充质干细胞,按1:2,1:1,2:1浓度比种植于Transwell共培养系统中.同时设置转化生长因子β1诱导组为对照.相差显微镜下观察细胞的增殖和基质合成情况,并诱导结果行MTT比色法检查、氨基聚糖水平检测及Western Blot检测II型胶原基因的表达情况.结果与结论:关节软骨细胞与骨髓间充质干细胞1:2比例诱导的结果与10 μg/L转化生长因子β1诱导结果相当,但随着关节软骨细胞在诱导中体系中比例的增加,诱导结果明显优于转化生长因子β1诱导,当诱导细胞达到一定比例时,诱导结果不会随之变化.说明软骨细胞与骨髓间充质干细胞共培养可以诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞转化,在开始时,诱导结果与软骨细胞所占的比例成正相关,当软骨细胞达到一定比例时, 骨髓间充质干细胞的诱导结果并未发生明显变化,提示骨髓间充质干细胞对软骨细胞的诱导存在饱和现象.     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化软骨细胞表型的可行性

目的：探讨在体外特定培养条件下诱导绵羊骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞表型的可行性。 方法：实验于2005—09／2006—02在首都医科大学细胞与遗传实验室完成。选择1岁龄骨骼成熟的健康绵羊，雌雄不拘，体质量20—30kg。①采用Percoll分离液，经密度梯度离心法自成年绵羊髂骨骨髓分离得到间充质干细胞，体外培养至第3代时，将骨髓间充质干细胞分为2组，实验组细胞贴壁后更换培养液，以无血清H—DMEM特定培养液诱导（内含转化生长因子β3 10μg/L、地塞米松10^-7mol／L、胰岛素样生长因子I10μg/L、维生索C50mg／L），对照组加含10％胎牛血清的L—DMEM培养液，3d换液一次。②在相差显微镜和透射电镜下观察细胞形态和超微结构，分别在诱导后的第7天、14天取出玻片，进行细胞形态学、组织化学和免疫组织化学分析，甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴定间充质干细胞诱导后的软骨细胞表型。 结果：①相差显微镜观察实验组诱导14d后，细胞形态由梭形逐渐向多角形、多边形转变。并出现聚集成堆现象，而对照组细胞仍保持均一的梭形，增殖能力非常旺盛。②透射电镜可见实验组诱导14d后的骨髓间充质干细胞周边绒毛增多，胞浆内富含粗面内质网、高尔基体和线粒体，表明细胞合成代谢旺盛。而对照组的骨髓间充质干细胞的细胞壁较光滑，胞核呈条状，核壁有许多皱裴和突起，细胞器也比较丰富。③免疫组织化学观察实验组诱导14d后甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原染色阳性。而对照组诱导14d后甲苯胺蓝染色阳性，Ⅱ型胶原免疫组化染色则为阴性。 结论：骨髓间充质干细胞在特定的诱导条件下能够分化为软骨细胞表型．可为软骨组织工程提供较为理想的种子细胞来源。     

转化生长因子β及周期性拉伸应变条件下骨髓间充质干细胞向软骨样细胞的分化

背景：研究表明转化生长因子β对骨髓间充质干细胞的软骨方向分化具有显著的诱导作用。周期性拉伸应变可以模拟软骨细胞在体内的力学环境,对细胞的增殖和分化起着重要的调节作用。目的：探讨转化生长因子β及周期性拉伸应变在诱导骨髓间充质干细胞向软骨样细胞分化过程中是否具有协同作用。方法：取2月龄新西兰大白兔10只,骨穿针穿入股骨髓腔内,抽取骨髓3.0-4.0 mL并分离培养骨髓间充质干细胞,传至3代后随机分为4组,分别为空白组、转化生长因子β组、周期性拉伸应变组以及周期性拉伸应变＋转化生长因子β组,作用1,3,6 d后取出相应细胞,番红O染色观察大体形态,阿尔新蓝染色检测糖胺聚糖水平,ELISA检测上清液基质金属蛋白酶13及基质金属蛋白酶组织抑制剂1水平,RT-PCR检测Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶13及基质金属蛋白酶组织抑制剂1 mRNA相对表达量。结果与结论：番红O染色可见细胞呈长梭形或不规则三角形样改变,各实验组较空白组细胞数量及基质分泌增多。作用第3天时转化生长因子β组、周期性拉伸应变＋转化生长因子β组上清液糖胺聚糖水平较空白组均升高（P＜0.05）,周期性拉伸应变＋转化生长因子β组Ⅱ型胶原mRNA相对表达量较空白组增高（P ＜0.05）。结果提示转化生长因子β及周期性拉伸应变均可诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化,二者具有明显的协同作用。     

转化生长因子β3诱导藻酸钠微球内骨髓间充质干细胞向软骨细胞定向分化过程中胰岛素样生长因子Ⅰ的协同效应

背景: 近年来利用藻酸盐微球包被骨髓间充质干细胞进行软骨细胞定向诱导逐渐开展.目的: 采用体外藻酸钠微球三维立体培养骨髓间充质干细胞,观察转化生长因子β3在诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化过程中胰岛素样生长因子Ⅰ的作用.设计、时间及地点: 细胞组织工程体外实验,于2007-03/10在武汉大学口腔医学院口腔生物医学工程教育部重点实验室完成.材料: SPF级1月龄雄性Wistar大鼠7只用于制备骨髓间充质干细胞.藻酸钠盐、胰岛素样生长因子Ⅰ,转化生长因子β3均为Sigma公司产品.方法: 第5代骨髓间充质干细胞以3X109>L-1密度重悬于1.2%藻酸钠盐溶液中,用22号针头将该溶液缓慢滴加在100mmol/L氯化钙溶液中使其聚合形成凝胶,10min后洗涤微球2次,即为包被骨髓间充质干细胞的藻酸盐微球.联合组加入含100μg/L胰岛素样生长因子Ⅰ、10μg/L转化生长因子β3的软骨诱导培养基,诱导3周.同时设立胰岛素样生长因子Ⅰ组、转化生长因子β3组、空白对照组.主要观察指标: 甲苯胺蓝染色检测细胞外基质的形成,RT-PCR法及免疫组织化学法检测Ⅱ型胶原和Aggrecan的表达,Western blot检测Sox9蛋白表达及其与PCR产物的相关性.结果: 包被于藻酸盐微球的骨髓间充质干细胞经胰岛素样生长因子Ⅰ、转化生长因子β3联合诱导3周,细胞周围有大量均质蓝染物质.联合组Ⅱ型胶原和Aggrecan mRNA及蛋白表达水平最高,转化生长因子β3组表达居中,胰岛素样生长因子Ⅰ组表达较弱,空白对照组几乎无表达(F=10.52,P<0.01).各组Sox9蛋白表达水平与上述指标类似(F=7.95,P<0.05),Sox9与Ⅱ型胶原、aggrecan的相关系数分别为0.95和0.91.结论: 体外定向诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的过程中,胰岛素样生长因子Ⅰ可能通过促进Sox-9的表达来起到与转化生长因子β3的协同效应.     

胰岛素生长因子对骨髓基质细胞增殖和向成骨细胞分化的调节

目的:观察胰岛素生长因子对骨髓基质细胞向成骨细胞分化的调节作用。方法:实验于2005-11/2006-04在广东医学院附院中心实验室进行。①实验材料:重组胰岛素生长因子(GIBCO),DEME培养基(GIBCO),胰蛋白酶(GIBCO),胎牛血清(杭州四季青),二甲基亚砜(sigma),四甲基偶氮噻唑盐(sigma),碱性磷酸酶试剂盒(长城临床试剂公司),骨钙素试剂盒(天津九鼎)。SD大鼠由广东医学院动物部提供。②实验方法:骨髓基质细胞的分离:将SD大鼠处死后,无菌条件下取出动物的双侧股骨和胫骨,分离培养骨髓基质细胞。骨髓基质细胞成骨诱导条件:取第2代骨髓基质细胞,用含体积分数为0.1胎牛血清、50mg/L维生素C、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、10-8mol/L地塞米松、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素成骨诱导培养液培养,置37℃、体积分数为0.05CO2饱和湿度培养箱内孵育。倒置显微镜观察细胞生长状况。③实验分组:将第3代骨髓基质细胞随机分为对照组和实验组。细胞增殖实验:取第3代生长良好的骨髓基质细胞,密度调整至4×106L-1。实验组加入含1,10,20μg/L胰岛素生长因子诱导培养液,对照组加不含胰岛素生长因子诱导培养液。培养1,3,5,7d后采用MTT法检测细胞增殖水平。用碱性磷酸酶试剂盒在全自动生化分析仪上测定细胞内碱性磷酸酶活性。④实验评估:采用RI测定上清液中骨钙素含量。观察胰岛素生长因子对骨髓基质细胞增殖和向成骨细胞方向分化的调节作用。结果:①MTT法测骨髓基质细胞增殖情况:与对照组相比,实验组具有明显促进骨髓基质细胞增殖作用(吸光度值:1d,0.442±0.002,0.498±0.009,0.546±0.004,0.553±0.005;3d,0.571±0.008,0.604±0.007,0.682±0.006,0.694±0.009;5d,0.623±0.003,0.659±0.004,0.793±0.008,0.807±0.007;7d,0.792±0.008,0.810±0.006,0.912±0.003,0.923±0.004,P<0.05)。20μg/L胰岛素生长因子与10μg/L胰岛素生长因子组的作用效果差异无显著性意义(P>0.05)。实验组随时间延长,对骨髓基质细胞均有明显促进作用。②骨髓基质细胞内碱性磷酸酶、骨钙素合成的变化:实验组细胞胞浆内碱性磷酸酶明显高于对照组,差异有显著性意义(t=3.08,P<0.05)。实验组细胞胞浆内骨钙素明显升高,是对照组的1.8倍,差异有显著性意义(t=2.82,P<0.05)。结论:适当质量浓度胰岛素生长因子能促进经诱导分化骨髓基质细胞的增殖和向成骨细胞方向的分化。     

茶黄素和转化生长因子β1对免骨髓间充质干细胞向软骨细胞增殖及诱导分化的影响

背景：已有大量的实验报道,转化生长因子β1能体外促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞转化,而茶黄素在细胞转化过程中起重要作用。目的：拟验证在茶黄素和转化生长因子β1的协同作用下,骨髓间充质干细胞向软骨细胞转化是否优于单纯使用转化生长因β1。设计、时间及地点：干细胞生物学实验,于2008-05／08在安徽省立医院中心实验室完成。材料：健康8周龄新西兰大白兔,获取骨髓间充质干细胞进行分离和原代培养。方法：取第3代骨髓间充质干细胞,分为3组：对照组：完全培养基加地塞米松10μmmol／L、维生素C10mmol／L。转化生长因子组：完全培养基加地塞米松10μmmol／L、转化生长因子β1 5μg／L、维生素C10mmol／L。茶黄素组：完全培养基加地塞米松10^-8mmol／L、转化生长因子B15ng／mL、维生素C10mmol／L、茶黄素30mg／L。主要观察指标：倒胃显微镜下观察细胞生长状况及形态变化,甲苯胺蓝染色、阿利新蓝比色法测定各板每孔中葡萄糖氨基聚糖含量、免疫检测仪测定3组的吸光度值。结果：骨髓中分离获得的骨髓问充质干细胞侄体外增殖旺盛,转化生长因子β1和茶黄素诱导后细胞生长明显减缓。加入诱导液后,转化生长因子组和茶黄素组,可见细胞小结形成,茶黄素组细胞小结明显增多并在局部形成多个呈放射状细胞集落,而对照组未见明显变化。免疫组化染色后转化生长因子组细胞呈阳性、茶黄素组细胞呈强阳性,对照组未见阳性细胞。与对照组比较,转化生长剀子组、茶黄素组吸光度值明显增（P〈0．01）,茶黄索高于转化生长因子组（P〈005）,差异有统计学意义。结论：茶黄素在转化生长因子β1存在的条件下能有效促进骨髓间充质干细胞在体外向软骨细胞分化。     

胰岛素样生长因子1对人脂肪来源的间充质干细胞向软骨细胞定向诱导分化的作用

背景:近年研究者发现胰岛素样生长因子1还可以诱导骨髓来源间充质干细胞向软骨细胞方向分化,但目前尚未见胰岛素样生长因子1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞方向分化及在此过程中与转化生长因子β1相瓦作用的报道.目的:观察胰岛素样生长因子1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞定向分化的可能性及在诱导分化中和转化生长因子β1的相互作用.方法:获取脂肪来源间充质干细胞,以2×10~5 cells/cm~2的密度接种于培养瓶,使用含胰岛素样生长因子1或(和)转化生长因子β1的无胰岛素软骨诱导剂诱导脂肪来源间充质干细胞.2周后获取细胞,制备细胞爬片,进行甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,观察细胞内高硫酸化的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原着色情况.RT-PCR检测Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan及Sox9mRNA的表达.结果与结论:加入诱导剂后,甲苯胺蓝染色显示3个诱导组细胞呈多角形,胞浆及胞膜呈蓝色异染.Ⅱ型胶原免疫组织化学染色显示3个诱导组细胞胞浆及胞膜呈棕黄色着色.RT-PCR检测显示胰岛索样生长因子+转化生长因子组Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan、Sox9 mRNA的表达均显著强于胰岛素样生长因子组和转化生长因子组,胰岛素样生长因子组和转化生长因子组显著强于对照组,而胰岛素样生长因子组与转化生长因子组差异无显著性意义.提示胰岛素样生长因子1可以单独诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞分化,表达软骨细胞特异性细胞表型,胰岛素样生长因子1与转化生长因子β1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞分化有协同作用.