MCPIP1诱导乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞周期停滞

目的研究单核细胞趋化蛋白诱导蛋白1(MCPIP1)在乳腺癌细胞MDA-MB-231中的作用及机制。方法用脂质体转染法转染细胞,在MDA-MB-231中分别过表达,或敲低MCPIP1并筛选稳定表达shRNA的单克隆;MTT法检测细胞增殖;流式细胞计量技术检测细胞周期;实时荧光定量PCR(q-PCR)检测靶基因半衰期;RNA免疫沉淀法(RNA-IP)检测MCPIP1结合的靶基因;荧光素酶报告基因实验检测调节基因3'非编码区(3'UTR)的能力。结果过表达MCPIP1可显著抑制MDA-MB-231细胞增殖(P0.05),敲低MCPIP1显著促进细胞增殖(P0.05);并分别显著增加或降低G1期细胞百分比(P0.01);MCPIP1显著降低细胞周期素依赖性激酶2(CDK2)、细胞周期素依赖性激酶6(CDK6)、cyclin D1和cyclin E1 mRNAs的半衰期(P0.01);MCPIP1结合细胞周期相关基因(P0.05);MCPIP1显著降低含不同3'UTR的报告基因荧光素酶活性(P0.05)。结论MCPIP1在乳腺癌细胞MDA-MB-231中发挥抑癌作用,诱导细胞周期G_1期停滞可能是其发挥抑癌功能的机制之一。     

NOGGIN基因过表达对MDA-MB-231乳腺癌细胞系增殖和侵袭的影响及机制

目的 基因对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、侵袭能力的影响,并初步探讨其机制.方法 表达NOGGIN方法以NOGGIN重组腺病毒感染乳腺癌细胞系MDA-MB-231,MTT法检测细胞增殖能力,划痕修复实验及Transwell细胞侵袭实验检测其运动和侵袭能力,定量RT-PCR和总蛋白Western blot检测CXC...     

NOGGIN基因过表达对MDA-MB-231乳腺癌细胞系增殖和侵袭的影响及机制

目的基因对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、侵袭能力的影响,并初步探讨其机制。方法表达NOGGIN方法以NOGGIN重组腺病毒感染乳腺癌细胞系MDA-MB-231,MTT法检测细胞增殖能力,划痕修复实验及Transwell细胞侵袭实验检测其运动和侵袭能力,定量RT-PCR和总蛋白Western blot检测CXCR4和MMP1的表达。结果过表达NOGGIN基因的MDA-MB-231细胞增殖能力增强(P<0.05);细胞划痕愈合延迟;NOGGIN组穿膜细胞数为79±4,显著低于空病毒组的135±7(P<0.05)。过表达NOGGIN后,细胞中CXCR4和MMP1的表达下调(P<0.05)。结论 NOGGIN蛋白可抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的运动和迁移。其机制可能与下调CXCR4和MMP1的表达相关。     

白花蛇舌草提取物对乳腺癌MDA-MB-231细胞的抑制作用

目的：观察白花蛇舌草提取物对MDA-MB-231细胞的抑制作用。方法：采用CCK-8试剂盒检测白花蛇舌草提取物对MDA-MB-231细胞的抑制作用,HE染色观察细胞形态的变化。结果：白花蛇舌草提取物可抑制MDA-MB-231细胞的增殖,且呈时间-剂量依赖关系;HE染色可见核深染,染色质边集等凋亡形态改变。结论：白花蛇舌草提取物可抑制MDA-MB-231细胞的增殖,其机制可能与诱导凋亡有关。     

负载甘露糖化抗原的DC诱导的特异性杀伤

目的：探讨甘露糖化肿瘤疫苗在抗肿瘤免疫中的作用。方法：纯化出目的蛋白HER-2／neu胞外配体第2结构域（RLD2），并对其进行糖基化修饰，自外周血单核细胞诱导产生CD83^＋的DC，利用DC表面的甘露糖受体，使DC负载甘露糖基化的目的抗原mRLD2（mL2），并致敏T淋巴细胞，观察CTL特异性杀伤SKBR-3细胞的效果。结果：较之未进行糖基化修饰的目的蛋白RLD2（T2），mL2能促进DC的成熟，并能诱导出具有更强杀伤效力的CTL。结论：本实验的结果为开展新型甘露糖化肿瘤疫苗的研制提供了理论依据。     

采用MDA-MB-231细胞膜进行表皮生长因子受体活性的检测

目的　探讨能否直接利用肿瘤细胞膜进行表皮生长因子受体 (Epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)催化活性检测。方法　首先筛选出EGFR基因表达水平相对较高的细胞株MDA MB 2 31,通过差速离心制备细胞膜 ,采用Westernblotting检测EGFR催化磷酸化的程度。结果　底物被磷酸化 ,加入特异性拮抗剂AG14 78后 ,磷酸化被抑制。结论　利用肿瘤细胞膜检测EGFR活性的设想是成立的 ,并且其方法简便、经济。     

干涉lncRNAs HOTAIR对人乳腺癌细胞MDA-MB-231的影响

目的:探讨利用RNA干涉沉默HOTAIR基因对人乳腺癌细胞MDA-MB-231的影响。方法:利用脂质体转染MDA-MB-231细胞;qPCR检测HOTAIR基因的表达;检测EMT相关的Snail蛋白水平的表达;流式细胞术检测凋亡率;MTT法检测细胞增殖。结果:干涉HOTAIR基因后细胞中Snail蛋白表达水平下降,细胞凋亡增加。结论:靶向HO-TAIR的序列特异性siRNA可显著抑制HOTAIR基因的表达;干涉HOTAIR基因表达可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。     

细胞因子诱导杀伤（CIK）细胞的大容量扩增与杀伤活性观察

建立大容量细胞因子诱导杀伤(Cytokine-inducedkiller,CIK)细胞培养方法,观察CIK细胞回输后对患者细胞免疫功能的影响。采用1000ml培养袋大量扩增患者自体CIK细胞,用MTT法检测CIK细胞杀伤活性,比较回输前后患者外周血单个核细胞(PBMNC)对靶细胞的杀伤活性及其毒副作用。结果表明大容量培养法使自体CIK细胞扩增总量达1.6×1010以上,回输CIK细胞使患者PBMNC的杀伤活性明显增加,未出现毒副作用。因此CIK细胞大容量扩增方法在治疗肿瘤微小残留病变上有着良好的临床应用前景。     

优降宁与奥沙利铂协同抑制乳腺癌细胞系MDA-MB-231增殖

目的研究优降宁抑制赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)对奥沙利铂抗人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖作用的影响及其用于抗人三阴性乳腺癌临床研究的潜在价值。方法优降宁和奥沙利铂单独以及联合处理MDAMB-231细胞后,CCK-8法分析细胞增殖; Western blot检测细胞内LSD1表达及其下游底物组蛋白H3K4二甲基化修饰水平、下游基因E-cardherin表达和Bax、Bcl-2及细胞浆内细胞色素C蛋白水平; Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡。结果优降宁能够以时间和剂量依赖性地抑制MDA-MB-231细胞增殖(P0. 05); 1 mmol/L优降宁可显著抑制MDAMB-231细胞内LSD1蛋白的组蛋白去甲基化酶活性(P0. 05); 1 mmol/L优降宁和奥沙利铂联合处理具有抑制MDAMB-231细胞增殖的药物协同效应; 1 mmol/L优降宁显著促进奥沙利铂诱导MDA-MB-231细胞凋亡发生(P0. 05),伴随着Bax基因表达上调、Bcl-2基因表达下调和细胞色素C从线粒体向细胞浆的转移。过表达LSD1则可部分逆转优降宁与奥沙利铂对MDA-MB-231细胞增殖的协同抑制(P0. 05)。结论优降宁通过抑制LSD1促进奥沙利铂诱导的MDA-MB-231细胞增殖抑制、细胞凋亡,并产生药物协同效应抑制MDA-MB-231细胞增殖。     

负载U937细胞冻融抗原的DC诱导CTL的特异性杀伤

树突状细胞 (DC)作为重要的专职抗原提呈细胞 ,其抗原提呈能力远强于巨噬细胞和B细胞等抗原提呈细胞。因而 ,以DC为中心的免疫治疗是肿瘤生物学治疗的主要方向之一。我们应用当前普遍采用的rhGM CSF、rhIL 4培养体系 ,自骨髓单个核细胞诱导产生CD14 - CD1a 的前体DC ,使其负载     

HBsAg脉冲的树突状细胞对CIK细胞功能的影响

目的:探讨HBsAg脉冲的树突状细胞(DC),对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的增殖和杀伤作用的影响。方法:选择慢性乙肝患者23例,用常规方法分离外周血单个核细胞(PBMC),经HBsAg脉冲后培养为特异性的DC,用3H-TdR掺入法检测该细胞对CIK细胞增殖的刺激作用,用乳酸脱氢酶释放法检测特异性CIK细胞对HepG2215细胞的特异性杀伤作用。结果:HBsAg脉冲的DC对CIK细胞的增殖具有刺激作用。由HBsAg脉冲的DC所诱导的特异性CIK细胞对HepG2215细胞的特异性杀伤作用增强。结论:HBsAg脉冲的DC可增强CIK细胞的杀伤活性。     

树突状细胞诱导高聚金葡素刺激的淋巴细胞体外高效特异性杀瘤作用

目的体外诱导高效特异的抗肿瘤免疫反应,以期制备新型特异性肿瘤免疫治疗效应细胞。方法分离健康人外周血单个核细胞(PBMC),将其中非贴壁细胞(淋巴细胞)加高聚金葡素(HAS)培养(称HASL);贴壁细胞经IL-4和GM-CSF联合刺激诱导树突状细胞(DC)分化。DC用人肺癌细胞系GLC-82的可溶性抗原致敏,并用TNFα和PGE2促进DC的抗原递呈能力。培养第10天,将DC与经或未经HAS刺激的淋巴细胞混合培养4h,分别称混合培养细胞为DC-HASL和DC-L。将DC-HASL、HASL及DC-L作为效应细胞,肿瘤细胞作为靶细胞,用MTT法检测细胞毒活性。细胞表型用流式细胞仪分析。结果DC-HASL对GLC-82细胞具有高效而特异性的杀伤作用(杀伤率100％);对另一肺癌细胞系A549细胞的杀伤率也达94.2％;对大肠癌细胞moser和乳腺癌细胞MCF-7的杀伤率分别为73.5％和71.2％。而HASL和DC-L对A549、GLC-82、moser和MCF-7细胞的杀伤率则分别为48％、63％、60％、45％和42.1％、46.4％、39％、25.6％。淋巴细胞经HAS刺激后,CD3＋CD56＋细胞的比例大幅度增加。结论HAS在体外刺激淋巴细胞增殖产生的HASL对肿瘤细胞有一定的杀伤作用,无明显特异性。而DC-HASL则可高效特异性地杀伤GLC-82细胞,对其它肿瘤细胞也有不同程度的杀伤作用。另外,其对同类肿瘤细胞的杀伤率明显高于不同来源的肿瘤细胞。DC-L的杀伤力则明显低于DC-HASL。以上结果提示,将DC与HAS结合可诱导产生高效特异性的抗肿瘤免疫作用,为利用同种异体效应细胞进行肿瘤继承性免疫治疗提供了依据。     

慢性乙型肝炎患者外周血细胞因子诱导的杀伤细胞的动态观察

目的:动态观察慢性乙型肝炎患者细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞的增殖及杀伤活性。方法:抽取10例健康人及20例慢性乙型肝炎患者的外周血,常规分离单个核细胞(PB-MC),加IFN-γ、IL-2及抗人CD3单克隆抗体(mAb)后培养,诱导CIK细胞形成。于培养后3、6、12、24及30 d,取培养的 细胞,用流式细胞仪检测CIK细胞表面CD3、CD4和CD8以及CD4、CD25、CD3、CD56和CD95、CD28分子的表达水平、增殖及杀伤活性。结果:慢性乙型肝炎患者CIK细胞的增殖及杀伤活性均低于正常对照组。培养不同时间乙肝患者CIK细胞的增殖倍数、杀伤活性和上述表面标志的表达水平,均较培养前明显增高,于培养后12 d达高峰。结论:慢性乙型肝炎患者CIK细胞的增殖倍数、杀伤活性均低于正常人,但明显高于培养前;这可能是导致HBV感染持续发展的原因之一。     

Chimeric antigen receptor- and natural killer cell receptor-engineered innate killer cells in cancer immunotherapy

Chimeric antigen receptor (CAR)-engineered T-cell (CAR-T) therapy has demonstrated impressive therapeutic efficacy against hematological malignancies, but multiple challenges have hindered its application, particularly for the eradication of solid tumors. Innate killer cells (IKCs), particularly NK cells, NKT cells, and γδ T cells, employ specific antigen-independent innate tumor recognition and cytotoxic mechanisms that simultaneously display high antitumor efficacy and prevent tumor escape caused by antigen loss or modulation. IKCs are associated with a low risk of developing GVHD, thus offering new opportunities for allogeneic “off-the-shelf” cellular therapeutic products. The unique innate features, wide tumor recognition range, and potent antitumor functions of IKCs make them potentially excellent candidates for cancer immunotherapy, particularly serving as platforms for CAR development. In this review, we first provide a brief summary of the challenges hampering CAR-T-cell therapy applications and then discuss the latest CAR-NK-cell research, covering the advantages, applications, and clinical translation of CAR- and NK-cell receptor (NKR)-engineered IKCs. Advances in synthetic biology and the development of novel genetic engineering techniques, such as gene-editing and cellular reprogramming, will enable the further optimization of IKC-based anticancer therapies.     

脐带血来源的树突细胞增强LAK细胞的增殖和杀伤活性

目的探讨脐带血来源的树突细胞(CBDC)在体外对LAK(lymphokine activated killer)细胞增殖活性和杀伤活性的影响。方法采用GM-CSF和IL-4联合刺激诱导脐带血单个核细胞分化为CBDC,再将CBDC与同源LAK细胞混合培养,用MTT法测定不同细胞密度的CBDC刺激LAK细胞增殖和杀伤的能力。结果体外诱导出形态典型的CBDC,其具有明显刺激LAK细胞增殖的能力。LAK细胞的增殖和杀伤活性在2种细胞混合比为1∶10时最强。结论CBDC能增强LAK的增殖活性和杀伤活性。     

树突状细胞上调MHC Ⅰ类相关抗原A表达对NK细胞活性的影响

目的:观察单核细胞、未成熟和成熟树突状细胞(DCs)表达MHC Ⅰ类相关抗原A(MICA)的情况,以及DCs表达MICA后对NK细胞活性的影响.方法:用流式细胞术分别检测单核细胞、未成熟DC(iDCs)以及LPS、TNF-α、CD40L、IL-15和IFN-α分别刺激的成熟DCs表面MICA的表达,并观察DCs表达MICA后对NK细胞表达CD69、细胞毒活性和分泌IFN-γ的影响.最后用流式细胞术检测重组NKG2D/Fc蛋白和抗IL-12单克隆抗体(mAb)对DCs激活NK细胞的影响.结果:单核细胞不表达MICA,iDCs低表达MICA.LPS、TNF-α和CD40L对DCs表达MICA无影响;但IFN-α和IL-15可促进DC上调MICA表达.DCs表达MICA后可促进NK细胞表达CD69、分泌IFN-γ、杀伤K562细胞.NKG2D/Fe蛋白可抑制NK细胞的杀伤活性和分泌IFN-γ;而抗IL-12mAb仅抑制IFN-γ分泌.结论:MICA在DCs表面的表达受局部微环境影响,且DCs表达MICA后可增强NK细胞的活性.     

树突状细胞诱导的CIK细胞对肺癌生长的抑制作用

目的探讨树突状细胞诱导的CIK细胞对肺癌移植瘤细胞生长的抑制作用。方法建立肺癌皮下移植瘤模型;分离患者外周血单个核细胞,培养成熟的DC及CIK细胞;用反复冻融肺癌组织的方法制备肿瘤细胞裂解物并负载DC,诱导DC-CIK细胞;进行肺癌移植瘤内注射,比较两组裸鼠移植瘤体积及重量,观察其抑瘤情况。结果 DC-CIK细胞对肺癌皮下移植瘤细胞的抑制率为70.3%,抑制作用明显强于DC或CIK细胞的抑制作用(P0.05)。结论树突状细胞诱导的CIK细胞能够有效抑制肺癌移植瘤生长。     

细胞因子诱导的杀伤细胞联合白细胞介素2治疗恶性胸腔积液

目的 观察应用细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞联合白细胞介素2（IL-2）治疗恶性胸腔积液的疗效.方法 收集2009年7月至2013年7月于本院肿瘤科就诊的恶性胸腔积液患者50例,随机数字表法分为治疗组（n=24）和对照组（n=26）.胸腔积液引流净后,治疗组胸腔灌注CIK细胞联合IL-2,连续3d;对照组灌注IL-2联合顺铂,隔日1次,连续3次.治疗4周后评价疗效和不良反应.结果 治疗组有效率87.50％（21/24）,完全缓解率54.17％（13/24）;对照组有效率57.69％（15/26）,完全缓解率42.31％（11/26）.与对照组比较,治疗组的完全缓解率、有效率均增加（均P＜0.05）.不良反应比较显示,治疗组发热的发生率较高,而对照组胸痛、胃肠道反应、骨髓抑制的发生率较高（均P＜ 0.05）.与治疗前比较,治疗后两组患者的Karnofsky评分均增加（均P＜0.05）.结论 CIK细胞联合IL-2胸腔灌注治疗恶性胸腔积液不良反应小,疗效确切.     

Optimal culture conditions for the generation of natural killer cell-induced dendritic cells for cancer immunotherapy

Dendritic cell (DC)-based vaccines continue to be considered an attractive tool for cancer immunotherapy. DCs require an additional signal from the environment or other immune cells to polarize the development of immune responses toward T helper 1 (Th1) or Th2 responses. DCs play a role in natural killer (NK) cell activation, and NK cells are also able to activate and induce the maturation of DCs. We investigated the types of NK cells that can induce the maturation and enhanced function of DCs and the conditions under which these interactions occur. DCs that were activated by resting NK cells in the presence of inflammatory cytokines exhibited increased expression of several costimulatory molecules and an enhanced ability to produce IL-12p70. NK cell-stimulated DCs potently induced Th1 polarization and exhibited the ability to generate tumor antigen-specific cytotoxic T lymphocyte responses. Our data demonstrate that functional DCs can be generated by coculturing immature DCs with freshly isolated resting NK cells in the presence of Toll-like receptor agonists and proinflammatory cytokines and that the resulting DCs effectively present antigens to induce tumor-specific T-cell responses, which suggests that these cells may be useful for cancer immunotherapy.