用于荧光原位杂交技术的骨髓细胞制片方法研究

本研究对传统的骨髓细胞制片方法进行改良,探讨其对荧光原位杂交(FISH)信号的影响,为骨髓标本FISH检测提供最佳的制片方法。采用缺口平移的方法,制作出Spectrum Green-C-myc,Promo Fluor-555-MDM2,Promo Fluor-415-STK6三色荧光杂交探针。将采集到的5例骨髓标本进行2种方法制片,传统方法:用低渗的方法去除红细胞,甲醇/冰醋酸(3∶1)固定细胞后进行细胞甩片;改进方法:用密度梯度离心的方法去除红细胞,细胞甩片后用甲醇固定细胞,再用2%甲醛固定细胞,将固定好的细胞进行FISH检测并比较两种方法获得的平均荧光信号强度,背景信号强度以及荧光信号的分裂率。结果表明:在Spectrum Green,Promo Fluor-555和Promo Fluor-415 3个通道中,传统方法制片FISH平均荧光信号强度与背景强度的比值为4.3±0.19,3.52±0.04,3.07±0.08,改进方法为9.89±0.41,7.55±0.5,5.67±0.18,(P<0.01);改进方法在3个通道中获得的荧光信号强度分别为传统方法的2.32,2.14和1.85倍;同时该方法减少了荧光信号的分裂率,传统方法荧光信号的分裂率分别为(15.8±1.74)%,(20.42±2.88)%,(23.2±3.02)%,改进方法分别为(8.6±1.2)%,(12.28±1.33)%,(12.6±2.56)%(P<0.05)。结论:采用改进后的骨髓制片方法有效地提高了FISH检测的荧光信号强度,明显降低了荧光信号的分裂现象,而且该方法易于掌握,程序简单。本研究为FISH检测骨髓标本提供了一种更佳的制片方法。     

荧光原位杂交技术在淋巴瘤诊断中的价值

淋巴瘤是淋巴造血系统的恶性肿瘤,发病率及死亡率近年来都在逐渐升高.如何早期诊断、早期治疗一直是临床医师思考的问题.荧光原位杂交(FISH)通过荧光标记探针与染色体原位杂交精确地测定各染色体数目和结构的畸变,在淋巴瘤诊断中以其快速、高特异性和高敏感性引起广大研究者的极大兴趣.     

荧光原位杂交技术检测BCR/ABL融合基因

目的建立荧光原位杂交(FISH)技术,直接原位检测间期细胞中BCR/ABL融合基因,辅助临床诊断和治疗慢性粒细胞性白血病(CML)。方法应用FISH技术检测15例CML患者骨髓培养细胞BCR/ABL融合基因,其中5例CML患者同时取骨髓直接涂片检测,5例CML患者同时取外周血浓缩单个核细胞直接涂片检测。以5例非CML患者骨髓培养细胞为阴性对照。结果15例患者骨髓标本成功培养10例,染色体分析检测到Ph1染色体8例。15例患者骨髓培养细胞FISH检测BCR/ABL融合基因阳性14例。5例CML患者同时做骨髓直接涂片FISH检测,结果阳性4例。5例CML患者同时做血标本浓缩单个核细胞FISH检测阳性2例。5例非CML患者FISH结果均阴性。结论FISH技术能直接原位检测间期细胞中BCR/ABL融合基因,且快速、可靠、成功率高,是诊断和监测CML的一项有效新技术。     

荧光原位杂交技术检测BCR/ABL融合基因

目的 建立荧光原位杂交（FISH）技术,直接原位检测间期细胞中BCR／ABL融合基因,辅助临床诊断和治疗慢性粒细胞性白血病（CML）。方法 应用FISH技术检测15例CML患者骨髓培养细胞BCR／ABL融合基因,其中5例CML患者同时取骨髓直接涂片检测,5例CML患者同时取外周血浓缩单个核细胞直接涂片检测。以5例非CML患者骨髓培养细胞为阴性对照。结果 15例患者骨髓标本成功培养10例,染色体分析检测到Ph1染色体8例。15例患者骨髓培养细胞FISH检测BCR／ABL融合基因阳性14例。5例CML患者同时做骨髓直接涂片FISH检测,结果阳性4例。5例CML患者同时做血标本浓缩单个核细胞FISH检测阳性2例。5例非CML患者FISH结果均阴性。结论 FISH技术能直接原位检测间期细胞中BCR／ABL融合基因,且快速、可靠、成功率高,是诊断和监测CML的一项有效新技术。     

应用荧光原位杂交技术检测慢性淋巴细胞白血病的基因组异常

目的 探讨应用组合荧光原位杂交(panel fluorescence in situ hybridization,panel FISH)技术对慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukaemia,CLL)基因组异常检测的价值.方法 分别应用序列探针D13S25(13q14.3)、RB1、p53、ATM(11q23)和着丝粒探针12号(CSP12)等5种荧光素标记的DNA探针,对17例CLL患者进行FISH检测,并和常规细胞遗传学检测结果进行比较.结果 17例CLL患者中,常规细胞遗传学检测出1例(1/17)有染色体异常,为49,XX,+3,+8,+18;组合FISH检测出10例(10/17)有染色体异常,包括D13S25缺失4例、ATM缺失2例、p53缺失1例、D13S25合并RB1同时缺失2例、多种异常1例.FISH检测的总检出率高于常规细胞遗传学检测.结论 组合FISH技术是检测CLL患者染色体基因组异常的有效手段,与常规细胞遗传学方法相结合则可明显提高CLL染色体异常的检出率.     

荧光原位杂交技术检测急性淋巴细胞白血病异常染色体

目的　研究荧光原位杂交技术（ＦＩＳＨ） 在检测异常染色体中的应用价值及其意义。方法　用ＦＩＳＨ方法和染色体Ｇ分带技术对比观察急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ） 患者染色体的变化。结果　对３８ 例患者１７ ,１８ 和２１ 号染色体进行Ｇ分带技术检查,结果分别有１１,１３ 和１８ 例患者细胞染色体存在三倍体细胞。ＦＩＳＨ 检查结果,除上述病例发现三倍体细胞外,染色体Ｇ分带检查正常者中也有部分病例存在三倍体。结论　ＦＩＳＨ检测异常染色体,方法简便、灵敏、可靠,与常规细胞遗传学方法比较,ＦＩＳＨ 方法不需要培养细胞,对分裂期和分裂间期细胞均可进行基因定位检测,尤其在有核细胞少等不适于进行细胞遗传学分析的情况下,ＦＩＳＨ 方法仍可得到有意义的数据。     

Detection of individual virus-infected cells by filter in situ hybridization

The diagnosis of virus infection by nucleic acid hybridization represents an alternative to classical virological diagnostic methods. One special technique termed 'filter in situ hybridization' consists of fixation of intact cells to nitrocellulose filters followed by hybridization with a labelled DNA probe. We demonstrate that filter in situ hybridization can be a simple and sensitive method for the detection of virus infection in cells. In an in vitro model system using a human B-lymphoma cell line infected by the lymphotropic papovavirus (LPV), it is shown that individual virus replicating cells can be detected by this method. Infection can be diagnosed even if only one out of 20,000 cells in a culture contains replicating virus. This assay may be of value as a diagnostic tool in other viral systems.     

应用荧光原位杂交技术检测肺癌间期细胞部分染色体数目的改变

目的 应用荧光原位杂交（FISH）技术研究肺癌细胞部分染色体数目改变及其意义。方法 用8、11、12和17号染色体的着丝粒探针与24例肺癌标本的间期细胞进行杂交检测。结果 标本中8、11、12和17号染色体超二倍体分别达到62．50％（15／24）、50，00％（12／24）、54．17％（13／24）、54．17％（13／24）。结论 FISH技术可检测肺癌间期细胞染色体数目的改变，肺癌遗传学变异中主要以8、11、12、17号染色体的增加多见，对肺癌的发生、发展和预后有一定的提示作用。     

间期荧光原位杂交技术检测多发性骨髓瘤基因组异常的临床意义

目的 探讨I-FISH技术检测MM基因组异常的临床意义.方法 应用CC技术(常规R显带)和I-FISH技术[包括GLP13q14(RB1基因)、GLP17p13.1(P53基因)、GLP13q14.3(D13S319)、GLP1q21及GLP14q32(IgH基因)DNA序列探针]分别对20例初治的MM患者(按Bataille分期,Ⅰ期7例、Ⅱ期5例、Ⅲ期8例)进行基因组检测;比较两种方法对MM染色体和基因组异常的检出率;并分析基因组异常与Bataille分期的关系.结果 CC技术从20例MM患者中检出1例[5%(1/20)]染色体异常,且为复杂核型--46,XX,-2,del(3)(p21),add(6)(q26),der(10)(q26),der(14)(32),+mar,inc[6].I-FISH检出12例[60%(12/20)]基因组异常,其中基因组异常发生频率在RB1、D13S319和P53均为30%(6/20),IgH和1q21均为20%(4/20);经配对χ2检验,I-FISH的检出率高于CC技术(χ2=9.09,P=0.001).在20例MM患者中,RB1基因异常的6例,Ⅰ期占1/20,Ⅱ期占1/20,Ⅲ期占4/20;D13S319异常的6例,Ⅰ期占2/20,Ⅱ期占1/20,Ⅲ期占3/20;P53基因异常的6例,Ⅰ期占2/20,Ⅲ期占4/20;1q21异常的4例,Ⅰ期和Ⅲ期占2/20;IgH基因异常的4例,Ⅰ期占1/20,Ⅲ期占3/20.结论 I-FISH对MM患者基因组异常检出率较高,其可检出不同Bataille分期的MM患者.

Abstract：

Objective To investigate the clinical significance of I-FISH for detection of genomic abnormalities in MM. Methods Twenty newly diagnosed MM patients(seven cases at stage Ⅰ , five cases at stage Ⅱ and eight cases at stage Ⅲ according to Bataille staging) were analyzed by combining the technique of CC (R-binding stain) and I-FISH [ including GLP13q14 (RBI gene), GLP17p13. 1 (P53 gene),GLP13q14. 3(D13S319) ,GLP1q21 ,GLP14q32(IgH gene) DNA sequence probes]. These two methods were compared for the detection rates of chromosomal and genomic abnormalities in MM and the association between genomic abnormalities and Bataille stages was also analyzed. Results CC examination showed only 1 case [5% (1/20) ] was found complex chromosomal abnormalities--46,XX,-2,del(3) (p21) ,add(6)(q26) ,der(10)(q26),der(14)(q32), + mar, inc[6]. While I-FISH assay showed that 12 cases [60%(12/20) ] were found genomic abnormalities. The frequencies of RB1, D13S319 and P53 were all 30%(6/20), and the frequencies of IgH gene and 1q21 were both 20% (4/20). The detection rate of the I-FISH was much higher than CC (χ2 = 9. 09, P = 0. 001) according to paired χ2 test. Of 20 patients,6 cases had RB1 gene abnormality, 1 case at stage Ⅰ , 2 cases at stage Ⅱ and 4 cases at stage Ⅲ. Of 20 patients, 6 cases had D13S319 gene abnormality, 2 cases at stage Ⅰ , 1 case at stage Ⅱ and 3 cases at stage Ⅲ. Of 20 patients, 6 cases in 20 had P53 gene abnormality, 2 cases at stage Ⅰ and 4 cases at stage Ⅲ. Of 20 patients, 4 cases had 1q21 gene abnormality, 2 cases at stage Ⅰ and 2 cases at stage Ⅲ. Of 20 patients, 4 cases had IGH gene abnormality, 1 case at stage Ⅰ and 3 cases at stage Ⅲ. Conclusion Ⅰ-FISH has higher detection rate for the genomic abnormalities in MM and can be used in detection of MM patients in different Bataille stages.     

荧光原位杂交法检测慢性粒细胞白血病bcr基因重排

目的：检测慢性粒细胞白血病ｂｃｒ基因重排。方法：应用荧光原位杂交技术，以自行筛选和制备的酵母人工染色体为探针进行荧光原位杂交，检测慢性粒细胞白血病ｂｃｒ基因的重排。结果：用２２号染色体ｂｃｒ基因附近的ＹＡＣ７６５Ｅ３，在９例慢性粒细胞白血病中，发现５例慢性期患者，２例急变期患者和１例经α干扰素治疗后的患者存在ｂｃｒ基因重排，１例自体骨髓移植后患者的核型呈嵌合状态，即同时存在正常的和具有ｂｃｒ基因重排的核型。结论：ＹＡＣ７６５Ｅ３是一个有用的检测ｂｃｒ基因重排的探针，荧光原位杂交技术可能成为白血病治疗效果的监测和微量残留病检出的一种重要手段。     

双色荧光原位杂交技术检测慢性淋巴细胞白血病IgH基因易位

目的 了解慢性淋巴细胞白血病（CLL）中染色体14q32上IgH基因易位情况，探讨其与CLL疾病进展的关系。方法 运用位于14q32上IgH基因两端的序列特异性DNA探针IGHC、IGHV和双色间期荧光原位杂交（FISH）技术对70例初发的B细胞CLL（B—CLL）患者的间期细胞进行IgH基因易位重排情况的检测。结果 70例B—CLL中8例（11．4％）有IgH基因易位重排，其阳性细胞率为10．5％～53．0％之间，且IgH基因易位在不同性别、年龄和Binet分期中差异无统计学意义（P〉0．05）。结论 IgH基因异位在B—CLL中属易发事件，对B—CLL的发生和发展的作用有待进一步研究。FISH是一种在分析B—CLL中IgH基因易位异常方面较为快速、准确和敏感的方法。     

荧光原位杂交技术在套细胞淋巴瘤石蜡切片的应用研究

目的建立淋巴瘤石蜡切片应用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)检测的操作流程,探讨其在套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma,MCL)诊断中的应用价值。方法优化石蜡切片FISH检测步骤和实验条件,在16例病理拟诊断MCL的石蜡切片上应用FISH检测IGH/CCND1融合基因。结果确立了本实验室石蜡切片FISH检测的实验方法和条件;拟诊断MCL的病例中IGH/CCND1融合基因阳性检出率为75%(12/16)。结论淋巴瘤石蜡切片FISH检测可满足临床应用要求;应用FISH技术检测IGH/CCND1融合基因有助于MCL的诊断。     

间期荧光原位杂交技术检测急性粒-单核细胞白血病inv(16)

目的 探讨荧光原位杂交（FISH）技术在检测inv(16)(p13q22)中的价值。方法 采用红色荧光素（Spectrum Red标记的酵母人工染色体（YAC）克隆854E2[跨越第16号染色体短臂inv（16）断裂点]作为探针，用单色间期FISH检测26例急性粒－单核细胞白血病（AML－M4）inv（16)。在9例inv（16）患者中，特征性的3个红色荧光信号的阳性率仅为13.3%－32.1%（中位数21.3%）。结论 YAC854E2和间期FISH是检测inv(16)的有效方法。     

间期荧光原位杂交检测骨髓增生异常综合征8号染色体三体

目的 探讨间期荧光原位杂交（ＦＩＳＨ０技术在检测骨髓增生异常综合征（ＭＤＳ）８号染色体三体（８三体）中的价值。方法 同时应用常规细胞遗传学（ＣＣ）和荧光素ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ直接标记的８号染色体着丝粒特异性探针间期ＦＩＳＨ检测６９例ＭＤＳ患和６名正常人骨髓的８三体。结果 分析２００个间期细胞,以〉３％的３个绿色杂交信号定为阳性标准。     

联合骨髓涂片和骨髓活检诊断非霍奇金淋巴瘤骨髓侵犯

目的探讨骨髓涂片和骨髓活检在非霍奇金淋巴瘤(NHL)骨髓浸润诊断中的价值。方法 NHL患者同时做骨髓涂片和骨髓活检。骨髓涂片经瑞氏染色,分类计数肿瘤细胞;骨髓切片采用塑料包埋法,制作组织切片,常规HGF染色。结果 62例NHL患者经骨髓涂片和骨髓活检联合检测,确诊为NHL细胞骨髓侵犯,其中49例(79.0%)骨髓涂片检出NHL细胞,59例(95.2%)骨髓活检检出肿瘤细胞浸润灶,骨髓活检阳性率略高于骨髓涂片,但差异无统计学意义(P>0.05)。NHL细胞形态分为4种类型:小细胞成熟型、大细胞幼稚型、大细胞原始型和组织细胞型。13例骨髓涂片检查阴性而骨髓活检阳性的病例中,10例是小细胞成熟型(76.9%);9例为骨髓淋巴瘤细胞轻度侵犯(69.2%),3例为重度侵犯合并骨髓纤维化(23.1%)。结论骨髓涂片和骨髓活检都是诊断NHL骨髓侵犯的重要手段,两者各有优势,联合应用可以提高诊断阳性率。骨髓活检在淋巴瘤细胞轻度骨髓侵犯或合并骨髓纤维化,以及浸润瘤细胞为小细胞成熟型时,更能准确地提供诊断依据。     

用流式细胞仪分析骨髓细胞诊断淋巴瘤

FCM已经成为临床诊断淋巴瘤的有力工具.骨髓细胞FCM诊断的主要依据是SSC和CD_(45)细胞分布图上是否出现大小和分布不同于正常细胞的异常细胞,这种细胞是否存在和缺失相应的细胞表型.B细胞淋巴瘤的克隆性用免疫球蛋白к或λ轻链限制性确定,然后根据CD_5和CD_(10)表达与否,分为4种类型,进一步区分B细胞淋巴瘤亚型.T细胞淋巴瘤的克隆性用TCRα/β和γ/δ,TCR Vβ 25个家族的限制性确定,然后根据CD_4和CD_8表达与否,分为4种类型,进一步区分T细胞淋巴瘤亚型.NK细胞瘤可用CD_(56)、EBV、细胞毒颗粒TIA-1、颗粒酶B和穿孔素阳性与否进一步确定亚型.     

间期荧光原位杂交检测骨髓增生异常综合征-5/5q-染色体异常

目的 评价间期荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH)在检测骨髓增生异常综合征（MDS）－5/5q-染色体异常中的价值。方法 应用荧光素SpectrumRed直接标记的5q31单一序列特异性DNA探针,对48例MDS患者和10名正常对照者的骨髓细胞进行间期FISH检测,每例分析200－300个细胞,以1个红色荧光杂交信号＞6％（x^- 3SD)为阳性标准,并与常规细胞遗传学检测结果相比较。结果 48例MDS患者中,间期FISH检测13例（27．1％）为阳性,其中7例常规细胞遗传学检测也为阳性,6例为阴性;经配对x^2检验,间期FISH和常规细胞遗传学两种方法阳性检出率差异有显著性（P＜0．05）。结论 间期FISH是检测MDS－5／5q-染色体异常的有力的分子遗传学工具,其敏感性高于常规细胞遗传学检测法,是常规细胞遗传学检测法的一个重要补充。     

荧光原位杂交技术检测骨髓增生异常综合征患者+8和20q-

目的探讨荧光原位杂交(FISH)技术检测骨髓增生异常综合征(MDS)患者8号和20号染色体异常的应用。方法 40例MDS患者,采用间期FISH技术,选取+8和20q-探针的组合,检测MDS患者中的+8和20q-异常情况。结果利用FISH技术,+8和20q-检出率分别为12.5%,15.0%。采用FISH技术的组合探针可以检测出8号和20号染色体异常。结论 FISH技术能够检测出MDS染色体异常,采用组合探针的FISH更为敏感和特异。     

荧光原位杂交技术在羊水间期细胞产前诊断中的应用

目的探讨荧光原位杂交(FISH)技术在产前诊断中的应用价值。方法采集1 189名孕18~24周孕妇的羊水标本,用染色体GLP13/21探针和CSP18/X/Y探针对未培养的羊水细胞进行FISH检测,并与羊水细胞染色体核型结果比较。结果 1 189例羊水标本1 175例培养成功,检出41例染色体异常,35例染色体多态性。1 189例羊水标本FISH杂交均成功,检出29例异常标本,另有6例结果不能判定。29例FISH结果异常中除1例因羊水培养失败无染色体核型对比外,其余与染色体核型结果一致。6例结果不能判定中5例因母血污染影响X、Y信号判断。结论产前FISH检测法在诊断5种染色体数目异常中有较高的应用价值,但存在检测假阳性和范围局限性,不建议作为单独检测方法用于染色体异常的产前诊断。