内毒素诱导巨噬细胞HMGB1表达的实验研究

目的:探讨内毒素(脂多糖,Lipoplysaccharide,LPS)刺激巨噬细胞后高迁移率族蛋白B1(High mobility group protein B1,HMGB1)的释放和表达水平.方法:用100 ng/ml的LPS刺激RAW264.7细胞,分别于刺激后0、6、12、18、24、30、36 h和48 h,用Western blot检测细胞培养上清、细胞浆和细胞核内HMGB1蛋白的含量;用RT-PCR检测细胞中HMGB1的mRNA表达情况;用免疫细胞化学、激光共聚焦显微镜观察LPS刺激后细胞浆和胞核内HMGB1的含量变化.分别于LPS刺激后0、1、2、4 h和6h,用酶联免疫吸附实验(Enzymelinked immunoassay,ELISA)测定细胞培养上清中TNF-α、IL-6的含鼍.结果:LPS刺激后0～12 h细胞培养上清中无法检测到HMGB1蛋白,18 h后细胞培养上清中HMGB1蛋白的含量开始增加,于24 h达到高峰,以后稳定维持在较高水平;LPS刺激前,HMGB1主要分布于细胞核内,胞核中HMGB1蛋白含量较高,胞浆中HMGB1蛋白含量少;LPS刺激后12～48 h细胞浆中HMGB1蛋白含量逐渐增加;而LPS刺激后12～24 h细胞核内HMGB1含量逐渐减少,30 h后细胞核内HMGB1含量又逐渐增多.RT-PCR结果显示,LPS刺激后0～18 h,培养细胞中HMGB1的mRNA表达量无明显变化,24～36 h培养细胞中HMGB1的mRNA表达量明显增加.ELISA结果显示,LPS刺激后1 h,细胞培养上清中TNF-α、IL-6的含量明显增高,2 h达到高峰.结论:LPS可诱导单核-巨噬细胞内HMGB1、TNF-α、IL-6表达和释放增加,LPS诱导巨噬细胞释放HMGB1的时间明显晚于TNF-α、IL-6的释放时间;LPS诱导巨噬细胞内的HMGB1从细胞核向细胞浆转位,并释放到细胞外;LPS诱导巨噬细胞HMGB1 mRNA基因表达上调的时间和蛋白合成的时间出现较晚.     

人高迁移率族蛋白1基因的克隆和表达

目的：克隆人高迁移率族蛋白1(HMG—1)编码基因，构建重组表达载体并对其诱导表达．方法：通过RT—PCR方法扩增出人外周血单个核细胞中HMG—1的编码基因，克隆于载体pGEM—T easy，测序分析后亚克隆于表达载体pGEx—4T—2，测序证实序列正确后转化大肠杆菌DH5α，经IPTG诱导4h后可表达M，约56000的融合蛋白GST—HMGl．结果：克隆了人HMG—1的编码基因，构建了融合蛋白的重组表达质粒pGEx—HMGl，表达的融合蛋白产物经凝胶薄层扫描检测，占全菌总蛋白的0．23．结论：获得了人HMG—1编码基因及其原核表达产物，对研究人HMG—1的生物学功能及其mAb的制备具有重要意义．     

鼠HMGB1蛋白的原核表达及分离纯化

目的:克隆小鼠HMGB1基因,构建原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达并分离纯化获得His-HMGB1的融合蛋白.方法:脂多糖刺激后的RAW264.7细胞,提取总RNA,经RT-PCR扩增出含HMGB1的目的片段,克隆于pMD-19T载体,再亚克隆至含有pelB引导肽及His-标签肽的高效表达载体pET-26b( ),转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后行SDS-PAGE鉴定目标蛋白表达,用镍鳌合琼脂糖凝胶亲和层析法分离纯化含His-标签肽的目的蛋白.结果:经PCR扩增出大小为648 bp的HMGB1基因片段,成功构建目标蛋白的融合表达载体,经诱导表达及分离纯化,获得了约30 kD的融合蛋白.结论:构建HMGB1的融合表达载体,获得分离纯化融合蛋白His-HMGB1,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

HMGB1细胞因子作用研究进展

高迁移率族蛋白B1(HMGB1)是一组高度保守的非组织核蛋白,存在于多种真核细胞的细胞核中。生理状态下HMGB1发挥着核结合蛋白的作用。一旦释放进入细胞间隙,则表现出晚期炎性因子作用。新近的研究显示,HMGB1还具有损伤信号因子、细胞及干细胞趋化吸附因子作用。由于晚期糖基化末端产物受体的广泛存在,HMGB1在多种疾病及组织器官损伤、修复过程中发挥重要作用。     

HMGB1在系统性红斑狼疮中的表达及其与感染的关系

目的 检测在系统性红斑狼疮患者及合并感染时单核细胞培养上清液中HMGB1的变化,探讨其在疾病活动及继发感染中的意义.方法 2007年8月01日～2008年01月31日,从湘雅医院门诊及住院病人中选取SLE稳定期、活动期、活动期并发细菌感染组及正常对照组各20例作为本次研究的对象.对研究对象的外周静脉血处理培养,采用ELISA方法检测上清液HMGB1的浓度,并用Western检测SLE患者血清HMGB1蛋白表达.采用SPSS15.0软件对资料进行统计分析.结果 ①单核细胞未加入LPS培养上清液以及加入LPS培养上清液,两种情况的统计结果均为:SLE稳定组HMGB1的浓度与正常对照组之间差异无统计学意义(P>0.05),而SLE活动组高于稳定组及正常对照组,感染组高于活动组(P<0.05).②单核细胞加入LPS前后培养的上清液中,稳定组与正常对照组HMGB1的浓度差异均有统计学意义(P<0.05),而活动组以及感染组HMGB1的浓度差异均无统计学意义(P>0.05).③SLE活动组(75%)与SLE活动合并肺部感染组(85%)的血清中通过Western方法可检测到HMGB1的表达,且SLE活动合并肺部感染组血清中HMGB1的蛋白表达水平较SLE活动组显著增高(P<0.05).结论 SLE活动患者单核细胞培养后上清液中HMGB1浓度升高,且其升高与疾病的活动有关;继发感染时HMGB1浓度进一步升高;SLE活动并肺部感染能使患者血清中HMGB1的表达增高.     

丙酮酸乙酯预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤和HMGB1表达的影响

目的:探讨丙酮酸乙酯预处理在大鼠心肌缺血再灌注损伤中的保护机制.方法:50只成年雄性SD大鼠随机分为4组:假手术组（SO组）、假手术组+丙酮酸乙酯组（SO-EP组）、缺血再灌注组(I/R组)、丙酮酸乙酯+缺血再灌注组（EP-I/R组）.缺血前1h给予丙酮酸乙酯(50 mg/kg,ip),结扎冠脉前降支缺血30 min后...     

HMGB1、 MMP-9在肺癌组织的表达及临床意义

目的 探讨肺癌组织中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的表达及其意义.方法 采用免疫组化SP法检测65例肺癌组织及其癌旁对照组中HMGB1和MMP-9的表达.结果 非小细胞肺癌(NSCLC)组织中HMGB1及MMP-9阳性率明显高于其癌旁组织(P＜0.05);HMGB1在肺鳞癌组织中阳性表达率高于腺癌组织,且其癌旁组织的阳性表达率也高于腺癌的癌旁组织(P＜0.05);MMP-9在肺鳞癌组织中阳性表达率低于腺癌组织(P＜0.05);有淋巴结转移的NSCLC组织中HMGB1及MMP-9阳性表达率明显高于无淋巴结转移的NSCLC组织(P＜0.05);HMGB1及MMP-9在肺癌组织中的表达成正相关(P＜0.05).结论 HMGB1和MMP-9的表达与肺癌组织病理类型和淋巴结转移有关,可作为肺癌转移、治疗和预后判断指标.     

FPS-ZM1和mNGF对癫痫幼鼠脑内HMGB1和TRX表达的影响

目的 研究晚期糖基化终末产物(RAGE)受体阻断剂FPS-ZM1和鼠神经生长因子(mNGF)对戊四氮致痫幼鼠海马区高迁移率族蛋白B1(HMGB1)和硫氧还蛋白(TRX)表达的影响。 方法 取130只清洁级Wistar雄性大鼠幼崽,随机分为4组,即A组(空白对照组)、B组(癫痫对照组)、C组(mNGF干预组)和D组(FPS-ZM1干预组)。幼鼠腹腔注射戊四氮40 mg/kg建立癫痫模型,建模成功后,4组均连续干预1周,其中A组和B组腹腔注射等剂量生理盐水,C组和D组分别腹腔注射mNGF 4 μg/kg、FPS-ZM1 1 mg/kg,干预结束后,各组分别于3、24、72 h时段麻醉后分离海马组织。采用Western-blot方法测定海马HMGB1的含量,ELISA法检测海马TRX的浓度。 结果 A组大鼠未见惊厥发作,海马区HMGB1表达水平在各时段均明显低于B组、TRX浓度均高于B组,差别有统计学意义(P＜0.001);D组和C组的HMGB1表达水平在各时段均低于B组、TRX浓度均高于B组,差别有统计学意义(P＜0.05);D组的HMGB1表达水平在3、24 h时段较C组下降,差别有统计学意义(P＜0.05),在72 h时段与C组的差别则无统计学意义(P＞0.05)。 结论 FPS-ZM1和mNGF具有减轻癫痫幼鼠脑损伤的作用,其机制可能是通过减轻大脑的炎症反应和氧化应激来实现的。     

HMGB1与结肠癌的相关性及其致癌机制

高迁移率族蛋白1(HMGB1)是近年来肿瘤研究的热点,HMGB1是非组蛋白染色体蛋白,在血管生成、抗原呈递、细胞自噬等方面参与肿瘤的发生、发展和转移。HMGB1在结肠癌患者中高表达,血清HMGB1水平随疾病进展而明显增高,结肠癌伴肝转移患者的原发灶和转移灶均呈高表达,Dukes D期门静脉中HMGB1水平高于Dukes C期。HMGB1在细胞内的表达部位与T淋巴细胞的浸润相关,后者可影响患者的5年生存率。因此,HMGB1可作为评估结肠癌病情发展及预后的指标。     

鼠高迁移率族蛋白1A盒基因的克隆和原核表达

目的:克隆小鼠高迁移率族蛋白1A盒(HMGB1 A box)cDNA,并在大肠杆菌中表达GST-A盒融合蛋白。方法:从鼠肺提取总RNA,经RT-PCR获得HMGB1 A盒基因。将该基因插入pGEX-4T-2载体的BamHI和EcoRI位点之间并测序鉴定,转化BL21(DE3)后30℃IPTG诱导表达5h,进行SDS-PAGE分析。结果:DNA测序证明,获得了HMGB1 A盒基因,其序列与GenBank中报道序列基本一致。SDS-PAGE分析表明,HMGB1 A盒与GST融合蛋白获得成功表达,分子质量约36KD,表达量约占菌体总蛋白的15%,结论:通过RT-PCR成功克隆和表达了鼠HMGB1 A盒基因。     

人高迁移率族蛋白的分子改建及原核表达

目的 构建人高迁移率族蛋白(high mobility group box 1 protein,HMGB1)突变体及表达与鉴定目的蛋白,为进一步通过HMGB1突变体蛋白与天然HMGB1竞争结合相应受体而抑制其致炎效应奠定了基础.方法 在已成功克隆和表达人HMGB1的基础上,采用一步反向PCR致突变法构建人HMGB1 cDNA的6个突变体,并分别克隆于原核表达载体pQE-80L上,表达6个相应的重组HMGB1突变体蛋白,并经Western blot鉴定.结果 获得人HMGB1 cDNA的6个突变体,并成功构建到原核表达载体pQE-80L上,诱导表达且经Western blot鉴定了目的蛋白.结论 成功构建人HMGB1突变体,并进行了目的蛋白表达的鉴定.     

LPS刺激对人结肠癌SW480、肺癌A549细胞HMGB1以及HBD-1表达的影响

目的观察脂多糖（LPS）刺激对SW480、A549细胞HMGB1、HBD-1表达的影响。方法以浓度为5、10、50和100ng／μl LPS刺激SW480、A549细胞24h后,提取细胞RNA,并用RT—PCR法检测HMGB1以及HBD-1基因mRNA的表达水平。结果SW480以及A549细胞,HMGB1以及HBD-1均有较高的表达。在SW480细胞中,不同的LPS刺激浓度下,5ng／μl LPS即可上调HMGB1基因mRNA的表达,但其表达量并不随LPS浓度的增高而有所增加;而同样刺激条件下HBD-1基因mRNA表达水平未见明显变化（P〉0．05）。在A549细胞中,不同的LPS刺激浓度下HMGB1以及HBD-1基因mRNA表达量未见明显变化（P〉0．05）。结论HMGB1及HBD-1固有表达于肠道及呼吸道上皮细胞。LPS能上调SW480细胞HMGBl的表达,其表达量无浓度依赖性,但LPS不能上调HBD-1的表达。在A549细胞,LPS不能诱导HMGB1以及HBD-1的表达。     

小鼠TSR2-3/TSP-1基因片段的克隆及其GST融合蛋白的表达和纯化

目的：获取小鼠TSR2—3／TSP-1基因片段，并高效表达和纯化GST—TSR2—3融合蛋白。方法：应用RT—PCR技术，从小鼠肺总RNA中，获得编码TSR2—3的基因片功能片段，测序后，通过酶切克隆至表达载体pGEX-5X-2，构建重组表达载体，并导入E.coli BL21宿主菌中，IPTG诱导表达重组的GST融合蛋白，亲和层析纯化表达产物，SDS—PAGE和Westem blot进行分析鉴定。结果：获得小鼠TSR2-3基因片段，测序结果与GenBank的基因序列一致，重组GST融合蛋白经SDS-PAGE和Westem blot分析，在相对分子量39kDa处，出现特异性蛋白条带，重组蛋白经GST亲和层析柱纯化后，得到了高纯度的融合蛋白。结论：成功克隆小鼠TSR2—3基因片段，并在Ecoli BL21中高效表达，亲和层析后获得高纯度GST—TSR2—3融合蛋白。     

弓形虫GRA1基因的克隆与原核表达

目的:克隆并构建PET-28a-GRA1重组表达载体,转化人大肠杆菌E.coli BL21,诱导表达并鉴定,为进一步研究GRA1的生物学特性和免疫保护作用奠定实验基础.方法:根据GenBank中编码GRA1的已知基因序列设计并合成一对引物,应用PCR技术扩增GRA1基因,插入原核表达载体PET-28a中,构建重组表达质...     

人醇脱氢酶ADH1B*2等位基因的克隆与序列分析

目的克隆人醇脱氢酶ADH1B*2等位基因,并对克隆序列进行序列分析。方法用RT-PCR法获得ADH1B基因的cDNA,然后用双酶切得到目的基因并定向克隆到pUC19载体上。经蓝白筛选后,用限制性酶谱和DNA测序以及BLAST比对分析鉴定,并用SNPBLAST比对分析和查询dbSNP数据库,分析所克隆序列的单核苷酸多态性。结果证实所克隆序列为ADH1B*2等位基因。提示ADH1B*2等位基因有2个位点存在单核苷酸多态性。结论成功克隆了ADH1B*2等位基因,并进行了SNP分析。     

间日疟原虫MSP1-19基因的克隆与表达

目的:构建间日疟原虫MSP1-19(Plasmodium vivax merozoite surface protein-1-19,Pv MSP1-19)基因克隆及表达的载体.方法:将MSP1-19基因克隆入原核表达载体pET28a中,构建重组表达载体.以重组载体转化大肠埃希菌BL21,在IPTG诱导下表达重组Pv M...     

2种不同试剂检测血清免疫球蛋白结果的可比性及偏倚评估

目的进行2种不同免疫球蛋白诊断试剂对血清免疫球蛋白测定结果的可比性及偏倚评估研究,为血清免疫球蛋白测定的标准化和临床实验室认可提供实验数据。方法参考美国临床和实验室标准协会(CLSI)的EP9A2文件,分别用执诚试剂和优利特试剂在HITACHI7600-010全自动生化分析仪上测定免疫球蛋白IgG、IgA和IgM,以执诚试剂为对照组,优利特试剂为实验组。用线性回归统计法分析对照组(Y)和实验组(X)测定结果决定水平处的方法间误差,以美国临床实验室修正法规(CLIA′88)规定的室间质量评价允许误差范围的1/2为标准,判断不同试剂的临床可接受性。结果两种试剂对患者血清免疫球蛋白测定结果显示,方法内重复性良好,无离群点,除IgA在决定水平处的系统误差不能被接受外,其余项目测定结果的偏差临床可以接受。结论当同一实验室同一检验项目存在2个或以上的试剂时,应进行方法比对和偏差评估,判断其临床可接受性,以保证检验结果的可比性。     

人KiSS-1基因克隆及其真核表达载体的构建

目的:克隆转移抑制基因KiSS-1的不含信号肽的表达序列,构建人KiSS-1基因的真核表达载体.方法:从人正常胰腺组织中提取总RNA,经RT-PCR得到KiSS-1基因开放阅读框cDNA序列,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达质粒pcDNA3/KiSS-1.结果:经PCR、酶切鉴定和基因序列测定,证实重组入载体pcDNA3的片段为目的基因开放阅读框的核苷酸序列.结论:重组质粒pcDNA3/KiSS-1的成功构建,为该基因相应蛋白质的表达和其抗体的制备研究提供基础.