一氧化氮与Alzheimer病(综述)

目的 概述了在Alzheimer病（AD）脑内一氧化氮（NO）可能介导胶质细胞激活后对神经元的损伤，参与炎性变化的毒性机制。诱导型一氧化氮合酶（iNOS）在AD脑的胶质细胞和微血管内高表达，同时又在神经元内出现。而反应性胶质细胞内既有iNOS的激活又有神经元型NOS（nNOS）激活，共同产生过量的、具有神经毒性的NO。     

一氧化氮和一氧化氮合酶在大鼠局灶性脑缺血中的表达特点

目的建立脑缺血SD大鼠模型,探讨一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(NOS)在脑缺血模型中的表达特点。方法应用线栓法制作大脑中动脉阻塞(MCAO)局灶性脑缺血模型,根据缺血不同时间分为8组,设立假手术组和正常对照组,每组各有6只大鼠。应用硝酸还原酶法测定脑组织NO的含量,流式细胞术(FCM)定量检测硝基酪氨酸(NT)表达,化学比色法测定脑组织NOS的活性,免疫组织化学方法定位检测eNOS、nNOS和iNOS表达位置,逆转录反应系统(RT-PCR)半定量分析eNOS、nNOS和iNOS的 mRNA在脑缺血区域的表达。结果神经功能缺失评分发现缺血时间越长,神经功能缺失越明显;脑组织中NO含量与缺血时间正相关;缺血1h后NT阳性细胞百分比开始明显升高(9.50%);缺血0.5h时NOS的活性开始升高,缺血3d达到高峰[0.94nmol/(g.min)];免疫组织化学提示eNOS在神经细胞和血管内皮细胞胞浆均有表达,nNOS和iNOS抗体主要在神经细胞胞浆中表达;RT-PCR半定量分析在缺血早期(0.5h~6h),随着缺血时间延长,eNOS和nNOS表达增加,iNOS未见表达或低表达;缺血中晚期(6h~5d),iNOS高表达,并与缺血时间呈正相关,eNOS和nNOS表达明显减少。结论脑缺血时间延长,NOS的活性升高,NO在体内特异性代谢产物NT量增加,神经功能缺失越明显;NOS在缺血早期以eNOS和nNOS为主,在缺血晚期以iNOS为主。     

一氧化氮合酶抑制剂对脊髓损伤后运动功能的影响

目的观察诱导型和神经型一氧化氮合酶(iNOS,nNOS)抑制剂对大鼠脊髓损伤(SCI)后运动功能的影响和机理。方法大鼠脊髓压迫伤后分别给予iNOS和nNOS抑制剂—氨基胍(AG)和7-硝基吲唑(7-NI)进行治疗,24h后用分光光度法测定组织中一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶(NOS)活性,72h后用流式细胞仪检测神经细胞凋亡情况,4周后用电生理和动物行为学等指标评价运动功能的恢复情况。结果AG和7-NI均可以抑制组织中的NO含量,并使NOS活性下降,同时降低神经细胞的凋亡比率,对运动功能的恢复前者优于后者。结论脊髓损伤后应用NOS抑制剂可以使伤后运动功能得到改善,AG的作用似乎更明显,提示iNOS活性变化可能对脊髓损伤的恢复更具决定作用。     

一氧化氮合酶与脑缺血早期神经损伤关系研究

目的:探讨大鼠脑缺血早期脑内3种亚型一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的表达及作用。方法:采用免疫组织化学方法,用三型NOS的多克隆抗体检测大鼠局灶性脑缺血15、30min及1、2、3、6 h NOS在脑内的表达情况。结果:局灶性脑缺血1 h内缺血侧基底节区内神经元型NOS(nNOS)表达上调;脑缺血1 h内在缺血区小血管壁及3 h时在缺血边缘区小血管壁出现内皮型NOS(eNOS)两次上调。局灶性脑缺血6 h内神经组织中未见诱生型NOS(iNOS)表达。结论:在脑缺血的超早期出现结构型NOS(nNOS及eNOS)的上调表达,此时可能同时存在nNOS的神经损伤作用及eNOS的神经保护作用。     

Aβ1—40海马注射对大鼠脑内一氧化氮合酶表达的影响

目的探讨一氧化氮合酶(NOS)在β淀粉样蛋白(Aβ)神经毒性及阿尔茨海默病(AD)病理机制中的作用.方法应用免疫组化方法,观察大鼠海马齿状回Aβ1-40注射后神经元型一氧化氮合酶(nNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达变化.结果正常大鼠海马齿状回区含nNOS神经元计数为8.96±0.35个/视野;生理盐水注射后局部含nNOS神经元无明显变化(8.97±0.29个/视野);Aβ1-40注射后,注射区周围含nNOS神经元数目显著减少(2.98±0.24个/视野).正常及生理盐水注射组脑内未见iNOS表达;Aβ1-40注射后2d、10d和30d,注射区持续出现大量含iNOS的胶质细胞(主要为星形胶质细胞),反应面积分别为0.905±0.082、0.962±0.161、0.935±0.125mm2.结论Aβ1-40海马注射可损伤局部含nNOS神经元及诱导胶质细胞iNOS表达,NOS在Aβ神经毒性和AD发病中有重要作用.     

慢性间断性缺氧诱导一氧化氮合酶表达的研究

目的:建立大鼠缺氧模型,检测神经元型一氧化氮合酶(nNOS)及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达情况。方法:1.建立缺氧模型:将SD大鼠置于常压低氧舱中,充入氮气调节氧浓度至所需氧浓度。2.动物分组:(1)急性缺氧组:在低氧舱中缺氧1.5小时。(2)慢性间断性缺氧组:每日在低氧舱中6小时。每周缺氧6天,共缺氧28天。3.采用免疫组化法检测nNOS和iNOS的表达。4.统计学分析检验。结果:急性缺氧后,iNOS、nNOS阳性神经元增加;慢性缺氧后,iNOS、nNOS阳性神经元仍持续增多,慢性缺氧时增加iNOS-IR细胞远远多于nNOS-IR细胞。结论:我们的研究表明缺氧可引起iNOS、nNOS阳性神经元增加,NOS亚型表达时间的不同说明其脑损伤具有阶段性。     

Aβ_(1-40)海马注射对大鼠脑内一氧化氮合酶表达的影响

目的　探讨一氧化氮合酶 (NOS)在 β淀粉样蛋白 (Aβ)神经毒性及阿尔茨海默病 (AD)病理机制中的作用。方法　应用免疫组化方法 ,观察大鼠海马齿状回Aβ1 4 0 注射后神经元型一氧化氮合酶 (nNOS)和诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)表达变化。结果　正常大鼠海马齿状回区含nNOS神经元计数为 8 96± 0 35个 /视野 ;生理盐水注射后局部含nNOS神经元无明显变化 (8 97± 0 2 9个 /视野 ) ;Aβ1 4 0 注射后 ,注射区周围含nNOS神经元数目显著减少 (2 98± 0 2 4个 /视野 )。正常及生理盐水注射组脑内未见iNOS表达 ;Aβ1 4 0 注射后 2d、10d和 30d ,注射区持续出现大量含iNOS的胶质细胞 (主要为星形胶质细胞 ) ,反应面积分别为 0 90 5± 0 0 82、0 96 2± 0 16 1、0 935± 0 12 5mm2 。结论　Aβ1 4 0 海马注射可损伤局部含nNOS神经元及诱导胶质细胞iNOS表达 ,NOS在Aβ神经毒性和AD发病中有重要作用。     

依达拉奉预处理对小鼠脑缺血再灌注损伤后皮质一氧化氮合酶表达的影响

目的探讨依达拉奉预处理对小鼠脑缺血再灌注(IR)损伤后皮质一氧化氮合酶(NOS)表达的影响。方法 48只健康ICR小鼠被分为假手术组、对照组和依达拉奉组。依达拉奉组和对照组分别给予依达拉奉3 mg/(kg.d)和同等体积的生理盐水腹腔注射共7 d,然后建立小鼠IR模型;缺血1 h、再灌注24 h时应用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法测量各组脑梗死体积,应用免疫组化法检测各组小鼠皮质神经元型、、诱导型和内皮型NOS(nNOS、iNOS、eNOS)阳性细胞数。结果与假手术组比较,对照组小鼠皮质nNOS、iNOS和eNOS阳性细胞数明显增多(均P<0.05);与对照组比较,依达拉奉组脑梗死体积明显缩小,皮质nNOS和iNOS阳性细胞数明显减少,eNOS阳性细胞数明显增多(均P<0.05)。结论依达拉奉预处理可以影响IR小鼠皮质nNOS、iNOS和eNOS的表达,发挥神经保护作用。     

脑室内注射乙酰胆碱受体抗体IgG对大鼠神经元凋亡及一氧化氮合酶表达的影响

目的研究乙酰胆碱受体抗体(AchRab)对大鼠脑内神经元的损害及一氧化氮合酶(NOS)在损害中所起的作用，探讨重症肌无力(MG)中枢神经系统损害的机制。方法将AchRab IgG或健康人的IgG注入大鼠侧脑室。HE染色、TUNEL法检测细胞凋亡；免疫组化方法观察大鼠皮质、海马及杏仁核神经元型一氧化氮合酶(nNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达变化。结果2周后实验组皮质、海马及杏仁核凋亡细胞明显增多，对照组仅见少量凋亡。实验组皮质、海马及杏仁核nNOS神经元数目明显减少。实验组及对照组脑内细胞均来见iNOS表达。结论AchRab脑内注射可诱导神经元凋亡；损伤皮质。海马及杏仁核nNOS神经元；但未能诱导脑内细胞iNOS表达。神经元凋亡损害参与了AchRab对中枢神经损害的机制；nNOS神经元的减少，可能与MG认知功能障碍有密切关系；而神经元的损伤可能与NO的毒性作用无关。     

NOS抑制剂对缺血再灌注脑组织rCBF及白细胞浸润的影响研究

目的应用非选择性NOS抑制剂L－NAME和选择性iNOS抑制剂AG治疗鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤。通过对脑梗死体积、rCBF和白细胞浸润程度的观察，研究探讨不同类型NOS抑制剂治疗脑梗死的机制。方法采用线检法制作鼠大脑中动脉缺血再灌注模型，不同缺血及再灌注时间测定脑梗死体积、rCBF、缺血脑组织MPO酶活性。结果应用L－NAME（15mg／kg，ip）不但阻碍再灌注后rCBF的恢复，也增加缺血脑组织MPO酶活性（中性白细胞浸润增加），致脑梗死体积增加，脑损害加重；而AG（150mg／kg，ip）可有效降低脑梗死体积，且不影响rCBF的恢复和中性白细胞浸润。结论早期过度抑制神经元和内皮细胞NO对血流量的调节和抗白细胞粘附浸润作用可能是L-NAME加重缺血再灌注脑损害的重要原因之一，而选择性iNOS抑制剂有确切的脑保护作用。     

重症肌无力患者IgG对大鼠脑内NOS不同时间表达的影响

目的观察重症肌无力(myasthenia gravis,MG)患者IgG(AchRab)对大鼠脑内一氧化氮合酶(NOS)表达的影响,探讨NOS在MG中造成中枢神经系统损害的机制.方法将AchRab IgG或健康人的IgG注入大鼠侧脑室,1次/d,连续4次.免疫组化方法观察不同时间点大鼠脑皮质、海马及杏仁核神经元型一氧化氮合酶(nNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达变化.结果侧脑室注射后1周实验组大鼠皮质、海马神经元nNOS表达量明显减少,后2周实验组皮质、海马神经元nNOS表达下降更为明显,同时杏仁核神经元nNOS表达量也减少;实验组及对照组脑内细胞均未见iNOS表达.结论AchRab侧脑室内注射可引起大鼠皮质、海马及杏仁核神经元nNOS表达量减少,且2周内这种减少效应随时间延长而增强,但未能诱导脑内细胞iNOS表达,提示AchRab尚可通过抑制大鼠中枢神经系统nNOS表达,降低脑内正常的一氧化氮浓度,减弱一氧化氮对脑组织的保护作用,增加神经元的易损性.     

脑缺血再灌注损伤后一氧化氮合酶表达变化及知母总皂苷对其影响

目的观察脑缺血再灌注损伤后3型—氧化氮合酶(NOS)在脑内表达的变化,了解知母总皂苷(SAaB)对它们表达的影响。方法大鼠灌胃给药7d,采用线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型,观察大鼠神经功能损害,利用免疫组织化学法观察脑组织中3型NOS表达。结果缺血再灌注组大鼠表现出明显神经功能障碍,神经元型NOS(nNOS)含量明显升高,内皮型NOS (eNOS)仅轻度升高。SAaB低、高剂量治疗组大鼠神经功能障碍较轻,同时脑组织中nNOS表达明显降低,而eNOS的表达增强,经图像分析比较后显示各组表达强度差异具有统计学意义(P＜0．05)。结论各型NOS的表达变化在脑缺血再灌注损伤的机制中起着重要作用,推测SAaB因其减低nNOS表达同时增加eNOS表达的作用,而表现出一定的神经保护作用。     

一氧化氮合酶在脑缺血再灌注中的双重作用

目的 探讨短暂脑缺血再灌注后大鼠脑内3型一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的表达及作用，为脑缺血治疗提供理论依据。方法 采用免疫组织化学方法，用3型NOS的多克隆抗体检测大鼠局灶性脑缺血2h再灌注15min及22h NOS在脑内的表达情况。结果 大鼠脑缺血2h再灌注15min，在脑缺血边缘区的血管壁及神经细胞出现内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)上调表达；脑缺血2h再灌注22h，在脑梗死区内表达神经元型一氧化氮合酶(neuronal mitric oxide synthase，nNOS)的神经细胞减少，并出现表达诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的胶质细胞，同时梗死边缘区血管及神经细胞出现eNOS及iNOS的上调表达。结论 在短暂脑缺血再灌注早期，缺血区周围可能有eNOS相关的保护机制；亚急性期eNOS及iNOS的保护及损伤机制并存；因此，在短暂脑缺血早期恢复灌注后予选择性iNOS抑制剂及促进eNOS活性有可能减少迟发性神经损伤。     

人工合成E-选择素对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后脑组织一氧化氮合酶表达的影响

目的 探讨人工合成E-选择素对大鼠局灶性脑缺血/再灌注（I/R）损伤后脑组织一氧化氮合酶（NOS）及血清一氧化氮（NO）含量的影响.方法 采用改良的Zea Longa法建立脑I/R损伤模型.66只雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组和人工合成E-选择素治疗组（治疗组）.治疗组大鼠采用股静脉注射人工合成E-选择素10 mg·kg-1.应用硝酸盐还原法测定血清中NO含量和免疫组化法检测缺血区脑组织神经型一氧化氮合酶（nNOS）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）阳性细胞数.结果 ①NO：以对照组NO含量为正常生理数据,模型组脑缺血2h/再灌注2～24h NO含量呈上升趋势,24 h时达高峰,72 h有所降低但仍高于对照组,各时间点与对照组比较明显增高（P＜0.01）;治疗组NO变化趋势同模型组,NO含量较模型组减少（P＜0.05）,较对照组增多（P＜0.01）.②NOS：以对照组nNOS、iNOS阳性细胞数为正常生理数据,模型组nNOS阳性细胞在脑缺血2h/再灌注2h后开始表达,12h达高峰,至24h开始降低,各时间点与对照组比较明显增高（P＜0.01）;模型组iNOS阳性细胞在脑缺血2h/再灌注2h开始出现,并持续增多,随时间延长呈上升趋势,24h达高峰,至72 h出现下降,各时间点与对照组比较明显增多（P＜0.01）;治疗组各时间点nNOS、iNOS阳性细胞变化趋势同模型组,但较模型组减少（P＜0.05）,较对照组增多（P＜0.01）.结论 大鼠脑I/R损伤后脑组织NOS活性表达增多,NO浓度升高导致脑组织损伤;人工合成E-选择素通过降低NOS表达,减少NO释放、减轻炎症反应和脑I/R损伤,起脑保护作用.     

脑缺血耐受过程中NO作用机制的研究进展

缺血耐受现象自1970年由Maroko等[1]提出以来,随着研究深入,脑缺血耐受(ischemictolerance,IT)逐渐成为人们关注的课题.IT的形成过程涉及热休克蛋白、兴奋性氨基酸、腺苷、凋亡相关基因,以及信号传导通路等的变化.一氧化氮(nitric oxide,NO)作为血管活性物质,在IT的三个阶段[2](缺血预适应、药物预适应和缺血后适应)中发挥着重要作用,由于在中枢神经系统中NOS来源不同,分为内皮型(eNOS)、神经元型(nNOS)以及诱导型(iNOS).血管内皮细胞中的eNOS主要表现为有利的神经保护作用[3],而分布于神经元的nNOS及分布于炎性细胞的iNOS则主要表现为神经毒性作用[4-5],故称NO在IT过程中具有“双刃剑”作用[6].     

L-NAME减少三叉神经脊束核尾侧段和上颈髓后角c-fos和nNOS的表达

目的:进一步研究NO在偏头痛发病机制中的作用,探讨三叉神经血管反射的中枢机制。方法:应用电刺激猫上矢状窦区硬脑膜动物模型,冰冻组织连续切片后行免疫组化染色,分别观察了NOS抑制剂Nω-nitro-L-argi-nine methylester(L-NAME,100mg/kg)对下延髓、上颈髓c-fos蛋白和神经元型NOS(nNOS)表达的影响。结果:c-fos和nNOS阳性神经元主要位于延髓三叉神经脊束核尾侧段和C1后角的浅层(Ⅰ、Ⅱ层),其深层、孤束缝核和中央核、中央导水管两侧可见数个直径较大、轴突较长的nNOS阳性神经元;而nNOS阳性神经纤维遍布后角及中央导水管两侧,并似向前角和后角浅层方向投射,其中后角浅层着色明显比其它部位深。电刺激后可见较长的纤维呈串珠样改变。刺激组动物的c-fos及nNOS阳性神经元数均比假手术对照组明显增加(P<0.01),L-NAME组比刺激组明显减少(P<0.01),而刺激组动物的c-fos及nNOS阳性神经元数与生理盐水组相比均无显著差异(P>0.05)。结论:刺激猫上矢状窦区硬脑膜可激活三叉神经脑干中枢神经元,L-NAME可能通过抑制NO的生成阻断此部位神经元的激活,从而终止偏头痛发作。     

神经元型一氧化氮合酶在学习记忆过程中的变化和作用

目的　探讨神经元型一氧化氮合酶 (neuronalnitricoxidesynthase,nNOS)及一氧化氮 (nitricoxide ,NO)在学习记忆机制中的相关作用。方法　采用免疫组化方法观察Y迷宫空间辨别学习训练后大鼠不同脑区nNOS表达变化 ,并探讨特异性nNOS抑制剂 7 nitroindozal(7 NI)、钙拮抗剂尼莫通 (nimotop)腹腔注射对大鼠学习获得和记忆再现能力的影响。结果　学习训练后海马各亚区nNOS样神经元数量及染色强度明显增加 ,而皮层和纹状体区则无显著变化 ;7 NI以剂量依赖方式损伤大鼠的学习获得能力 ,但不影响记忆再现 ,尼莫通则对这两种能力均有破坏。结论　提示学习记忆过程可能伴有nNOS合成及活性增加 ,nNOS/NO在学习获得阶段具有重要作用。     

NOS、p38MAPK、Caspase-3介导大鼠脑缺血神经细胞凋亡可能通路的实验研究

目的探讨脑缺血后细胞凋亡发生的可能机制以及神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated proteinkinasep38,p38MAPK)和半光氨酸蛋白酶-3(caspase-3)在脑缺血后神经细胞凋亡中的共同作用机制。方法采用线栓法闭塞大鼠大脑中动脉(middle cerebral artery occlusion,MACO)建立脑缺血SD大鼠模型,应用透射电镜观察脑缺血对脑组织超微结构的影响,流式细胞仪方法(FCM)分别定量检测细胞凋亡率,半定量RT-PCR检测nNOS、iNOS,p38MAPK和Caspase-3mRNA表达水平。结果透视电镜下脑缺血6h出现核固缩,缺血12h出现细胞核分裂,缺血24h出现凋亡小体;FCM检测细胞凋亡百分率随着缺血时间延长而增加,缺血72h达到高峰,约70.37%;RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳显示nNOS、iNOS、p38MAPK和Caspase-3mRNA的特异性片段大小分别为501、342、250和342bp,但mRNA表达量不一致,nNOS mRNA主要在缺血早期表达,iNOS、p38MAPK和Caspase-3mRNA在缺血中晚期表达,并在缺血3~5d,后三种基因的表达量达到高峰。结论脑缺血区域发生典型的神经细胞凋亡现象,nNOS来源的NOS在缺血早期发挥神经毒性作用,iNOS来源的NOS在缺血晚期发挥神经毒性作用;NOS,p38MAPK和Caspase-3三种基因的相互关系可能构成介导缺血神经细胞凋亡的通路之一。     

帕金森病大鼠模型神经元型一氧化氮合酶(nNOS)阳性神经元的实验研究

目的 观察研究帕金森病(PD)大鼠模型纹状体神经元型一氧化氮合酶(nNOS)阳性神经元，探讨一氧化氮(NO)在PD发病机制中所起作用。方法 应用立体定向技术建立6-OHDA毁损的大鼠PD模型，通过多巴胺受体激动剂阿扑吗啡(APO)测试大鼠旋转行为，免疫组化方法观察黑质酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元和纹状体nNOS阳性神经元的变化。结果 大鼠6-OHDA损毁侧黑质TH阳性神经元数目较对侧明显减少，双侧纹状体nNOS阳性神经元数目无显著差异。结论 6-OHDA对TH阳性神经元有损伤作用，而NOS阳性神经元对其具有抵抗作用。NO可能参与了PD发病机制。     

大鼠局灶性脑缺血/再灌注脑组织NADPH-d染色研究

目的　NO作为中枢神经系统的信使物质和损伤状态下的氧自由基物质在脑缺血性损害中的作用非常复杂 ,研究缺血脑组织内NOS表达的变化对探讨脑缺血损害机制和脑保护十分必要。方法　大鼠大脑中动脉阻塞 (MCAO)脑缺血 /再灌注模型采用线栓法制作 ;脑组织NOS的表达采用常规NADPH d组化染色法。结果　缺血 /再灌注后脑组织神经元NADPH d染色变浅 ,阳性神经元数量减少或消失 ,而脑损伤区内NADPH d染色阳性的脑血管数量增加 ,染色加深。缺血 /再灌注 7d后NADPH d染色逐渐恢复正常。结论　缺血 /再灌注脑损伤中NO的增加可能与脑组织NADPH d表达增加有关 ,但脑组织NADPH d染色尚不能反映缺血脑组织内炎性细胞和胶质细胞NOS(主要是iNOS)表达情况 ,有必要进一步研究。