实验性大鼠急性脑缺血细胞凋亡与相关蛋白表达的关系

目的：研究大鼠脑缺血再灌注后细胞凋亡及p53，Bcl-2蛋白家族表达的变化，并探讨它们在细胞凋亡中的作用。方法：实验在华北煤炭医学院形态实验室完成。54只大鼠用随机数字表法随机分成3组：脑缺血组(42只)、假手术组(6只)和正常组(6只)。脑缺血组又分为7组：即缺血2h再灌注1，3，6，12，24，48和72h组(n=6)。采用线栓法制作局灶性脑缺血再灌注模型，用TUNEL法检测细胞凋亡的变化，用免疫组化法检测p53，Bcl-2和Bax蛋白的表达水平。结果：①缺血2h再灌注1h皮质区可见凋亡细胞[(7．83&;#177;1．72)个／高倍视野]，24～48h达高峰[(43．33&;#177;5．20)个／高倍视野，(48．50&;#177;6．25)个／高倍视野]，72h开始下降[(26．67&;#177;3．56)个／高倍视野](P&;lt;0．05，P&;lt;0．01)；缺血2h再灌注1h皮质区可见p53蛋白阳性细胞[(14．35&;#177;1．92)个／高倍视野]，24h达高峰[(48．00&;#177;6．42)个／高倍视野]，48h后开始下降[(31．00&;#177;6．60)个／高倍视野](P&;lt;0．05，P&;lt;0．01)；缺血2h再灌注1h皮质区可见Bcl-2蛋白阳性细胞[(28．62&;#177;6．80)个／高倍视野]，3h达高峰[(56．50&;#177;7．87)个／高倍视野]，6h后开始下降[(45．00&;#177;6．63)个／高倍视野](P&;lt;0．01)；缺血2h再灌注1h皮质区可见Bax蛋白阳性细胞[(45．83&;#177;4．07)个／高倍视野]，24h达高峰[(61．00&;#177;8．88)个／高倍视野]，48h开始逐渐下降[(45．83&;#177;6．49)个／高倍视野](P&;lt;0．05，P&;lt;0．01)。②缺血再灌注后不同时间点细胞凋亡数与p53及Bax蛋白的阳性表达数呈正相关(r=0．843，P&;lt;0．001；r=0．840，P&;lt;0．001)，与Bcl-2蛋白的阳性表达数呈负相关(r=-0．387，P&;lt;0．05)。结论：大鼠脑缺血再灌注后，缺血周边区发生明显的细胞凋亡，同时伴有p53及Bax蛋白表达增加及Bcl-2表达降低，p53及Bax蛋白表达对细胞凋亡起促进作用，而Bcl-2蛋白表达则对细胞凋亡起抑制作用。     

黄芪对脑缺血再灌注后神经细胞凋亡及Bcl-2蛋白表达的影响

目的:探讨补气益血中药黄芪对脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡及Bcl-2蛋白表达的影响。方法:实验于2004-06/11在第四军医大学西京医院中医科实验室进行。取36只SD大鼠随机分为3组,每组12只。①模型组:以生理盐水10mL/(kg·d)灌胃,1次/d,7d后线栓法制备大鼠局灶性脑缺血2h再灌注模型,6只在再灌注6h麻醉状态下处死取脑,免疫组织化学法与医学图像分析结合的方法检测Bcl-2蛋白的表达;剩余6只在再灌注24h麻醉状态下处死取脑,TUNEL法检测大鼠脑组织神经细胞凋亡。②黄芪组:以黄芪煎剂6g/(kg·d)灌胃7d,其余处理同模型组。③假手术组:不阻塞大脑中动脉,其余处理同模型组。结果:36只大鼠全部进入结果分析。①TUNEL阳性神经细胞数目:模型组高于假手术组[(49.9±9.8),(1.6±0.6)个/视野,t=12.05,P<0.01],黄芪组低于模型组[(30.2±2.1)个/视野,t=4.81,P<0.01]。②Bcl-2阳性细胞数目:模型组显著高于假手术组([12.5±1.2),(1.7±0.6)个/视野,t=19.71,P<0.01],黄芪组显著高于模型组([16.4±2.2)个/视野,t=3.17,P<0.01]。③Bcl-2蛋白平均灰度:模型组明显低于假手术组(182.8±13.6,205.9±11.5,t=3.18,P<0.01),黄芪组显著低于模型组(160.8±10.2,t=3.82,P<0.01)。结论:黄芪通过上调Bcl-2蛋白的表达可抑制缺血再灌注脑组织神经细胞凋亡,对脑缺血再灌注损伤有明显的神经保护作用。     

藻酸双酯钠对大鼠急性脑缺血再灌注后Bcl-2,Bax表达的影响

目的:探讨大鼠急性脑缺血再灌注后Bcl-2,Bax表达及藻酸双酯钠对大鼠急性脑缺血再灌注后Bcl-2,Bax表达的影响。方法:实验于2004-01/04在华北煤炭医学院形态实验室完成。96只健康雄性Wister大鼠用随机数字表法随机分成4组:脑缺血组(42只)、藻酸双酯钠治疗组(42只)、假手术组(6只)、正常对照组(6只)。前两组又分为7组:即缺血2h再灌注1,3,6,12,24,48和72h组(n=6)。采用线栓法制作大鼠大脑中动脉阻断再灌注模型,用免疫组织化法分别检测缺血组与藻酸双酯钠治疗组大鼠脑缺血2h再灌注1,3,6,12,24,48和72hBcl-2,Bax的表达水平。结果:①皮质缺血周边区Bcl-2及Bax的阳性表达随再灌注时间不同而不同,分别于缺血2h再灌注3h犤(56.50±7.87)个/高倍视野犦及再灌注24h犤(61.00±8.88)个/高倍视野犦达高峰。②与缺血组相比,藻酸双酯钠治疗组Bax的表达于再灌注后12h犤(36.67±7.03)个/高倍视野犦、24h犤(50.50±6.09)个/高倍视野犦、48h犤(36.67±6.77)个/高倍视野犦及72h犤(29.83±5.38)个/高倍视野犦均显著减少(P<0.05,P<0.01),Bcl-2的表达未见明显变化(P>0.05)。结论:藻酸双酯钠可抑制脑缺血再灌注后Bax的表达,对神经细胞具有保护作用。     

川芎嗪对局灶性脑缺血再灌注后Bcl-2和Fas-L表达的影响

目的:探讨川芎嗪对大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑组织Bcl-2蛋白、Fas-L蛋白表达的影响。方法:用免疫组化与医学图像分析相结合的方法检测假手术组、模型组、川芎嗪干预组大鼠大脑皮质Bcl-2,Fas-L蛋白阳性细胞的数目及平均灰度值。结果:①模型组缺血侧脑组织Bcl-2蛋白阳性细胞数目(15.8±3.5)个/视野较假手术组假手术侧(3.7±0.9)个/视野增多,平均灰度(209.1±6.0)较假手术组假手术侧(226.3±6.4)降低(P<0.01);假手术组假手术侧脑组织无Fas-L蛋白表达,模型组缺血侧脑组织Fas-L蛋白阳性细胞数目为(17.2±2.3)个/视野,平均灰度为161.2±9.2。②在缺血侧脑组织,与模型组比较,川芎嗪干预组Bcl-2蛋白阳性细胞数目(25.6±3.9)个/视野增多,平均灰度(190.8±6.1)降低(P<0.05);Fas-L蛋白阳性细胞数目(11.4±2.1)个/视野减少,平均灰度(176.8±8.8)升高(P<0.05)。结论:局灶性脑缺血再灌注后Bcl-2,Fas-L蛋白表达增强;川芎嗪可上调Bcl-2蛋白的表达,同时下调Fas-L蛋白的表达,这可能是川芎嗪治疗缺血性脑血管病的机制之一。     

脑缺血预处理后Caspase-8蛋白的表达与神经元的保护作用

目的探讨脑缺血预处理后凋亡相关基因 Caspase- 8蛋白表达与神经元保护作用的关系. 方法雄性 Wistar大鼠 70只,随机分为对照组( 10只)、预处理组( 10只)、缺血预处理组( 25只)和缺血组( 25只).四血管阻断法复制全脑缺血模型,尼氏和 TUNEL染色法观察脑皮质及海马 CA1区神经元数和凋亡细胞数,免疫组化方法检测 Caspase- 8蛋白在缺血预处理后表达变化情况. 结果①缺血 7 d时,缺血预处理组皮质及海马 CA1区神经元数无显著变化 [( 268± 8.5)个 /视野 ],缺血组神经元数则显著减少 [(135.0± 5.6)个 /视野 ].②缺血预处理组 Caspase- 8蛋白缺血 12 h表达升高 [( 125.6± 9.0)个 /视野 ], 24 h达高峰 [( 167.0± 8.1)个 /视野 ]; 缺血组 caspase- 8蛋白缺血 6 h表达升高 [( 154.2± 18.4)个 /视野 ], 12 h达高峰 [( 222.8± 17.1)个 /视野 ];各对应时点缺血组 Caspase- 8蛋白阳性表达细胞较缺血预处理组明显增多.③缺血预处理组和缺血组均在缺血 12 h皮质及海马 CA1区凋亡细胞数开始增多 [( 15.5± 2.1), (39.8± 3.9)个 /视野 ],缺血 48 h凋亡细胞数达高峰 [( 68.3± 13.6), (328.4± 24.0)个 /视野 ],但缺血组凋亡细胞数较缺血预处理组显著增多. 结论全脑缺血可能通过诱导 Caspase- 8蛋白的表达增多,启动细胞凋亡,导致缺血后神经元凋亡的发生.缺血预处理延缓并降低缺血后 Caspase- 8蛋白表达并减少细胞凋亡的发生可能是其神经元保护作用机制之一.     

肌苷对脑缺血再灌注后脑组织细胞周期蛋白D1基因表达的影响

目的:观察大鼠局灶性脑缺血再灌注后细胞周期蛋白D1(CyclinD1)mRNA的表达与神经细胞凋亡的关系以及肌苷的干预作用,从细胞增殖角度探讨肌苷的神经保护作用机制。方法:应用线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)再灌注模型,腹腔注射肌苷注射液,应用原位末端标记(TUNEL)和原位杂交技术分别检测大鼠脑缺血再灌流不同时间点皮质区和纹状体区神经细胞CyclinD1mRNA的表达与凋亡的变化。结果:脑缺血再灌注2h后皮质区与纹状体区即出现少量凋亡神经细胞,皮质区1d达高峰(72.8±2.66)个/视野,纹状体区2d达高峰(96.75±4.37)个/视野,之后逐渐减少,至再灌注14d(5.50±0.65)个/视野接近假手术组水平(3.75±0.85)个/视野;肌苷治疗组凋亡神经细胞较对照组显著减少;脑缺血再灌流后皮质区与纹状体区的缺血周围区神经细胞CyclinD1mRNA的表达于2h逐渐增强,皮质区和纹状体区分别于12h和1d达高峰,以后逐渐下降;肌苷治疗组CyclinD1mRNA表达较对照组显著减弱。结论:脑缺血再灌流CyclinD1mRNA的表达时序先于凋亡细胞的出现,其异常表达可能诱导了神经元的凋亡。肌苷可在脑缺血再灌注后抑制CyclinD1mRNA的表达,从而减少神经细胞凋亡,起到神经保护作用。     

胰岛素对大鼠脑缺血再灌注时神经元凋亡及其相应基因的调控

目的观察胰岛素(insulin,RI)对缺血再灌注损伤后细胞凋亡及其相应基因的调控作用,评估RI对脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法将健康wistar大鼠56只,随机分为对照组、缺血再灌注盐水组(NS)、缺血再灌注胰岛素组(RI)。采用pulsinelli4血管阻塞模型,观察RI、NS在4,24,48h海马CA1区存活神经元数目,TUNEL阳性细胞数目,Bcl-2蛋白的表达,以观察比较缺血再灌注阶段细胞凋亡的变化。结果再灌注NS组CA1区神经元数目(36±6)个/mm2较再灌注RI组(88±9)个/mm2少(t=3.34,P<0.01)。再灌注后CA1区细胞凋亡数:4h时再灌注NS组(12±3)个/mm2高于再灌注RI(8±1)个/mm2和假手术组(2±1)个/mm2:组间比较,F=127.66,P<0.001。Bcl-2对海马CA1细胞凋亡评估4h时,再灌注NS组43.0±9.8,高于再灌注RI组24.0±5.4和假手术组2.7±0.8。结论全脑缺血再灌注时急用RI可减轻脑缺血再灌注神经元凋亡,对脑缺血再灌注损伤引起的神经元延迟性坏死有保护作用。     

藻酸双酯钠对大鼠急性脑缺血再灌注后Bcl-2，Bax表达的影响

目的：探讨大鼠急性脑缺血再灌注后Bcl-2，Bax表达及藻酸双酯钠对大鼠急性脑缺血再灌注后Bcl-2，Bax表达的影响。方法：实验于2004-01／04在华北煤炭医学院形态实验室完成。96只健康雄性Wister大鼠用随机数字表法随机分成4组：脑缺血组(42只)、藻酸双酯钠治疗组(42只)、假手术组(6只)、正常对照组(6只)。前两组又分为7组：即缺血2h再灌注1，3，6，12，24，48和72h组(n=6)。采用线栓法制作大鼠大脑中动脉阻断再灌注模型，用免疫组织化法分别检测缺血组与藻酸双酯钠治疗组大鼠脑缺血2h再灌注1，3，6，12，24，48和72hBcl-2。Bax的表达水平。结果：①皮质缺血周边区Bcl-2及Bax的阳性表达随再灌注时间不同而不同，分别于缺血2h再灌注3h[(56．50&;#177;7．87)个／高倍视野]及再灌注24h[(61．00&;#177;8．88)个／高倍视野]达高峰。②与缺血组相比，藻酸双酯钠治疗组Bax的表达于再灌注后12h[(36．67&;#177;7．03)个／高倍视野]、24h[(50．50&;#177;6．09)个／高倍视野]、48h[(36．67&;#177;6．77)个／高倍视野]及72h[(29．83&;#177;5．38)个／高倍视野]均显著减少(P&;lt;0．05，P&;lt;0．01)，Bcl-2的表达未见明显变化(P&;gt;0．05)。结论：藻酸双酯钠可抑制脑缺血再灌注后Bax的表达，对神经细胞具有保护作用。     

促红细胞生成素对全脑缺血再灌注后神经细胞凋亡和诱导型一氧化氮合酶蛋白的影响

目的:观察促红细胞生成素(EPO)对短暂性全脑缺血再灌注后海马CA1区iNOS蛋白表达的影响,探讨其对缺血脑组织保护的可能机制。方法:应用四动脉血流阻断法制作大鼠短暂性全脑缺血再灌注模型;于再灌注开始时经腹腔注射EPO(3000U/kg);48h灌注取脑。苏木精—伊红染色和TUNEL法染色观察海马CA1区神经细胞坏死和凋亡。应用免疫组织化学方法检测iNOS蛋白的表达。结果:短暂性全脑缺血15min再灌注后48h,苏木精—伊红染色海马CA1区存活神经元细胞数正常组(211.28±7.95)个/视野,假手术组为(209.28±11.34)个/视野,EPO治疗组海马CA1区存活神经元细胞数为(170.28±8.12)个/视野,缺血组为(146.84±8.35)个/视野。EPO治疗组与缺血组比较差异有显著性意义(P<0.01)。TUNEL法凋亡细胞测定,正常组无阳性细胞,假手术组阳性细胞(152.48±18.52)个/视野,EPO治疗组有(1797.51±151.35)个/视野,缺血组有(2250.41±180.06)个/视野,两者比较差异有显著性意义(P<0.01)。iNOS蛋白的表达测定,正常组无阳性细胞,假手术组海马CA1区阳性细胞区灰度值为5.36±1.54,EPO治疗组为31.80±6.42,缺血组为49.46±8.96。EPO治疗组与缺血组比较,两者差异有显著性意义(P<0.01)。结论:EPO可减少大鼠短暂性全脑缺血再灌注后神经元的死亡和凋亡,抑制iNOS     

肌苷对脑缺血再灌注后脑组织细胞周期蛋白D1基因表达的影响

目的：观察大鼠局灶性脑缺血再灌注后细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)mRNA的表达与神经细胞凋亡的关系以及肌苷的干预作用，从细胞增殖角度探讨肌苷的神经保护作用机制。方法：应用线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)再灌注模型，腹腔注射肌苷注射液，应用原位末端标记(TUNEL)和原位杂交技术分别检测大鼠脑缺血再灌流不同时间点皮质区和纹状体区神经细胞Cvclin D1 mRNA的表达与凋亡的变化。结果：脑缺血再灌注2h后皮质区与纹状体区即出现少量凋亡神经细胞，皮质区1d达高峰[(72．8&;#177;2．66)个／视野]，纹状体区2d达高峰[(96．75&;#177;4．37)个／视野]，之后逐渐减少，至再灌注14d[(5．50&;#177;0．65)个／视野]接近假手术组水平[(3．75&;#177;0．85)个／视野]；肌苷治疗组凋亡神经细胞较对照组显著减少；脑缺血再灌流后皮质区与纹状体区的缺血周围区神经细胞Cyclin D1 mRNA的表达于2h逐渐增强，皮质区和纹状体区分别于12h和ld达高峰，以后逐渐下降；肌苷治疗组Cvclin D1 mRNA表达较对照组显著减弱。结论：脑缺血再灌流Cyclin D1 mRNA的表达时序先于凋亡细胞的出现．其异常表达可能诱导了神经元的凋亡。肌苷可在脑缺血再灌注后抑制Cyclin Dl mRNA的表达，从而减少神经细胞凋亡，起到神经保护作用。