LMP1与细胞凋亡

LMP1为EBV编码的病毒瘤蛋白,具有促进细胞增殖、调控细胞凋亡等多种生物学效应。LMP1有可能成为EBV相关肿瘤治疗的分子靶标。     

LMP1经TRADD促进鼻咽癌SP18细胞增殖

目的:探讨潜伏性膜蛋白1(LMP1)羧基末端活化区2(CTAR2)的肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域(TRADD)在鼻咽癌SP18细胞增殖中的作用及机制。方法:首先建立表达LMP1及CTAR2突变型LMP1(LMP1~(TRADD))的SP18细胞系。其次采用细胞生长曲线、平皿集落形成实验、软琼脂集落实验和流式细胞术观察LMP1~(TRADD)对SP18细胞增殖的影响。然后选用基因芯片检测SP18-LMP1和SP18-LMP1~(TRADD)细胞间的差异表达基因。结果:细胞生长曲线、软琼脂集落和平皿集落形成实验结果均显示,SP18-LMP1细胞生长与集落形成能力均较SP18-LMP1~(TRADD)细胞强(P0.01)。流式细胞术检测结果显示,SP18-LMP1细胞的增殖指数较SP18-LMP1~(TRADD)细胞高(P0.01)。筛选出63个增殖相关基因,其中SP18-LMP1~(TRADD)细胞中上调的基因33个,下调的基因30个。结论:TRADD活性区是LMP1促进SP18细胞增殖的重要功能活性位点。LMP1可能通过TRADD提高细胞增殖指数,诱导SP18细胞增殖。     

LMP1促鼻咽癌细胞生长与端粒酶活性

为探讨EB病毒潜伏膜蛋白 1(LMP1)促鼻咽癌细胞生长作用与端粒酶活性的关系 ,用LMP1基因真核表达质粒转染鼻咽癌CNE1细胞 ;脂质体介导端粒酶反义核酸处理转染细胞 ;MTT法检测细胞增殖能力 ;原位杂交法检测端粒酶逆转录酶 (hTERT)mRNA表达 ;免疫组化法检测LMP1蛋白表达。结果显示 :转染LMP1基因的细胞增殖能力和hTERTmRNA表达水平均显著高于未转染和转染空载质粒的细胞 (均P <0 0 1)。经端粒酶反义核酸作用 4 8h ,LMP1基因转染细胞的细胞增殖能力、hTERTmRNA和LMP1蛋白表达水平均显著低于空白对照组 (均P <0 0 1) ,反义核酸和脂质体处理组上述各指标无显著变化 ;反义核酸组LMP1基因转染细胞的增殖能力和hTERTmRNA表达水平仍均显著高于未转染细胞和转染空载质粒的细胞 (均P <0 0 1)。以上结果提示 :EB病毒LMP1的促鼻咽癌细胞生长作用与端粒酶活性密切相关。     

EB病毒潜伏膜蛋白LMP1的信号转导途径

ＥＢ病毒是一类与人伯基特淋巴瘤、鼻咽癌、何杰金氏病相关的γ单纯疱疹病毒，其潜伏膜蛋白（ＬＭＰ１）是具有转化活性的瘤蛋白。ＬＭＰ１通过信号转导途径活化核转录因子ＮＦκＢ和ＡＰ１，调控相关基因的表达。肿瘤坏死因子受体相关蛋白和肿瘤坏死因子受体死亡结构域以及ｃｊｕｎ氨基末端激酶和Ｒａｓ／ｒａｆ１分别参与了ＬＭＰ１活化ＮＦκＢ和ＡＰ１的信号转导途径     

鼻咽癌中EB病毒LMP1基因的序列变异

目的 检测广州地区鼻咽癌中EB病毒LMP1基因N-和C-末端区序列变异的热点,并探讨其产生的机制。方法 收集中山大学肿瘤医院未经治疗的鼻咽癌患者鼻咽新鲜活检标本63例。采用巢式聚合酶链反应（PCR）扩增EB病毒LMP1基因N-和C-末端区,用XhoⅠ对N-末端区扩增产物进行酶切分析,并检测C-末端区扩增产物30bp缺失的情况。采用四色荧光末端终止法对4例患者N-和C-末端区的8份扩增产物进行序列分析。结果 63例鼻咽癌组织EB病毒LMP1基因N-和C-末端区有4种序列变异类型：wt-XhoⅠ／wt-LMP1（4例,6．3％）、wt-XhoⅠ＆XhoⅠ-loss／del-LMP1（4例,6．3％）、wt-XhoⅠ／del-LMP1（5例,7．9％）和XhoⅠ-loss／del-LMP1（50例,79．5％）。序列分析显示：与B95-8细胞相比较,所有检测的鼻咽癌组织中EB病毒LMP1基因均发生了错义点突变和无义点突变。错义点突变数与无义点突变数之间的比值为2．25（9／4）。结论 广州地区鼻咽癌中EB病毒LMP1基因的序列变异类型以XhoⅠ-loss／del-LMP1占主导。LMP1基因N-末端区XhoⅠ酶切位点的丢失很可能是在C-末端区30bp缺失的基础上发生的。LMP1基因的4种序列变异类型可能代表了鼻咽癌变过程中EB病毒在宿主内演变的4个时相。     

LMP1对鼻咽癌细胞系CNE1癌基因微小RNA表达谱的影响

目的:比较鼻咽癌细胞系CNE1与其EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)稳定转染细胞系CNE1-LMP1的癌基因微小RNA(oncomiRs)表达谱的差异,探讨LMP1对鼻咽癌细胞系CNE1 oncomiRs表达的影响。方法:采用包含132个oncomiRs分子的microRNA芯片分析CNE1与CNE1-LMP1的表达差异,并采用荧光定量PCR验证差异表达明显的oncomiRs分子。结果:二者共检出30个miRNA分子,CNE1中检出miRNA分子19个;其中11个为CNE1-LMP1特异性表达。在共同表达的19个miRNA分子中,在CNE1-LMP1中表达升高2倍以上的miRNA分子有6个:hsa-miR-19b、hsa-miR-17-3p、hsa-miR-22、hsa-miR-149、hsa-miR-150和hsa-miR-188。没有表达降低2倍以上的分子。在CNE1-LMP1特异性表达的11个miRNA中,hsa-miR-122a呈高水平表达,其表达水平超过内对照。通过荧光定量PCR验证6个差异分子的表达,发现改变倍数与芯片结果一致(P0.01)。结论:LMP1能影响oncomiRs表达谱,可能是LMP1作为病毒癌基因发挥作用的另一重要途径。     

EB病毒LMP1促鼻咽上皮细胞增殖的蛋白分子鉴定

目的： 探讨EB病毒潜伏性膜蛋白 1(LMP1)促鼻咽上皮细胞增殖的分子机制。方法: 采用逆病毒感染的方法,将浓缩的逆病毒RV-pLNSX(空载体)和RV-LMP1分别感染鼻咽上皮细胞NP69,建立NP69-pLNSX与NP69-LMP1稳定表达细胞系,通过绘制细胞生长曲线、平皿克隆形成实验和软琼脂集落形成实验检测LMP1对NP69细胞增殖的影响;运用比较蛋白质组学方法鉴定LMP1在NP69细胞中参与调节的蛋白,并对部分蛋白表达进行验证。结果: (1) LMP1具有促鼻咽上皮细胞NP69增殖的作用(n=3,P<0.05)。(2) 鉴定了22个LMP1参与调节NP69细胞的蛋白(表达上调的蛋白9个,下调的13个),实时荧光定量RT-PCR和Western blotting证实了部分上述蛋白的差异表达。结论: LMP1可能通过参与调节keratin 19和vimentin等蛋白的表达促鼻咽上皮细胞NP69增殖。     

LMP1经Wnt1/β-catenin途径促进鼻咽癌干细胞SP18增殖

目的 探讨LMP1羧基端功能活性区促进鼻咽癌干细胞SP18增殖作用机制。方法 采用生长曲线、平皿克隆形成实验与软琼脂集落实验分析LMP1TRADD对SP18细胞增殖的作用;运用Western-blot检测SP18细胞中Wnt1、β-catenin与p-β-catenin蛋白的表达。结果 SP18-LMP1TRADD细胞的增殖能力较SP18-LMP1细胞减弱（P＜0.01）;与SP18-LMP1细胞比较,SP18-LMP1TRADD细胞中Wnt1与β-catenin表达降低,而p-β-catenin蛋白表达增加（P＜0.01）。结论 LMP1经Wnt1/β-catenin途径促进鼻咽癌干细胞SP18的增殖。     

EB病毒基因LMP1和EBNA2对支气管上皮细胞的转化

目的 观察Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ病毒（ＥＢＶ）对支气管上皮细胞的转化作用。方法 用ＥＢＮＡ２和ＬＭＰＩ的真核表达质粒同时转染永生化人胚支气管上皮细胞系ＴＲ,经潮霉素Ｂ筛选得到稳定转化细胞ＴＲ／ＬＭＰＩ－ＥＢＮＡ２。结果 原位杂效和Ｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔ证实ＴＲ／ＬＭＰＩ－ＥＢＮＡ２有ＥＢＮＡ２和ＬＭＰＩ的ｍＲＮＡ和蛋白表达。生长曲线,ＭＴＴ显示细胞增殖能力增强,软琼脂集落形成率ＴＲ／ＬＭＰＩ－Ｅ     

LMP1-CTAR3对鼻咽癌干细胞SP18生长的影响

背景：课题组前期构建了CTAR3缺失突变型LMP1(LMP1△232-351)表达载体,初步了解该活性区在LMP1发挥作用中扮演十分重要的角色。 目的：观察LMP1-CTAR3对鼻咽癌干细胞SP18生长的影响。 方法：采用逆病毒感染方式,建立稳定表达LMP1及CTAR3缺失突变型LMP1(LMP1△232-351)的鼻咽癌干细胞SP18细胞系,通过细胞生长曲线、软琼脂集落形成实验和平皿克隆形成实验观察LMP1△232-351对鼻咽癌干细胞SP18生长的影响,然后选用流式细胞术检测细胞周期,计算细胞增殖指数。另外,利用Western-blot检测细胞中JAK3蛋白的磷酸化水平。 结果与结论：①与SP18-LMP1细胞比较,SP18-LMP1△232-351细胞生长速度减慢,增殖指数降低(P < 0.01)。②在SP18-  LMP1△232-351细胞中JAK3的磷酸化水平低于SP18- LMP1细胞。结果说明LMP1-CTAR3可能通过影响SP18细胞中JAK3的磷酸化,下调细胞的增殖指数,降低促细胞增殖的能力。     

鼻咽癌细胞株SUNE1中EB病毒LMP1全基因克隆及部分？…

目的 研究广东地区鼻咽癌（ＮＰＣ）细胞株ＳＵＮＥ１中ＥＢ病毒ＬＭＰ１基因的结构特征。方法 利用聚合酶链反应从ＳＵＮＥ１细胞基因组中扩增ＬＭＰ１全长ＤＮＡ,并克隆到ｐｃＤＮＡ３载体中,采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧末端终止法测定ＳＵＮＥ－ＬＭＰ１ ３个外显子及２个内含子覆盖的序列,并与病毒原型Ｂ９５－８－ＬＭＰ１进行比较分析。结果 克隆到ｐｃＤＮＡ３中的ＳＵＮＥ１－ＬＭＰ１全基因长度为２．６ｋｂ,测序长度为     

EB病毒潜伏膜蛋白LMP1有关信号传导通路的研究进展

EB病毒的致癌性与细胞源性基因和潜伏感染基因有关，其中潜伏膜蛋白（1atent membrane protein，LMP）家族LMP1、LMP2A、LMP2B可干扰信号传导通路并诱导B细胞转化。     

鼻咽癌细胞株SUNE1中EB病毒LMP1全基因克隆及部分序列的测定

目的　研究广东地区鼻咽癌（ＮＰＣ） 细胞株ＳＵＮＥ１ 中ＥＢ病毒ＬＭＰ１ 基因的结构特征。方法　利用聚合酶链反应从ＳＵＮＥ１ 细胞基因组中扩增ＬＭＰ１ 全长ＤＮＡ,并克隆到ｐｃＤＮＡ３ 载体中,采用Ｓａｎｇｅｒ 双脱氧末端终止法测定ＳＵＮＥ１ＬＭＰ１ ３ 个外显子及２ 个内含子覆盖的序列,并与病毒原型Ｂ９５８ＬＭＰ１ 进行比较分析。结果　克隆到ｐｃＤＮＡ３ 中的ＳＵＮＥ１ＬＭＰ１ 全基因长度为２－６ ｋｂ,测序长度为１３１２ ｂｐ,与Ｂ９５８ＬＭＰ１ 比较,核苷酸与氨基酸的同源性分别为９８－５ ％ 和９６ ％ ,核苷酸及氨基酸变异主要在第３ 外显子,但无Ｃ端３４３～３５２ 密码子３０ 个碱基的缺失,第１ 外显子上有ＸｈｏⅠ酶切位点的丢失。结论　广东地区ＮＰＣ细胞株ＳＵＮＥ１ 中,病毒ＬＭＰ１ 基因与原型株之间尽管致瘤性存在差异,但仍具有较高的同源性。提示ＮＰＣ细胞中ＬＭＰ１ 的致瘤特征可能并非由于ＬＭＰ１ 基因某些特定核苷酸突变所致     

EBV LMP1和CMVpp65在肾脏疾病肾组织中的表达

目的 研究非洲淋巴细胞瘤病毒LMP1(EBV LMP1)、巨细胞病毒pp65(CMVpp65)在肾脏疾病患者肾组织中的表达情况,探讨病毒感染与人类肾脏疾病发生、发展的关系.方法 临床资料齐全的肾穿刺活检标本435例,免疫组化法检测EBV LMP1和CMVpp65在肾组织中的表达情况.结果 (1)175例(40.2%)肾组织中EBV LMP1表达阳性,狼疮性肾炎(LN)组及IgA肾病(IgAN)组与非免疫性肾病组及原发性肾炎(PGN)组比较,差异有统计学意义;170例(39.1%)肾组织中CMVpp65表达阳性,LN组与非免疫性肾病组及PGN组比较,差异有统计学意义;(2)PGN组初发患者与复发患者肾组织EBV LMP1、CMVpp65阳性率比较差异有统计学意义,其他病种则无;(3)合并感染与无合并感染患者EBV LMP1、CMVpp65阳性率比较差异均无统计学意义;(4)肾组织EBV LMP1表达阳性的LN患者血清anti-Sm-Ab阳性率高于阴性组(P<0.05,OR=6.00,95%CI:1.200～29.998);而CMVpp65表达阳性者血清anti-Sm-Ab阳性率低于阴性组(P<0.01,OR=0.156,95%CI:0.038～0.643).结论 肾组织EBV及CMV感染可能参与LN及IgAN的发病,其中EBV感染可能以分子拟态方式诱发系统性红斑狼疮.     

溃疡性结肠炎的IL-1β、IL-1RA、LMP2基因多态性研究

目的研究溃疡性结肠炎(UC)病人的R-1β、IL-1RA、LMP2基因多态性,并分析其与抗中性粒细胞胞浆抗体(AN-CA)及临床分型的关系.方法用PCR-限制性片段多态性(PCR-FLP)方法和序列特异性引物-PCR(PCR-SSP)方法分别对81例UC病人和114名健康者进行IL-1β、LMP2和IL-1RA基因多态性分析.结果UC病人和健康者之间IL-1β、IL-1RA和LMP2各基因型和基因频率比较均无显著性差异(P＞0.05);当UC病人分为ANCA(+)组和ANCA(-)组后,发现ANCA(+)组IL-1RA等位基因2频率高于ANCA(-)组(13.7%对3.3%,P＜0.05),其它各基因型及基因频率比较,统计学上均无显著性差异(P＞0.05).结论中国汉族UC病人与IL-1β、IL-1RA、LMP2基因多态性无关联,但ANCA(+)UC病人IL-1RA等位基因2频率明显增加.     

EB病毒LMP1表达对鼻咽癌细胞增殖及细胞周期分布的影响

目的:观察EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)表达对鼻咽癌细胞系增殖和细胞周期分布的作用。方法:用免疫组化(LSAB)法检测LMP1蛋白的表达;用MTT法测定鼻咽癌细胞系的增殖能力;用流式细胞术检测细胞周期的分布。结果:表达LMP1的鼻咽癌细胞系L-CNE1的OD值明显高于LMP1阴性的鼻咽癌细胞系V-CNE1和CNE1(P＜0.001)。L-CNE1细胞系的G₁期细胞百分率明显减少和S期细胞百分率明显增加,与V-CNE1和CNE1细胞系比较均有非常显著性差异(P＜0.001)。而V-CNE1与CNE1细胞系之间各期细胞百分率则无明显差异(P＞0.05)。结论:EBV-LMP1表达可使鼻咽癌细胞系细胞周期分布改变和增殖能力增强。     

JIP抑制鼻咽癌细胞中LMP1诱导的AP-1活性及机理的研究

目的:探讨鼻咽癌细胞中JIP抑制激活蛋白1(AP-1)信号转导途径的分子机制。方法:用Dox诱导L7(Tet-on-LMP1-HNE₂)细胞表达LMP1,观察AP-1活性的动力学变化,然后用不同浓度的JIP质粒转染L7细胞后,观察JIP的表达对LMP1诱导的AP-1活性的影响,并用荧光免疫组化方法观察JIP抑制JNK核移位引起磷酸化的JNK在胞浆中的滞留。结果:在转染JIP表达质粒24h之后,抑制了活化的JNK核移位,下调了AP-1的生物活性。结论:JIP能够通过抑制磷酸化的JNK核移位,从而下调AP-1活性。     

LMP1基因重组慢病毒载体的构建及表达性能鉴定

为了进一步探讨EB（Epstein Barr）病毒潜伏膜蛋白1（LMP1）的作用机制及其功能，我们构建了EDL2-N-LMP-慢病毒载体，并对所构建的EDL2-N-LMP-慢病毒载体结构及表达进行鉴定。     

EB病毒LMP1 CTAR23蛋白特异性结合短肽的筛选

目的利用噬菌体12肽库筛选能与EB病毒（EBV）LMP1 CTAR23蛋白高效结合的短肽。方法利用亲和层析柱加酶切的方法纯化CTAR23蛋白．并用其筛选噬菌体12肽库。通过夹心ELISA法分析噬菌体克隆与CTAR23蛋白的亲和力。通过硝酸纤维膜斑点印迹法进行阳性克隆鉴定,并对阳性克隆进行测序及序列分析。结果对12肽库进行3轮筛选后,噬菌体克隆具有良好的富集效果。ELISA提示筛选出来的噬菌体克隆能与CTAR23蛋白高效结合。硝酸纤维膜斑点印迹法证实阳性率达到100％,测序结果显示噬菌体上的短肽有共同序列HVSLHKHYPTAS。结论噬菌体短肽HVSLHKHYPTAS为研究LMP1致瘤机理、开发拮抗LMP1蛋白的小分子短肽类药物奠定坚实的基础。