靶向 PPARγRNA 干扰对激素诱导家兔骨髓基质细胞成脂分化的影响

目的:观察靶向过氧化物酶体增殖子活化受体-γ(PPARγ)RNA干扰抑制激素诱导骨髓基质细胞成脂分化的作用.方法:选用家兔第2代骨髓基质细胞.随机分为6组:模型组(M组:给予10-7 mol/L地塞米松),干扰1、2、3组(S1组、S2组、S3组:分别给予siRNA 1、2、3腺病毒1 × 106 U和10-7 mol/L地塞米松),感染无关siRNA gl(C组:给予siRNA4腺病毒1×106 U和10-7 mol/L地塞米松),对照组(N组:不给予siRNA腺病毒和地塞米松).苏丹Ⅲ染色.光镜下进行脂肪细胞计数,并采用RT-PCR方法检测细胞内PPARγ Mrna的表达.结果:处理并培养细胞3 d,S1组、S2组、S3组细胞内PPARγ,Mrna表达水平低于M组、C组(P<0.05),且与N组比较差异无统计学意义(P>0.05).处理细胞14 d后.S1组、S2组、S3组中分化为脂肪细胞的数量少于M组和C组(P<0.05),且与N组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论:siRNA能够有效阻断激素诱导的骨髓基质细胞中PPARγ/Mrna表达及其成脂分化.     

靶向PPARγ基因RNA干扰对乙醇诱导家兔骨髓基质细胞成脂分化的影响

目的:观察靶向过氧化物酶体增殖子活化受体-γ(PPARγ)基因RNA干扰阻断乙醇诱导骨髓基质细胞的成脂分化效应.方法:选用家兔第2代骨髓基质细胞,随机分为7组.对照组(N):无特殊处理;模型组(M):给予0.09 mol/L乙醇;感染空载体组(CO):给予空载体腺病毒1×105U和乙醇;感染无关siRNA组(C1):给予无关序列siRNA腺病毒1×105U和乙醇;干扰1、2、3组(S1、S2、S3):分别给予靶向PPAR-γ siRNA 1、2、3 腺病毒1×105U和乙醇.7d后采用RT-PCR技术检测MSCs内PPARγmRNA表达,14 d后测定MSCs内甘油三酯含量,21d后MSCs苏丹Ⅲ染色,计数脂肪细胞.结果:M组、C0组、C1组PPARγ mRNA呈高表达,脂肪细胞数增多,细胞甘油三酯含量升高.与N组比较差异均有统计学意义(P均<0.05);S1组、S2组、S3组PPARγ mRNA呈低表达,脂肪细胞数少,细胞内甘油=三酯含量稍高,与M组、CO组、C1组比较差异均有统计学意义(P均<0.05),与N组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论:靶向PPARγ,基因RNA干扰能够有效地阻断乙醇诱导的骨髓基质细胞中PPARγmRNA高表达和成脂分化.     

COA;过氧化物酶增殖子活化受体-γ siRNA腺病毒穿梭载体的构建和重组腺病毒的制备

背景：激素性股骨头坏死是临床常见病、致残率高,且缺乏有效的防治方法,目前已知过氧化物酶体增殖子活化受体γ(peroxisome proliferator - activated receptor -γ, PPARγ) 是发生激素性股骨头坏死的一个重要致病基因。RNAi 是根据基因沉默原理,通过影响目的基因表达取得治疗的效果。因此通过RNAi的方法下调PPARγ基因的表达成为预防激素性股骨头坏死发生的一个研究方向。 方法: 依据siRNA片段的设计原则, 依据PPARγ基因 (NM_001082148)序列筛选设计出3个特异性靶序列( 971-989、1253-1271、1367-1385), 体外合成对应特异性靶序列, 退火和纯化后将其克隆入shuttle vector 1.0-CMV载体,线性化穿梭质粒与骨架质粒共转染至HEK293细胞重组产生携带PPARγsiRNA的腺病毒,纯化并进行滴度测定。 结果: 发卡样s hRNA 单链DNA寡核苷酸退火后, 电泳可见明亮靶条带。将退火产物克隆入shuttle vector 1.0-CMV得到shuttle vector 1.0-CMV-971,shuttle vector 1.0-CMV-1253,shuttle vector 1.0-CMV-1367, 测序证实插入序列与设计序列完全一致,重组结果表明成功包装出携带PPARγsiRNA的腺病毒,纯化后病毒滴度可达1010PFU∕ml以上。 结论: 成功构建3个靶向PPARγ基因的siRNA腺病毒穿梭载体：shuttle vector 1.0-CMV-971,shuttle vector 1.0-CMV-1253,shuttle vector 1.0-CMV-1367,并制备出高滴度的腺病毒滴液。     

靶向PPARγ基因siRNA腺病毒对乙醇抑制家兔骨髓基质细胞成骨分化的影响

目的:观察靶向过氧化物酶体增殖子活化受体-γ(PPARγ)基因siRNA腺病毒阻断乙醇作用、保持骨髓基质细胞(MSCs)成骨分化的作用.方法:选用家兔第2代MSCs,随机分为7组.对照组(N):无特殊处理;模型组(M):给予0.09 mol/L乙醇;感染空载体组(CO):给予空载体腺病毒1×105 U和乙醇;感染无关siRNA组(C1):给予无关序列siRNA腺病毒1×105 U和乙醇;干扰1、2、3组(S1、S2、S3):分别给予靶向PPARγ siRNA 1、2,3 腺病毒1×105 U和乙醇.7 d后采用RT-PCR技术检测MSCs内PPARγ Mrna和骨钙素(Osteocalcin) Mrna表达,14 d测定细胞碱性磷酸酶(ALP)活性.结果:M组、C0组、C1组PPARγ Mrna呈高表达,Osteocalcin Mrna 呈低表达,ALP活性下降,与N组比较差异均有统计学意义(P均<0.05).S1组、S2组、S3组PPARγ Mrna 呈低表达,Osteo-calcin Mrna 呈高表达,ALP活性升高,与M组、C0组、C1组比较差异均有统计学意义(P均<0.05),与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论:靶向PPARγ基因siRNA腺病毒能够阻断乙醇作用,下调细胞内PPARγ基因表达和上调Osteocaloin基因表达,保持MSCs成骨分化.     

靶向PPARγ基因RNA干扰对激素抑制家兔骨髓基质细胞成骨分化的影响

目的:观察靶向过氧化物酶体增殖子活化受体-γ(PPARγ)基因RNA干扰阻断激素作用保持骨髓基质细胞(MSCs)成骨分化的作用.方法:选用家兔第2代MSCs,随机分为7组.对照组(C):无特殊处理;模型组(M):给予10-7 mol/L地塞米松;感染空载体组(O):给予空载体腺病毒1 × 105 U和地塞米松;感染无关siRNA组(N):给予无关序列siRNA腺病毒1×105 U和地塞米松;干扰1、2、3组(I1、I2、I3):分别给予靶向PPARγ siRNA 1、2、3腺病毒1 × 105 U和地塞米松.7d后采用RT-PCR技术检测各组细胞中PPARγ mRNA和核心结合因子 al(Cbfal) mRNA表达.14 d后测定各组培养液骨钙素含量和细胞内碱性磷酸酶(ALP)活性.结果:M组、O组和N组PPARγ mRNA呈高表达,cbfal mRNA呈低表达,骨钙素含量和ALP活性均下降,与C组比较差异均有统计学意义(P均<0.05).I1组、I2组、I3组PPARγ,mRNA呈低表达,Cbfal mRNA呈高表达,骨钙素含量和ALP活性均接近C组,与C组比较差异均无统计学意义(P均>0.05).结论:靶向PPARγ基因RNA干扰能够阻断激素作用,下调PPARγ基因表达,上调Cbfal基因表达,保持细胞的正常成骨分化.     

过氧化物酶增殖子活化受体-γ siRNA腺病毒载体的构建

目的:构建针对过氧化物酶体增殖子活化受体-γ(PPARγ)基因的siRNA腺病毒载体.方法:依据siRNA设计原则,在PPARγ mRNA(AF013266)序列中设计2个特异性靶序列(36-54、73-91),体外合成对应发卡样DNAs,退火后先将其克隆入pSIREN-Shuttle载体,再亚克隆入pAdeno腺病毒载体,对插入序列进行DNA序列分析.结果:发卡样siRNA单链DNA寡核苷酸退火后,电泳可见明亮靶条带.连接退火寡核苷酸和pSIREN-Shuttle载体得到阳性克隆pSIREN-Shuttle-siPPARγ-36、pSIREN-Shuttle-siPPARγ-73.同源重组后得到亚克隆pAdeno-siPPARγ-36、pAdeno-siPPARγ-73,测序证实插入序列与设计序列完全一致.结论:成功构建2个靶向PPARγ基因的siRNA载体pAdeno-siPPARγ-36和pAdeno-siPPARγ-73.     

PPARγ基因修饰对兔骨髓间充质干细胞成脂分化及ADRP、LPL表达的影响

目的观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）基因转染对免骨髓间充质干细胞（MSCs）向脂肪细胞分化的影响,探讨PPARγ在脂肪细胞早期分化中可能的调控机制。方法原代培养新西兰大白兔MSCs,应用脂质体介导法将pEGFP-N1-PPARγ表达载体转入MSCs中,G418筛选。分成不诱导组、空转染诱导组及转染诱导组以成脂诱导剂诱导分化,每日观察细胞形态学变化,镜下计数并计算脂肪细胞分化率,采用RT-PCR方法检测脂肪分化相关蛋白（ADRP）、脂蛋白脂酶（LPL）mRNA表达,Western blot检测ADRP、LPL蛋白表达。结果不诱导组细胞内没有脂滴出现,空转染诱导组和转染诱导组部分细胞成功分化为脂肪细胞,转染诱导组分化率明显高于空转染诱导组（P〈0.05）;不诱导组ADRP、LPLmRNA及蛋白均不表达,转染诱导组ADRP、LPLmR-NA及蛋白表达水平显著高于空转染诱导组（P〈0.05）。结论PPAR-γ基因转染MSCs可促进其向脂肪细胞分化,增强其分化能力,可能与促进ADRP、LPL基因和蛋白的表达有关。     

siRNA阻断PPARγ基因表达预防酒精性股骨头坏死的实验研究

目的:观察靶向PPARγ基因siRNA腺病毒载体阻断酒精诱导兔骨髓基质细胞(MSCs)的成脂分化预防酒精性股骨头坏死(ONFH)的作用效果。方法:采用RNA干扰技术,构建重组PPARγ的siRNA腺病毒表达载体;将腺病毒载体感染家兔体外MSCs以及活体股骨头内MSCs,检测MSCs内PPARγmRNA及蛋白表达、甘油三酯、ALP活性和培养液骨钙素含量,并计数脂肪细胞;观察股骨头病理学变化。结果:干扰组体外MSCs内PPARγmRNA表达值、脂肪细胞数、甘油三酯、ALP活性值与骨钙素含量均接近正常,与模型组、感染空载体组、感染无关siRNA组间差异有统计学意义(P<0.05),与对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。活体实验干扰组股骨头内PPARγmRNA和蛋白均呈低表达、空骨陷窝计数、脂肪细胞及最大脂肪细胞平均直径未见明显增加,与正常对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:靶向PPARγ基因siR-NA腺病毒载体能够有效阻断酒精诱导的家兔体外MSCs及活体股骨头MSCs内PPARγ基因表达,阻止其成脂分化,预防酒精性ONFH的发生。     

PPARγ基因转染对兔骨髓间充质干细胞向脂肪细胞早期分化的影响

目的:探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因表达在骨髓间充质干细胞(MSC)向脂肪细胞早期分化中的调控作用及对脂肪分化相关蛋白(ADRP)表达的影响.方法:原代培养新西兰大白兔MSC,应用脂质体转染法将pEGFP-N1-PPARγ表达载体转入MSC中,G418筛选.成脂诱导剂诱导向脂肪细胞分化,RT-PCR检测PPARγ,ADRPmR-NA表达,Western Blot检测ADRP蛋白表达,细胞形态学、油红O染色法行脂肪细胞计数和定量.结果:未分化的MSC中PPARγ,ADRPmRNA不表达,经pEGFP-N1-PPARγ转染后,调控成脂肪细胞方向分化的转录因子和早期标志PPARγmRNA(0.87±0.08 vs 0.28±0.01,P<0.01),ADRPmRNA(0.52±0.03 vs 0.21±0.02,P<0.01)表达增强;MSC向成脂肪细胞方向分化,成脂率及脂质量提高,分别为(78.5±4.2)% vs (51.4±3.0)%和(0.46±0.05) vs (0.21±0.02),P<0.05;分化成脂的细胞ADRP蛋白表达呈阳性,转染组较空转染组表达增强.结论:PPARγ在MSC向脂肪细胞分化的早期中起重要的正向调节作用,并促进ADRP基因和蛋白的表达;PPARγ基因过表达可增强MSC向脂肪细胞分化的能力,缩短分化进程,提高分化效率,可能与增强ADRP的表达有关.     

黑色素浓集激素受体2基因siRNA重组腺病毒载体构建及鉴定

目的:构建黑色素浓集激素受体2(MCHR2)siRNA重组腺病毒载体,并在稳定表达MCHR2的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中鉴定其干扰作用.方法:人工合成靶向MCHR2的siRNA干扰序列,用分子克隆的方法克隆到穿梭载体pSES-HUS上,得到pSES-HUS-MCHR2siRNA,并与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,得到pAdeasy-SES-HUS-MCHR2siRNA,在HEK293细胞中包装成重组腺病毒,感染稳定表达MCHR2的CHO细胞株,RT-PCR及Western Blot检测腺病毒对细胞MCHR2表达的影响.结果:成功构建McHR2siRNA重组腺病毒载体.MCHR2siRNA重组腺病毒显著抑制CHO细胞中MCHR2的表达.结论:构建的Adeasy-MCHR2 siRNA腺病毒能有效地抑制CHO细胞中MCHR2表达,为研究MCHR2的功能及其与肥胖的关系提供了有效的工具.     

PPARγ通路对模拟微重力条件下大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）通路对模拟微重力条件下大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）向成骨细胞
分化的影响,并通过调节PPARγ信号通路开闭影响这一分化过程。方法以大鼠BMSCs作对象,以回转器模拟微重力效应。
将细胞随机分为5组,包括实验组：模拟微重力组、模拟微重力+10 μmol/L吡格列酮组、模拟微重力+10 μmol/L GW9662组、模
拟微重力+10 μmol/L吡格列酮+10 μmol/L GW9662组;对照组：正常重力组。体外成骨诱导14 d后,利用茜素红进行成骨结节
染色、油红-O进行脂肪细胞染色,并计算成脂率;测定各组细胞ALP活性;利用RT-PCR技术检测各组细胞PPARγmRNA表达水
平。结果吡格列酮明显抑制BMSCs向成骨细胞分化,GW9662通过抑制PPARγ的激活而增加BMSCs向成骨细胞分化。结
论推测PPARγ信号通路的激活是模拟微重力条件下抑制BMSCs向成骨细胞分化的主要因素之一,而通过抑制这条通路的激
活可以有效预防及治疗失重导致的骨质疏松症。
     

PPARγ2表达诱导NIH3T3成纤维细胞向脂肪细胞分化

目的应用重组逆转录病毒载体介导小鼠过氧化物酶体增殖体激活的受体γ2(mPPARγ2)基因在NIH3T3成纤维细胞中表达,并进一步研究其功能.方法从经荧光测序证实含正确mPPARγ2 cDNA序列的重组质粒pcDNA3/mPPARγ2中,双酶切下mPPARγ2全长cDNA序列,亚克隆入逆转录病毒载体pGCEN中,构建重组逆转录病毒载体pGCEN/mPPARγ2.用PA317细胞对pGCEN/mPPARγ2及pGCEN进行包装,并用G418进行PA317细胞抗性克隆筛选,收集病毒上清,感染靶细胞NIH3T3成纤维细胞.表达mPPARγ2的NIH3T3成纤维细胞在含PPARγ激活物5,8,11,14-二十碳四烯酸(ETYA)等分化介质中培养,可被诱导向脂肪细胞分化.结果构建了含mPPARγ2全长cDNA重组逆转录病毒载体pGCEN/mPPARγ2,获得了较高pGCEN/mPPARγ2及pGCEN的逆转录病毒上清.重组逆转录病毒载体可介导mPPARγ2在NIHT3T3成纤维细胞胞核中表达.油红O染色证实,表达mPPARγ2的NIHT3T3成纤维细胞在分化介质中培养分化10天后,胞浆中明显积聚了较多的中性脂肪,其细胞形态也与体内成熟脂肪细胞相似,而且这些细胞表达脂肪细胞特异性标志基因如AP2和leptin.结论本研究在体外成功地建立了由PPARγ2诱导NIH3T3成纤维细胞向脂肪细胞分化的模型,为进一步研究PPARγ2诱导脂肪细胞分化的分子机制奠定了基础.     

葛根素对激素诱导骨髓间充质干细胞PPARγmRNA和CEBPαmRNA表达的影响

目的探讨葛根素防治激素性股骨头缺血性坏死的作用机制。方法大剂量地塞米松诱导体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化,在诱导成脂的同时给予不同浓度的葛根素进行干预。干预6 d后检测细胞内成脂标志物PPARγmRNA和C/EBPαmRNA的表达。结果葛根素干预组PPARγmRNA和C/EBPαmRNA的表达较对照组明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论葛根素防治激素性股骨头缺血坏死的机理不仅是改善股骨头局部的微循环,同时还与其抑制激素诱导下的BMSCs成脂分化有关。     

骨痹通消颗粒对激素型股骨头坏死人骨髓间充质干细胞成骨与成脂分化的影响

目的 探究骨痹通消颗粒对激素性股骨头坏死人骨髓间充质干细胞（hBMMSC）成骨与成脂分化的影响。方法 取激素性股骨头坏死患者骨髓,体外进行hBMMSC的培养,通过细胞形态学观察、成骨及成脂分化潜能来鉴定hBMMSC。以完培组（基础培养基+10%的胎牛血清）作为对照,采用CCK-8法测定1%、2%、5%、8%、10%体积分数的骨痹通消含药血清A组作用24 h后对细胞增殖的影响。细胞在96孔板的培养过程中,每孔加入地塞米松溶液0.52 μl,以完培组（基础培养基+10%的胎牛血清）和损伤组（基础培养组+10%的胎牛血清+0.52 μl地塞米松溶液）作为对照,采用CCK-8法测定2%、5%、8%体积分数的骨痹通消含药血清B组对激素环境中细胞活力的影响。以无激素诱导细胞作为对照组（基础培养基+10%的胎牛血清）,将体外激素诱导的hBMMSC细胞分为模型组（基础培养基+10%的胎牛血清+10-5 mol/L地塞米松溶液）、实验组（基础培养基+5%的骨痹通消含药血清+ 10-5 mol/L地塞米松溶液）。茜素红染色试剂盒测定各组成骨分化后矿化结节的形成;油红O染色试剂盒测定各组成脂分化后脂滴的形成;RT-qPCR测定成脂相关标志基因PPARγ、C/EBP-α与Fabp4中mRNA的表达,Western blot检测成骨相关蛋白BMP-2、Runx2及β-catenin的蛋白表达含量。 结果 原代细胞培养7 d后,可见梭形、纺锤形或多角形的贴壁细胞。第三代细胞生长均匀,平行排列,透光率好。成骨诱导21 d,细胞发生改变,局部细胞聚集,并有矿化结节产生,茜素红染色呈阳性;成脂诱导21 d,脂滴与油红O染液结合变为红色,油红O染色呈阳性。与完培组比较,10%体积分数的含药血清A组细胞活力下降（P＜0.05）。与完培组比较,损伤组细胞活力下降（P＜0.05）;与损伤组比较,2%、5%、8%体积分数的含药血清B组细胞活力升高（P＜0.05）。与对照组比较,模型组染色面积降低（P＜0.05）;与模型组比较,实验组中矿化结节与沉积升高,染色范围也更广（P＜0.05）。与对照组比较,模型组细胞内脂质积累增多（P＜0.05）;与模型组比较,实验组较细胞内脂质积累降低（P＜0.05）。与对照组比较,模型组PPARγ、C/EBP-α和Fabp4的表达量升高（P＜0.01）,与模型组比较,实验组PPARγ、C/EBP-α和Fabp4的表达量降低（P＜0.05）。与对照组比较,模型组BMP-2、Runx2及β-catenin蛋白表达含量升高（P＜0.01）,与模型组比较,实验组BMP-2、Runx2及β-catenin蛋白表达含量降低（P＜0.05）。 结论 骨痹通消颗粒能够促进激素性股骨头坏死hBMMSC的增殖及其向成骨分化的能力,抑制成脂分化,为临床上防治激素性股骨头坏死提供了理论基础。     

IGF-1对SD大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂方向分化的影响

目的:观察胰岛素样生长因子-1(IGF-1)作用于骨髓间充质干细胞后核心结合因子α1(CBFα1)和过氧化物酶增殖物激活受体γ2(PPARγ2)基因表达情况,探讨其对骨髓间充质干细胞成脂方向分化的影响。方法:用贴壁法筛选分离纯化SD大鼠骨髓基质干细胞并传代培养,取第4代SD大鼠骨髓间充质干细胞作为实验样本,随机分为空白对照组、低剂量IGF-1(10μg/L)组与高剂量IGF-1(20μg/L)组进行干预培养12 h,采用RT-PCR法检测各组CBFα1和PPARγ2 mRNA的表达。结果:IGF-1高剂量组及低剂量组均可以提高大鼠骨髓间充质干细胞CBFα1的mRNA以及下调PPARγ2的mRNA表达,高、低剂量组与空白对照组差异均有统计学意义(P均<0.05),但是这种剂量-效应在IGF-1干预浓度介于10~20μg/L的情况下并不明显。结论:IGF-1使骨髓间充质干细胞PPARγ2基因表达水平降低,阻碍骨髓间充质干细胞向成脂方向分化;使CBFα1基因表达水平增高,促进BMSCs成骨方向分化。IGF-1可能参与骨髓间充质干细胞成骨成脂方向分化的调节,并有利于成骨方向分化。     

羟基红花黄色素A对激素诱导骨髓间充质干细胞成脂分化的干预作用

目的 探讨激素性股骨头缺血坏死的发病机制及羟基红花黄色素A(HYSA)防治该病的作用机制. 方法 30天龄SD大鼠18只,体重(150±20)g.6只用于骨髓间充质干细胞取材培养、鉴定、MTT试验;12只用于骨髓间充质干细胞取材培养、干预.大剂量激素诱导体外培养的骨髓间充质干细胞成脂分化,在诱导成脂的同时给予不同浓度H...     

土鳖虫对激素诱导骨髓间充质干细胞PPARγ和aP2mRNA表达的影响

目的 探讨激素性股骨头缺血坏死的发病机理及土鳖虫防治该病的作用机制. 方法 通过大剂量激素诱导体外培养的骨髓间充质干细胞成脂分化,同时给予土鳖虫含药血清干预.检测干预6天后细胞内成脂标志物PPARymRNA和aP2mRNA的表达. 结果 土鳖虫含药血清可对抗激素诱导下的BMSCs PPARymRNA和aP2mRNA表达的增加. 结论 土鳖虫防治激素性股骨头缺血坏死的机理不仅是改善股骨头的微循环,同时还与其抑制激素诱导下的BMSCs成脂分化有关.     

shRNA干扰PPARγ基因表达预防兔激素性股骨头坏死的研究

目的 研究激素性股骨头坏死(steroid-induced avascular necrosis of the femoral head,SANFH)的发病机制,观察靶向过氧化物酶体增殖激活受体γ(PPARγ)基因shRNA腺病毒载体预防兔SANFH的作用效果.方法 健康新西兰兔48只,随机分为4组,每组12只.单纯激素组(M组)仅肌注地塞米松;实验组(S组)在肌注地塞米松同时,加用靶向PPARγ基因shRNA腺病毒载体感染兔活体股骨头内骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs);无关序列组(E组)在肌注地塞米松同时,加用搭载无关序列的shRNA重组腺病毒感染兔活体股骨头内BMSCs;对照组(N组)肌注等量生理盐水.测定4组兔血清甘油三酯(TG)、胆固醇(CHO)含量.观察股骨头组织病理学改变.应用RT-PCR 技术检测PPARγ mRNA和Runx2 mRNA表达;应用免疫组化技术检测PPARγ和Runx2蛋白表达情况.结果 M、E、S组血清中TG和CHO含量增高,与N组比较差异均有统计学意义(P<0.05).M组和E组可见明显骨坏死,脂肪细胞增生肥大,骨小梁变细和稀疏,大量空骨陷凹,S组和N组未见骨坏死及上述改变.S组中PPARγ mRNA和蛋白均呈低表达,Runx2 mRNA及蛋白呈高表达,与M组和E组比较,差异有统计学意义(P<0.05);与N组比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论 靶向PPARγ基因shRNA腺病毒载体可有效阻断BMSCs内PPARγ mRNA表达,抑制其成脂分化;增强Runx2 mRNA表达,促进其成骨分化,预防SANFH的发生,为通过基因靶向治疗SANFH提供新思路.     

叶酸对人脂肪间充质干细胞成脂分化的影响

目的 探讨叶酸对人脂肪间充质干细胞(hADSCs)成脂分化过程的影响及机制.方法 以正常叶酸(Control)和无叶酸(FD)成脂诱导液对hADSCs细胞进行成脂诱导,不同时间分别采用油红O染色观察细胞内脂滴生成情况;采用SYBR Green实时荧光定量RT-PCR方法检测成脂分化相关转录调控基因PPARγ和C/EBPα的表达;采用蛋白质印迹法检测PPARγ蛋白的表达.结果 与正常叶酸组相比,无叶酸组脂滴数量明显减少;两组细胞成脂分化相关转录调控基因PPARγ和C/EBPα mRNA表达无明显差异;PPARγ蛋白表达明显低于正常叶酸组.结论 叶酸可通过上调PPARγ的表达而促进hADSCs细胞成脂分化.     

利福平抑制地塞米松诱导骨髓间充质干细胞成脂分化的机制研究

目的 明确利福平对糖皮质激素诱导的大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stroma cell, BMSC)成脂分化的作用。方法 体外培养Sprague-Dawley大鼠BMSC并随机分为4组: 5μg/ml利福平+10-6mol/L地塞米松(A),PBS+10-6mol/L地塞米松(B),5μg/ml利福平(C)和PBS(D)。分别应用罗丹明123结合流式细胞仪方法和酶联免疫吸附法检测5μg/ml利福平对BMSC的P糖蛋白活性和胞内地塞米松蓄积浓度影响。各组孵育14d后,分别进行油红O染色和碱性磷酸酶染色,定量检测三酰甘油含量、碱性磷酸酶活力、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ) mRNA和Runt相关转录因子2(Runx2)mRNA表达。结果 利福平减少BMSC胞内罗丹明123强度和胞内地塞米松蓄积量(P＜0.01)。B组诱导BMSC成脂分化、PPARγ mRNA表达增加和三酰甘油含量升高。A组、C组和D组BMSC未发生成脂分化,PPARγ mRNA表达增加和三酰甘油含量无统计学差异。A组BMSC碱性磷酸酶活性和Runx2 mRNA表达最强(P＜0.01),B组碱性磷酸酶活性和Runx2 mRNA表达下降(P＜0.01)。结论 利福平上调BMSC的P糖蛋白活性,抑制糖皮质激素诱导的成脂分化。