慢病毒载体靶向携带survivin-siRNA对恶性黑色素瘤A375细胞的影响

目的 观察靶向survivin的RNA干扰对人恶性黑色素瘤A375细胞的影响.方法 将处于对数生长期的黑色素瘤A375细胞随机分为3组:阳性组、阴性对照组、空白对照组,将设计并构建好的survivin-siRNA慢病毒载体分别转染入各组细胞内,实时定量PCR及Western-blot法分别检测转染前后3组细胞survivin mRNA及蛋白的表达情况.结果 成功设计并构建了survivin-siRNA慢病毒载体,与空白对照组相比,转柒survivin-siRNA的阳性组survivinmRNA及蛋白的表达明显降低,抑制率分别为60％、87.38％,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 靶向survivin的siRNA能够明显抑制恶性黑色素瘤A375细胞的survivin基因的表达.     

TIEG特异的siRNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建TIEG基因siRNA慢病毒载体.方法 针对已经筛选确定的TIEG基因siRNA有效靶序列.合成靶序列的Oligo DNA退火形成双链DNA与经BamH Ⅰ和EcoRl酶切后的PshRNA-copGFP-lendvector慢病毒载体[含H1启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生psiRNA-TIEG慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆.测序鉴定,用psiRNA-TIEG和病毒包装系统共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度;用包装病毒颗粒注射大鼠,通过RealTime-PCK检测大鼠肾组织TIEG mRNA的表达水平.结果 PCR和测序证实,成功构建TIEG siRNA慢病毒栽体psiRNA-TIEG,包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为1×10<'5>ifu/μL;实验组大鼠TIEGmRNA的表达水平明显低于对照组(50.7%).结论 成功构建大鼠TIEG基因siRNA慢病毒栽体psiRNA-TIEG.     

Dnd1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建小鼠Dnd1基因的RNAi慢病毒载体.方法:针对小鼠Dnd1基因RNAi设计有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA.退火形成双链DNA,与经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生短发卡RNA慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.结果:PCR鉴定与DNA测序证实合成的舍Dnd1...     

大鼠PEDF基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建针对大鼠PEDF 基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体并进行鉴定,探讨PEDF基因对缺血心肌血管新生的影响.方法 构建PEDF基因过表达质粒,测序鉴定.针对PEDF基因不同干扰靶点构建4种RNAi 病毒载体质粒pGCsi-U6/Neo/GFP/shRNA,测序鉴定.过表达质粒和RNAi质粒共转染293T细胞后应用Western blot方法进行外源筛靶确定PEDF基因RNAi 有效靶序列.有效RNAi 病毒质粒和其他3种辅助包装原件载体质粒通过Lipofectamine 2000共转染293T细胞,培养48 h后, 收集细胞培养上清液,将其浓缩后用孔稀释法测定病毒滴度.结果 过表达质粒及4种RNAi质粒构建成功.Western blot外源筛靶显示2个靶点能有效敲减目的基因的表达.PEDF shRNA慢病毒表达载体Serpinf1-RNAi-LV经293T细胞包装成功,收集293T细胞分泌的病毒上清测定浓缩病毒悬液的滴度为2×1012Tu/L.结论 成功构建了PEDF基因的RNAi慢病毒载体,为研究PEDF基因对缺血心肌血管新生的影响打下基础.     

GPC3基因重组慢病毒载体的构建及其在肝癌细胞中的表达

目的 构建含有GPC3的shRNA序列慢病毒表达载体并转染肝癌细胞,观察其转染效率及在肝癌细胞中的表达.方法 应用重组DNA技术,将设计好的GPC3基因特异性siRNA序列构建至慢病毒表达载体pGLV3-GFP上,并应用脂质体法转染293T细胞,进行病毒包装及滴度测定.采用RT-PCR及Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测转染HepG2细胞后GPC3基因的表达情况.结果 慢病毒载体构建成功,并测定滴度为1×108TU/mL,转染后,GPC3基因表达明显降低.结论 成功构建GPC3基因的shRNA慢病毒载体,所介导的RNAi能有效抑制靶细胞中GPC3基因的表达.     

LOX-shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的 构建LOX-shRNA的慢病毒表达载体及其病毒包装鉴定。方法 利用Oligo Designer 3.0,根据人LOX基因序列设计shRNA,并合成包含正、反义靶序列的互补DNA链,退火后插入LOX表达载体中,构建shRNA表达质粒,并转化至E.coli TOP10感受态细胞,抽提质粒后进行测序。将重组质粒转染HEK-293T细胞,应用RT-PCR检测各组LOX基因mRNA的表达水平,筛选出最有效的LOX-shRNA后,通过LipofectAMINETM2000介导转染293T细胞,对慢病毒进行包装并测定慢病毒滴度。结果 利用慢病毒介导将重组质粒LOX-shRNA-3024高效转导入HEK-293T细胞并稳定表达。荧光显微镜显示,转染24h后,HEK-293T细胞即开始发出绿色荧光;72h后,有大量荧光表达,而对照组未转染质粒的HEK-293T细胞不表达,可见慢病毒载体被成功转染。LOX-3024重组慢病毒的滴度为2×10¹⁰TU/ml。结论 成功构建LOX-shRNA慢病毒表达载体,并稳定转染HEK-293T细胞,为研究LOX对人阴道壁成纤维细胞生物学行为的影响提供了实验基础。     

大鼠瘦素受体RNAi慢病毒载体的构建及鉴定

[目的]构建大鼠OBRb基因的RNAi慢病毒载体,并评估其对OBRb基因表达的沉寂作用。[方法]设计大鼠OBRb的siRNA靶序列,合成包含各正反义靶序列的互补单链寡核苷酸,退火后插入到慢病毒载体质粒pRNA-lentivector-VGFP上,构建pRNA-Lenti-OBRb-VGFP表达重组体;为了评估RNAi基因沉寂作用,将构建的慢病毒载体转染表达OBRb的C6大鼠神经胶质瘤细胞,利用Realtime PCR方法检测OBRb mRNA表达水平。[结果]将目的序列连接到慢病毒载体上,成功构建pRNA-Lenti-OBRb-VGFP表达重组体;通过PCR、电泳初步鉴定该重组体有OBRb表达,并进一步进行基因测序证实插入序列正确;成功将慢病毒载体转染到C6大鼠神经胶质瘤细胞,转染效率可达40%;荧光实时定量PCR检测OBRb基因表达量,结果干扰组的OBRb mRNA表达水平明显低于非干扰序列的对照组,可使OBRb mRNA表达量下调近80%。[结论]成功构建大鼠OBRb的RNAi慢病毒载体,为进一步的体内研究奠定了基础。     

Ang2基因RNA干扰慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建促血管生成素(Ang)2基因的RNAi慢病毒表达载体,并鉴定其正确性。方法将经XbaⅠ酶切电泳鉴定的pSilencer 1.0-U6-Ang2-siRNA重组质粒与经XbaⅠ酶切电泳鉴定的嗜中性多形核白细胞-绿色荧光蛋白转移质粒(pNL-EGFP)载体连接,产生pNL-EGFP-U6-Ang2-siR-NA慢病毒转移质粒,再以pNL-EGFP-U6-Ang2-siRNA慢病毒转移质粒、水疱性口炎病毒G蛋白包膜质粒和包装质粒三质粒共转染293T细胞,产生慢病毒,收集病毒上清液并测定病毒滴度。结果成功构建pNL-EGFP-U6-Ang2-siRNA慢病毒转移质粒2条,通过XbaⅠ酶切电泳及测序鉴定,证明Ang2-siRNA核苷酸序列插入的正确性。利用三质粒慢病毒包装系统生产EGFP-Ang2-siRNA病毒,收集病毒上清,并测得病毒滴度为9×103/μL。结论成功构建了Ang2基因的RNAi慢病毒表达载体,为下一步进行干扰体内外恶性黑素瘤Ang2的表达奠定基础。     

FGL2基因RNAi慢病毒载体的构建及外源性筛选与鉴定

目的拟构建人纤维蛋白原样蛋白2(FGL2)凝血酶原酶基因RNA干扰慢病毒载体,为调控人FGL2凝血酶原酶表达水平提供有利的工具。方法根据人FGL2凝血酶原酶基因的mRNA序列选择4条靶序列,设计合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生FGL2慢病毒载体,采用PCR及测序鉴定,应用Western blot技术外源性筛选干扰效率高的有效靶序列。用慢病毒包装系统pGCSIL-GFP、pHelper1.0和pHelper2.0共转染包装293T细胞,包装产生慢病毒,以系列稀释法测定病毒滴度。结果 PCR扩增和测序结果显示,人FGL2凝血酶原酶核苷酸链序列插入正确,外源性筛选确定一条干扰效率高的有效靶序列。利用筛选确定的有效靶序列,包装产生慢病毒,其浓缩病毒悬液的滴度为1×109TU/ml。结论证实实验成功构建了FGL2基因RNA干扰慢病毒载体。     

MMP-9基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建小鼠基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体。方法针对小鼠MMP-9基因序列,利用公用网站按照RNAi序列设计原则,设计RNAi靶点序列,并合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ酶切后的pGCL-GFP载体连接产生短发卡RNA慢病毒载体,用插入鉴定引物进行PCR鉴定阳性克隆并测序,应用Western blot在293T细胞中鉴定MMP-9表达的下调作用。结果PCR鉴定和DNA测序结果显示合成的含MMP-9 shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确;构建的MMP-9RNAi慢病毒载体能够抑制MMP-9的表达。结论应用基因工程技术,成功构建了小鼠MMP-9基因RNAi慢病毒载体,为应用于在体基因治疗创造了条件。     

Construction and identification of an RNA interference lentivirus vector targeting the Ras homology C gene of melanoma cells

Background Melanoma has the highest mortality among all superficial malignant tumors.The poor prognosis is due to its high metastasis rate and the lack of therapeutic targets.As a molecular switch that controls tumor metastasis,Ras homology C （RhoC） has been correlated with tumor progression,especially tumor invasion and metastasis.However,little research has been done about the effects of RNA interference （RNAi） targeting RhoC on the invasion and metastasis of melanoma.In this study,we constructed an RNAi lentivirus vector targeting the RhoC gene of melanoma cells and identified its silencing effects on the RhoC gene.Methods Based on the RhoC gene encoding information,three pGPU6/GFP/Neo-short hairpin （shRNA） plasmids were constructed.After detecting their silencing effects on the RhoC gene of A375 cells,the most effective pGPU6/GFP/ Neo-shRNA plasmid was packed with lentivirus to construct the recombinant pLenti6.3-EGFP-453 targeting RhoC.The lentivirus vector was used to infect A375 cells,and then the expression of RhoC mRNA and protein were determined with real-time PCR and Western blotting.Results The plasmids pGPU6/GFP/Neo-shRNA 336,pGPU6/GFP/Neo-shRNA 453,and pGPU6/GFP/Neo-shRNA 680 were constructed.After they were transfected into A375 cells,the expressions of RhoC mRNA and protein were 1.47±0.26,1.13±0.16,1.39±0.11 and 70.98±9.21,50.67±6.06,65.77±4.06,respectively.pGPU6/GFP/Neo-shRNA 453 was the most effective sequence,and was used to successfully construct the pLenti6.3-EGFP-453 lentiviral vector targeting RhoC.pLenti6.3-EGFP-453 was used to infect A375 cells.The expression of RhoC mRNA and protein were 1.05±0.05 and 62.04±15.86 in the lentivirus group,4.21±0.24 and 220.86±24.07 in the negative lentivirus control group,and 4.63±0.32 and 257.39±12.30 in the normal control group respectively with the difference between the lentivirus group and the control groups being statistically significant （P ＜0.05）.Conclusion The successfully constructed pLenti6.3-EGFP-453 vector targeting the RhoC can effectively infect human melanoma A375 cells in vitro,and significantly inhibit the RhoC mRNA and protein expression.     

小鼠Mmp-9 shRNA重组慢病毒包装、筛选及干扰效果检测

目的:设计、筛选、构建并鉴定Mmp-9小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),并构建其慢病毒表达载体,为血管化疾病的防治提供理论依据及实验室数据。方法:针对基质金属蛋白酶9靶基因设计siRNA序列,并合成小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)结构的DNA,与经AgeΙ和EcoRΙ酶切的pSIL-RFP连接、转化大肠杆菌感受态细胞,构建成携带Mmp9-shRNA慢病毒质粒载体(pSIL-RFP/MMP9-shRNA),PCR及测序鉴定后,Western blot筛选出携带最佳siRNA的慢病毒质粒载体,并利用慢病毒包装质粒(pHelper1.0和pHelper2.0)将其制备成MMP9-shRNA慢病毒,并测定病毒滴度为1×1010pfu/l。结果:PCR和DNA测序证实合成的含基质金属蛋白酶9短发卡RNA慢病毒载体寡核苷酸链正确插入pSIL-RFP载体,表明实验成功构建基质金属蛋白酶9RNA干扰慢病毒表达载体。结论:成功的构建并筛选出针对小鼠Mmp9基因沉默的特异性shRNA重组慢病毒,为血管化性疾病的防治研究提供基础。     

PIK3CA基因RNA干扰慢病毒载体的构建和鉴定

目的构建靶向PIK3CA（P110α）基因的RNA干扰慢病毒载体。方法针对PIK3CA—mRNA（NM_006218）设计4个RNA干扰靶点序列和一个阴性对照靶点,构建慢病毒转移质粒pGCL—GFP。构建成功的RNA干扰质粒与PIK3CA表达质粒共转染293T细胞,荧光显微镜下观测转染效果,Western Blot检测PIK3CA蛋白表达,筛选出干扰效果最好的RNA干扰质粒。将该质粒与两种辅助包装原件载体质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒并检测其滴度。结果4个靶点和阴性对照靶点的RNA干扰质粒均构建成功;通过Westem Blot检测获得最有效干扰靶点,并成功包装成滴度为2×10^8TU／ml的慢病毒。结论成功构建可供感染的PIK3CA基因RNA干扰慢病毒载体,为进一步研究PIK3CA功能和用慢病毒进行卵巢癌基因治疗奠定了基础。     

人凋亡相关因子基因RNA干扰慢病毒载体的构建与包装

目的:构建人凋亡相关因子(Fas)基因短发夹RNA慢病毒载体,实现沉默人脐带间充质干细胞Fas基因的表达.方法:根据Fas基因mRNA序列,设计4组靶向Fas基因的短发夹RNA序列,合成、退火形成双链DNA片段,与经过DNA内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切后的LV3载体连接转入感受态细胞,对长出的克隆进行菌落PCR鉴定,并对阳性克隆进行测序及比对分析.通过转染293T细胞对慢病毒进行包装和滴度测定.结果:经酶切及基因测序鉴定证明慢病毒载体构建成功,通过荧光显微镜观察证明病毒转入293T细胞,感染效率 > 90%,并获得高滴度的慢病毒载体,病毒滴度为3×108TU/ml.结论:成功构建人Fas基因RNA干扰慢病毒载体,为下一步转染脐带间充质干细胞提供理论参考.     

Cav2.2e37a基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建针对Cav2.2e37a基因的RNAi慢病毒载体,为抑制Cav2.2e37a基因表达治疗神经痛的实验研究打下基础。方法针对已经筛选确定的Cav2.2e37a基因RNAi有效靶序列,构建pLL3.7-Cav2.2e37a干扰质粒,测序鉴定。pRsv-REV,pMDlg-pRRE,pMD2G,pLL3.7-Cav2.2e37a共转染293T细胞,Real-time PCR测定病毒转导滴度。结果成功构建Cav2.2e37a shRNA的慢病毒载体LVshCav2.2e37a。浓缩病毒悬液的滴度为1×10^9Tu/ml。结论成功构建了Cav2.2e37a基因的RNAi慢病毒载体。     

STUB1基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建人STUB1基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体并进行鉴定.方法:针对筛选确定的人STUB1 基因RNAi有效靶点序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Age I 和EcoR I 酶切后的pMagic 4.0载体连接,产生短发卡RNA 慢病毒载体.PCR筛选阳性克隆,测序鉴定,并包装成慢病毒颗粒.结果:PCR鉴定与DNA测序证实,合成的含STUB1 shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确.STUB1 shRNA慢病毒载体在293T细胞中成功包装成慢病毒颗粒.结论:成功构建人STUB1基因RNAi慢病毒载体以及包装成功慢病毒颗粒,为研究STUB1在胶质瘤发生发展过程中相关信号通路的作用,提供了稳定感染细胞的载体.     

针对增强型绿色荧光蛋白RNA干扰表达载体的构建和鉴定

目的：构建针对增强型(EGFP)的pSUPER siRNA(small interferencing RNA)表达载体,并在哺乳动物细胞COS-7细胞中观察其干扰效果．方法：设计针对EGFP编码区的寡核苷酸链,体外退火后克隆入经Bgl Ⅱ和HindⅢ双酶切线性化的干扰载体pSUPER中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定．通过脂质体介导,将重组干扰质粒与pIRESE2-EG-FP瞬时共转染COS-7细胞,48h后荧光显微镜下观察干扰效果．结果：经酶切鉴定及DNA序列测定证实,重组质粒中已插入了目的基因片段．瞬时共转染后荧光显微镜观察结果显示：只转染pIRES2-EGFP及共转染pIRES2-EGFP和空载体pSUPER的COS-7细胞中有大量的EGFP表达．而共转染pIRES2-EGFP和pSUPER-R237、pSUPER—R304、pSUPER-R447的COS-7细胞中发出荧光的细胞数量明显减少,荧光强度也明显降低．结论：成功构建了针对EGFP的RNA干扰表达载体pSUPER—R237,pSUPER—R304和pSUPER—R447,并与pIR—ESE2一EGFP瞬时共转染COS-7细胞,有效地抑制了EGFP在哺乳动物细胞中的表达。     

RhoC慢病毒干扰载体的构建及其对卵巢癌SKOV3细胞中RhoC mRNA表达的影响

目的:构建慢病毒介导的能够稳定沉默卵巢癌SKOV3细胞中RhoC基因的干扰载体,观察其对卵巢癌SKOV3细胞中RhoC基因表达的抑制作用。方法:人卵巢癌SKOV3细胞分为psiHIV-RhoC1组(转染Lenti-shRhoC1)、psiHIV-RhoC2组(转染Lenti-shRhoC2)、阴性对照组(转染Lenti-NC)和空白对照组(未经转染)。观察各组SKOV3细胞中绿色荧光蛋白的表达;采用RT-PCR法检测各组SKOV3细胞中RhoC mRNA的表达水平。结果:psiHIV-RhoC1、psiHIV-RhoC2和阴性对照组SKOV3细胞中均可见绿色荧光蛋白的表达。成功构建了特异性干扰载体,将其转染至SKOV3细胞后,psiHIV-RhoC1和psiHIV-RhoC2组SKOV3细胞中RhoC mRNA的表达水平较空白对照组明显降低。结论:构建的重组慢病毒RhoC shRNA干扰载体能有效抑制SKOV3细胞中RhoC mRNA的表达。     

含心脏阿霉素反应蛋白基因的重组慢病毒过表达和RNA干扰载体的构建及鉴定

目的：构建心脏阿霉素反应蛋白（CARP）基因重组慢病毒过表达和RNA干扰载体并进一步包装慢病毒,为研究CARP在阿霉素（ADR）心肌病中的作用及机制奠定基础。方法：将PCR扩增的大鼠CARP基因序列和设计合成的短发夹RNA（shRNA）序列分别插入GV-358和GV-248表达载体,行DNA测序鉴定。采用重组CARP过表达和shRNA表达穿梭载体与Helper 1.0和Helper 2.0辅助包装质粒共转染人胚肾细胞HEK293T,进行病毒包装和扩增,采用终点稀释法测定病毒滴度。采用重组慢病毒感染HEK293T细胞,荧光显微镜观察绿色荧光强度。采用重组慢病毒感染H9C2细胞,分为对照组、Scramble RNA组、CARP过表达组和shRNA CARP组,Western blotting法检测各组细胞中CARP蛋白表达水平。结果：基因测序,CARP过表达及shRNA载体序列与原设计序列完全相符。载体转染HEK293T细胞后,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达。包装的CARP过表达及shRNA病毒感染H9C2细胞后,与对照组比较,CARP过表达组细胞中CARP蛋白表达水平升高5.3倍（P=0.01）,shRNA CARP组细胞中CARP蛋白表达水平降低53%（P=0.02）。结论：成功构建了CARP过表达和特异性shRNA慢病毒表达载体并获得高感染效率的过表达和RNA干扰慢病毒,后者在H9C2细胞中能够干预CARP表达。