血清蛋白质组学技术在肿瘤血清标志物筛选中的应用

至今为止,癌症作为病死率最高的疾病正严重威胁着人类健康,早期发现、早期诊断、早期治疗是降低癌症病死率的有效手段。但是目前为止还没有发现特异性和敏感度均能达到100%的血清肿瘤标志物(tumor marker,TM)[1]。因此,寻找敏感度和特异性     

应用蛋白质组学技术筛选胰腺癌血清肿瘤标志物

目的:比较胰腺癌患者与健康志愿者血清蛋白的差异以寻找候选血清肿瘤标志物,为胰腺癌早期诊断提供依据.方法:通过免疫亲合柱去除丰度最高的14种血清蛋白,用双向电泳分离蛋白并比较差异.选取在胰腺癌患者血清中明显差异表达蛋白点,行质谱鉴定和生物信息学分析.结果:建立了稳定性、重复性良好的凝胶蛋白图谱.对筛选出的在胰腺癌患者血清中明显差异表达的78个蛋白点,共有54个蛋白点被成功鉴定,其中胰腺癌患者血清中高表达者29个,低表达者25个.结论:胰腺癌患者、健康志愿者血清蛋白之间存在明显差异,通过蛋白质组学方法可筛选并鉴定出这些差异蛋白,后者有望为早期诊断胰腺癌提供依据.     

大肠癌干细胞标志物的研究进展

1 干细胞与肿瘤的研究 干细胞（stem cell,SC）是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的原始细胞,可分为胚胎干细胞、骨髓干细胞和成体干细胞3类。在多细胞生物体的生命周期中,干细胞会分化为多种不同的细胞类型,并通过对不同细胞的更新、调控细胞凋亡及多向分化等机制,维持生物体的自身稳定,在生物体的寿命方面起到一定的决定作用。     

大肠癌血清标志物癌胚抗原、CA242与机体癌周间质反应相关性的研究

[目的]通过检测大肠癌患血清癌胚抗原、CA242来研究此2种肿瘤标志物与癌周间质反应的相关性。[方法]应用放射免疫法检测33例可切除大肠癌患血清中上述标志物，在术后标本观察癌周间质反应情况。[结果].知清癌胚抗原与癌周间质反应不相关，血清CA242在癌症间质单个核细胞反应阴性与弱阳性、阳性之间有显性差异，阳笥率间亦有大差别。癌周纤维增生阴性与阳性之间有显性差异，阳性率亦有差别。[结论]大肠癌患血清癌胚抗原与癌周间质反应强弱无关；血清CA242与癌周间质反应强弱密切相关。     

多种血清标志物联合检测在大肠癌诊断中的应用

目的评价联合检测TSGF、CEA和CA19-9在诊断大肠癌中的临床应用。方法取259例健康体检者、大肠癌285例（直肠癌182例、结肠癌103例）、167例大肠良性疾病（增生性息肉79例、炎性息肉57例、管状腺瘤31例）血清,同时检测血清中几种血清肿瘤标志物（TSGF、CEA和CA19-9）水平。结果 TSGF、CEA和CA19-9诊断大肠癌的敏感率分别为87.4%、53.3%和51.2%,TSGF敏感率明显高于CEA和CA19-9（P〈0.05）,3者联合检测敏感性可提高至91.9%。结论 TSGF诊断大肠癌的敏感度高于CEA、CA19-9,但特异性低于CEA、CA19-9,3者联合检测可提高大肠癌诊断的特异性和灵敏度。     

大肠癌患者6项肿瘤标志物检查结果分析

目的 探讨大肠癌患者肿瘤特异性生长因子(TSGF),癌胚抗原(CEA),糖类抗原CA19-9、CA125、CA72-4、CA15-3等6项肿瘤标志物水平的临床意义.方法 采用免疫化学发光法检测32例肠癌患者上述6项肿瘤标志物含量并与30例健康人进行比较.结果 大肠癌患者TSGF增高13例(40.6%),CEA增高21例...     

大肠癌患者血清嗜铬蛋白A和糖链抗原联合检测的临床价值

目的：探讨嗜铬蛋白A（Chromogranin,CgA）、癌胚抗原（carcino-embryonic antigen,CEA）和糖链抗原（casbohydrate antigen19-9,CA19-9）联合测定在大肠癌中的临床价值.方法：采用放射免疫分析法（radioimmunoassay,RIA）测定32例大肠良性疾病及48例大肠癌患者血清中CGA的水平,采用微粒酶免疫法（micropartical enzyme immunoassay,MEIA）测定两组患者血清CEA和CA19-9的水平.结果：大肠癌患者与大肠良性疾病患者的CgA、CEA和CA19-9水平比较差异有统计学意义（ P〈0.05～0.01）.血清CgA、CEA和CA19-9的水平随大肠癌病程的进展而逐渐升高;3种肿瘤标志物中以CgA敏感性和特异性最高,分别为55.6%和76.3%,3种肿瘤标志物对诊断的敏感性与大肠癌的分期有关;联合检测可使诊断的敏感性提高至81.7%,尤其是对于伴有远处转移病例的诊断,具有重要的临床意义.结论：血清CgA、CEA和CA19-9水平测定可应用于大肠癌的诊断和疗效的观察,并可用于监测肿瘤的复发和转移.肿瘤标志物的联合检测有助于大肠癌的早期诊断,并增加诊断的敏感性和特异性.     

肺腺癌患者血清生物标志物的筛选研究

目的 采用SELDI—TOF—MS技术探讨肺腺癌患者血清蛋白标志物，并建立一个稳定、简便、快速的实验方法。方法 肺腺癌患者321例和正常对照人群321例，按照年龄、性别、吸烟史的有无进行1：1配对，采用WCX2芯片技术进行血清蛋白质组学研究，用蛋白芯片阅读器PBSII对芯片进行扫描、分析。结果 肺腺癌患者血清蛋白图谱与正常对照组相比，存在15个差异表达蛋白（P〈10^-5），其中包括11个高表达蛋白，分子量分别是1860Da、4055Da、4195Da、4211Da、4959Da、5329Da、5980Da、6313Da、6880Da、7762Da、9281Da，4个低表达蛋白，分子量分别是2564Da、2932Da、3082Da、3442Da。显著高表达的潜在标志物5个，相对分子量分别为4055Da、4211Da、4959Da、5329Da和7762Da，以峰值比1．5为界值时，其诊断肺腺癌的灵敏度分别为90．41％、78．08％、50．68％、57，53％、72．60％，特异度分别为97．06％、93．4J4％、71．15％、76．36％、94．92％，选用4055Da、4211Da、4959Da、5329Da和7762Da建立决策树模型对样品进行筛选验证，其准确率为85．00％，灵敏度为86．67％，特异度为83．33％。结论 用该技术能筛选出灵敏度和特异性较好的差异表达蛋白，为肺腺癌的早期发现提供了一种新的、无创伤的实验方法，可能具有较好的临床应用前景。     

大肠癌转移相关肿瘤标志物的研究进展

大肠癌病死率在全球恶性肿瘤病死率中位于第4位,就诊时有15%~35%的患者已发生转移,丧失了手术治疗的时机。目前对大肠癌的研究主要集中在大肠癌转移相关标志对大肠癌转移的早期发现和诊断等方面。诸多研究发现,大肠癌转移涉及许多分子机制,大肠癌复发转移仍是问题的关键所在。了解大肠癌转移相关肿瘤标志物既有助于提高大肠癌转移的早期诊断和治疗,又对大肠癌微转移患者的复发、预后和临床治疗有重要的意义,以期达到提高患者生存率的目的 。     

应用质谱技术筛选子痫前期的潜在生物学标志物

子痫前期(preeclampsia,PE)的病因至今尚未阐明,其导致孕产妇和围产儿较高的病死率,因此早期疾病的预测和预防非常重要。PE是一种多系统疾病,单一或一小部分生物学标志物不太可能准确预测该疾病。基于质谱(mass spectrometry,MS)的蛋白质组学研究发现了大量可能参与PE发病相关的生物学标志物。参考国内外文献将基于MS的蛋白质组学筛选出的子痫前期潜在生物学标志物归纳为促血管生成因子、抗血管生成因子、胎盘生长因子、氧化与抗氧化因子及促炎性细胞因子等,并就这些蛋白质生物学标志物做一简要综述,试图寻找彼此间的联系,为预测PE及研究该疾病的病理生理机制提供参考。     

应用二维电泳和质谱技术鉴定乳腺癌相关蛋白

目的 通过比较人乳腺癌细胞MCF7和乳腺上皮细胞MCF10A的差异表达蛋白,以发现可能用于早期诊断的乳腺癌肿瘤标志物.方法 体外培养人乳腺癌细胞MCF7和乳腺上皮细胞MCF10A,提取细胞总蛋白,进行二维凝胶电泳并比较分析,选择在乳腺癌细胞MCF7中明显差异表达的蛋白点,进行质谱和生物信息学分析.结果 建立了MCF7和MCF10A两种细胞系的二维凝胶电泳图谱,平均蛋白质点数分别为(960±44)和(1128±29);对选择的35个差异表达蛋白质点进行质谱和生物信息学分析,鉴定了其中16个点,包括过氧化氢酶-6(PRDX6)、磷酸甘油酸激酶-1(PGK1)、60 kD热休克蛋白(CH60)、谷氨酰胺转移酶-2(TGM2)等.结论 乳腺癌细胞MCF7相对于乳腺上皮细胞MCF10A的差异表达蛋白可能作为乳腺癌早期诊断和预后评价的候选肿瘤标志物.     

血清蛋白质组双向凝胶电泳技术的建立

目的建立血清蛋白质组双向凝胶电泳(2-DE)技术.方法对血清蛋白质2-DE的各种条件进行调整、优化.结果建立了稳定的2-DE技术.结论已建立的血清蛋白质2-DE技术,将为进一步开展疾病的血清蛋白质组学研究奠定基础.     

血清双向凝胶电泳技术的建立和优化

目的建立起较好及较稳定的的血清双向凝胶电泳技术。方法对血清双向凝胶电泳中血清标本的收集、保存,血清高丰度蛋白的去除,电泳条件,上样量,IPG干胶条的选择及缓冲液的配制等多种条件和技术方法进行调整和优化。结果建立了较稳定和较好重复性的血清双向凝胶电泳技术,分辨率得到一定的提高,有效分离的蛋白质点明显增多,许多低丰度蛋白被分离出来。结论通过不断的摸索和验证,可以建立起较好的血清双向凝胶电泳技术,为进一步的分析、鉴定和寻找与疾病相关的血清蛋白质奠定一定基础。     

高/低分化大肠癌组织的二维电泳图谱的建立及质谱分析

目的研究人大肠癌高、低分化组织及癌旁正常黏膜之间蛋白质组表达差异，寻找和鉴定癌组织与正常黏膜之间以及高、低分化癌组织之间差异表达蛋白。方法收集新鲜大肠癌标本；根据病理诊断结果将大肠癌标本分为高分化癌组、低分化癌组，以癌旁正常肠黏膜作为对照。提取组织总蛋白，进行双向凝胶电泳。比较得到高分化与低分化组织之间表达差异点。将这些差异蛋白点进行肽指纹图分析及网上数据库鉴定。应用Western blot验证蛋白质组筛选结果。结果在两组癌标本中均存在钙网硬蛋白前体、O98007蛋白类似物的特异表达以及AAH10915、AAH75839蛋白表达上调；在高分化癌组中存在E980237蛋白的特异表达以及三磷酸异构酶、肝脂肪酸结合蛋白表达上调；在低分化癌组中存在2HHEB（氧化血红蛋白变异体）和锌指蛋白312类似物的特异表达以及Q9TQL5蛋白（Fragment）类似物表达上调。Western blot检测HSP27和LFBP表达的结果与蛋白质组分析结果一致。结论高分化癌组织与低分化癌组织之间存在蛋白质组差异表达，这些蛋白与大肠癌细胞分化有关。     

利用双向凝胶电泳和质谱技术进行前列腺癌差异蛋白质组学研究

目的 分离前列腺癌雄激素依赖型和非依赖型细胞系差异表达蛋白质,为进一步研究前列腺癌的蛋白组学打下基础. 方法 培养前列腺癌雄激素依赖型(LNCaP)和非依赖型(DU145)细胞系,分别提取两种细胞系的总蛋白,进行等电点聚焦和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,对所得胶图利用ImageMaster4.01软件进行分析,选取差异点进行质谱分析,对分析结果进行数据库检索. 结果 得到了分辨率和重复性均好的前列腺癌雄激素依赖型和非依赖型细胞系的双向凝胶电泳图谱,每块凝胶上平均蛋白质点数为816±15,通过分析得到3倍差异点41个,完全差异点10个.对完全差异点进行质谱分析和数据库检索得到与差异点相对应的3个蛋白质,其中第83号和175号为未命名蛋白质,第632号蛋白质是KIAA1283蛋白质,具有载脂蛋白功能. 结论 在前列腺癌激素依赖型和激素非依赖型细胞系中存在差异表达蛋白质,并可以利用双向凝胶电泳技术进行分离,为进一步研究前列腺癌的蛋白质组学和发病机制提供了线索.     

肝癌血清肿瘤标志物适配体的筛选及活性鉴定

目的:肝癌血清中含有已知和未知的标志物,可以作为SELEX筛选的靶标,获得一组已知和未知肝癌血清标志物的适配体,为肝癌早期诊断提供新的分子生物学检测方法。方法：收集50例经诊断证实为原发性肝癌患者的血清,以及50例体检无异常的正常人血清,并分别等比例混合制备成肝癌混合血清和正常人混合血清,作为筛选的靶标分子,磁珠作为分离载体。先将磁珠-正常人血清复合物与ssDNA文库结合,取上清再与磁珠-肝癌血清结合,经过洗脱、分离与肝癌血清结合的特异性ssDNA,并进行扩增,链霉亲和素磁珠法制备次级ssDNA,进行9轮筛选,将9轮筛选获得的饱和文库与PMD18-T载体连接进行转化、挑选单克隆团送上海生工进行测序,同时利用流式细胞术测定肝癌血清肿瘤标志物适配体的亲和力(Kd值)。结果：经9轮筛选,成功分离出200个核酸序列,其中序列不同的有10个。结论：特异性检测表明,筛选得到的肝癌血清肿瘤标志物适配体与肝癌血清的结合解离常数均在纳摩尔级水平,其中Seq-1、Seq-16、Seq-17、Seq-56、Seq-72号适配体能高特异性结合肝癌血清,与正常人血清不结合,再通过200例肝癌血清和200例正常人血清进一步鉴定5条肝癌血清肿瘤标志物适配体检出肝癌的阳性率,阳性检出率达91%以上,为肝癌的早期诊断提供了新方法。     

应用二维电泳和质谱技术筛选食管癌及癌旁组织的差异表达蛋白质

目的 筛选食管癌组织与正常食管组织中的差异表达蛋白质,以发现用于食管癌早期诊断的生物学标志物.方法 收集食管癌组织及其配对的正常食管组织,提取组织蛋白质,进行二维电泳,选取在癌组织中高表达的3个点和在正常食管组织中高表达的3个点进行基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱分析,将获得的肽质量指纹图进行生物信息学分析,鉴定差异蛋白质,利用RT-PCR方法验证蛋白质组筛选结果.结果 建立了分辨率高、重复性较好的食管癌和食管正常组织蛋白质的二维电泳图谱,经鉴定发现了鳞状细胞癌抗原1、细胞角蛋白4和膜联蛋白Ⅰ在食管癌组织中表达下调.磷酸丙糖异构酶1、锰超氧化物歧化酶和热休克蛋白27在食管癌组织中表达上调.RT-PCR的实验结果验证了差异蛋白质的可靠性.结论 食管癌组织和正常食管组织的差异表达蛋白质可做为食管癌早期诊断的候选生物学标志物.     

奇异变形杆菌蛋白质双向电泳条件的优化及评价

目的：优化针对奇异变形杆菌蛋白质组学研究的双向电泳(2-DE)条件及其相关技术体系,阐明样品处理过程中超声功率、振摇时间和上样量对2-DE图谱的影响。方法：选取1株奇异变形杆菌,分别采用超声功率为130 W和80 W超声法裂解菌体提取总蛋白,将2种方法提取的蛋白在同一条件下进行等电聚焦和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE);超声功率为80 W提取的奇异变形杆菌总蛋白,分别取上样量1和2 mg,在同一条件下17 cm胶条上进行双向电泳。结果：超声功率为130 W处理的样本得到的2-DE图谱中蛋白斑点较少,而超声功率为80W处理的样本蛋白点多、清晰且重复性好。上样量为2 mg得到的图谱中横纵条纹明显,蛋白斑点分离度较差,而上样量为1 mg时横纵条纹较少,蛋白斑点分离度较好。结论：采用低功率超声且较少上样量处理样品能得到较好的2-DE图谱。
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人睾丸胚胎性癌蛋白质组的双向电泳分析及质谱鉴定

目的 应用双向电泳和质谱技术研究人睾丸胚胎性癌蛋白质组.方法 利用固相PH梯度双向凝胶电泳技术进行分离,凝胶经银染显色后,用PDQuest 7.30软件分析2-DE图谱.选择在睾丸胚胎性癌图谱中高表达的3个蛋白点酶解,应用基质辅助激光解析电离飞行时间/飞行时间(MALDI-TOF/TOF)仪器进行串联质谱(MS/MS)鉴定.结果 双向电泳成功有效筛选出差异蛋白点,并成功鉴定3种蛋白质.结论 双向电泳和质谱技术可有效研究睾丸胚胎性癌总蛋白质,为从蛋白质组水平研究睾丸胚胎性癌蛋白质的表达改变提供了新的方法和途径.

Abstract：

Objective To separate and identify human testicular embryonal carcinoma proteomics using two-dimensional electrophoresis (2-DE) and mass spectrometry. Methods Immobilized pH gradient two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis was used to separate the total proteins of the samples. After silver staining, PDQuest 7.30 image analysis software was applied to analyze the 2-DE images. Three of the proteins highly expressed in human testicular embryonal carcinoma were identified by matrix-assisted laser adsorption/ionization-time of flight-tandem mass spectrometry (MALDI-TOF-MS/MS). Results 2-DE effectively screened the differentially expressed proteins in the carcinoma tissues.Three proteins highly expressed in the carcinoma were successfully identified. Conclusion The proteins of human testicular embryonal carcinoma can be effectively separated and analyzed using 2-DE and mass spectrometry. Proteomic analysis offers a new means for further study of this carcinoma.     

双向电泳和质谱技术分析HCV NS3转化肝细胞的蛋白质组

目的:持续感染丙型肝炎病毒(HCV)在肝细胞癌(HCC)发生中起重要作用,细胞转染和成瘤实验表明HCV NS3对人肝细胞具有转化作用和致瘤活性.本实验旨在探讨HCV非结构蛋白3(NS3)转化肝细胞的蛋白质组.方法:构建稳定表达HCV NS3 N端多肽的人肝细胞(pRcHCNS3/QSG)及空白质粒转染细胞(pRcCMV/QSG),双向电泳技术分离两种细胞的总蛋白,差异蛋白质点进行质谱分析,Western印迹验证蛋白表达差异.结果:得到分辨率较高、重复性较好的双向电泳图谱.pRcHCNS3/QSG和pRcCMV/QSG细胞的蛋白质斑点数分别为(1 183±77)和(1 095±82)个,两组平均匹配数为(920±60)个.初步鉴定出15个有意义的蛋白质点.其中Ras,P38,HD53等参与调节信号转导的蛋白在pRcHCNS3/QSG细胞中表达上调,Western印迹结果亦证实pRcHCNS3/QSG细胞中磷酸化的P44/42和P38表达增加.鉴定出的差异蛋白质还包括一些调节细胞周期、免疫反应、与肿瘤侵袭和转移相关的蛋白质及参与肝脏代谢的蛋白质.结论:HCV NS3可能通过影响多种蛋白表达,经相应信号转导途径,如丝裂原活化蛋白激酶途径,使细胞发生恶性转化.进一步弄清信号转导过程和相互关系不仅对了解HCV相关性HCC的发生机制有重要意义,而且为从分子水平治疗HCC提供新思路.