实时定量PCR技术在寄生虫学中的应用

寄生虫计数所用的标准方法一般耗时、困难 ,准确率低。近来在寄生虫学特别是疟原虫、弓形虫、利氏曼原虫及新孢子虫等检测时使用了实时定量PCR反应 ,此技术定量准确、快速、扩增后不需要进行数据后处理。此外 ,在估算基因组容量和基因表达水平的研究方面也能应用这种方法。本文讨论目前常用的此类检测系统的优势及其局限性。     

结核杆菌DNA实时定量PCR检查在肾结核诊疗中的应用

目的 探讨结核杆菌DNA PCR检查在肾结核诊疗中的应用.方法 收集仙桃市第一人民医院肾结核患者肾脏活检组织,进行结核杆菌DNA实时定量PCR检测,观察该法诊断肾结核的敏感度;对肾结核患者进行正规治疗后观察其尿液结核杆菌DNA含量;对门诊疑似肾结核患者行尿液结核杆菌DNA实时定量PCR检测并随访,观察患者最终诊断肾结核等临床转归情况.结果 (1)与结核杆菌尿培养结果对比,实时定量PCR检测敏感度显著增高(P＜0.05);(2)经过正规抗结核治疗后,与治疗前相比,肾结核患者尿液TB DNA含量显著降低(P＜0.05);(3)随访调查发现,检验半年后,与随访对照组相比,随访组经实时定量PCR检验后,患者确诊率显著增高(P＜0.05);接受手术治疗率两组间无显著差异(P＞0.05).结论 肾脏结核杆菌DNA实时定量PCR对于诊断肾结核具有较高敏感性,尿液结核杆菌DNA实时定量PCR有助于早期发现肾结核.     

实时荧光定量PCR在登革热病毒快速检测中的应用

目的应用实时荧光定量PCR快速检测登革热病毒感染。方法采集疑似登革热患者血清,采用实时荧光定量PCR检测登革热病毒,同时采用ELISA检测血清登革热IgM抗体。结果患者发病第7d血清登革热IgM血清抗体A值为0.236和0.237(临界值0.250),高度疑似阳性,第13d血清IgM抗体阳性。患者发病第2d,通用型核酸检测显示血清登革热病毒核酸含量较多,经过治疗,于第7d病毒拷贝下降。发病第2d,核酸检测确定感染病毒为登革热Ⅲ型;发病第13d血清登革Ⅲ型病毒核酸检测阴性。结论实时荧光定量PCR法具有准确性好、灵敏度高等优点,可用于登革热病毒感染的快速检测。     

实时荧光定量PCR在病毒检测中的应用

实时荧光定量PCR是通过荧光信号监测目的基因扩增数量的定量PCR技术,具有灵敏度高,检测速度快等优点。实时荧光定量PCR已被应用于乙肝病毒、登革热病毒、流感病毒、水疱口炎病毒等病毒的快速检测,在病毒快速分型、相似病毒的鉴别检测、耐药病毒突变体检测等临床和公共卫生领域得到广泛应用。狂犬病是危害严重的人兽共患病,病死率几乎为100%。实时荧光定量PCR技术已被应用于狂犬病病毒和狂犬病相关病毒的核酸检测,具有与金标准DFA相当的灵敏度和特异度,同时克服了金标准DFA的某些局限性,如检测速度更快,无需提取脑组织,对唾液、脑脊液等低病毒载量样本具有较好的检出效果,具有成为人间狂犬病诊断技术的潜力。灵敏度是传统RT-PCR的200倍以上,交叉污染的风险更低。实时荧光定量PCR也应用于欧洲蝙蝠病毒等狂犬病相关病毒的检测,可建立多重实时荧光定量PCR在单一检测体系对多种病毒进行快速鉴别,对于预防病毒性传染病具有重要的公共卫生意义。本文详细介绍了该技术的相关原理和方法,以及在病毒检测方面的国内外研究进展。     

荧光实时定量PCR方法在肺癌相关基因检测中的应用

目的研究实时定量荧光PCR在非小细胞肺癌患者肿瘤组织、正常组织及外周血中RRM1、ERCC1表达水平检测的应用价值。方法构建目的基因质粒标准品,运用PCR仪进行SYBR荧光实时定量分析,比较其表达水平。结果两者在外周血中表达水平与TNM分期、是否淋巴转移等有关;肿瘤组织和外周血中的表达具有一致性。结论荧光实时定量PCR具有良好的特异性和灵敏度,费用低,操作简便,可应用于临床检验工作。     

实时荧光定量PCR方法检测幼兔粪便双歧杆菌的实验研究

目的:应用实时荧光定量PCR技术对实验幼兔粪便内双歧杆菌进行定量分析．方法:依据双歧杆菌16S rDNA序列设计属特异性引物,以常规PCR产物经克隆后的质粒 DNA为标准品,经光谱定量、梯度稀释后制备标准曲线．抽提正常对照组和双歧杆菌喂饲组幼兔粪便内的细菌基因组DNA,用实时荧光定量PCR技术定量分析样品中双歧杆菌数量．结果:两组幼兔粪便内双歧杆菌测定结果均成阳性,双歧杆菌喂饲组0．05 g湿粪内菌量的对数值较对照组显著升高(6．37±0．58 vs 5．18 ±0．98,P=0．004)．结论:实时荧光定量PCR方法可正确定量实验兔粪便内双歧杆菌数量．     

实时荧光定量PCR技术检测肺炎衣原体的诊断价值

目的探讨实时荧光定量PCR技术检测肺炎衣原体的诊断价值。方法对呼吸道感染的186例患者的痰液分别采用实时荧光定量PCR技术和基因测序检测,以评价实时荧光定量PCR技术检测肺炎衣原体感染的准确性。结果实时荧光定量PCR检测肺炎衣原体的灵敏度为100.0%,特异度为93.1%,阳性预期值为80.8%,阴性预期值为100.0%,准确率为94.6%。结论实时荧光定量PCR技术检测肺炎衣原体具有较高的可靠性,适用于临床快速诊断肺炎衣原体感染的相关疾病。     

实时定量PCR技术在寄生虫学中的应用

寄生虫计数所用的标准方法一般耗时、困难，准确率低。近来在寄生虫学特别是疟原虫、弓形虫、利氏曼原虫及新孢子虫等检测时使用了实时定量PCR反应，此技术定量准确、快速、扩增后不需要进行数据后处理。此外，在估算基因组容量和基因表达水平的研究方面也能应用这种方法。本讨论目前常用的此类检测系统的优势及其局限性。     

实时荧光定量PCR检测恙虫病东方体

目的建立检测恙虫病东方体的实时荧光定量PCR(quantitative real-ti me PCR)方法。方法根据恙虫病东方体56kD外膜蛋白基因序列设计引物和探针,以克隆的56kD基因片段作DNA模板,建立实时荧光定量PCR检测方法。结果建立的荧光定量PCR标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.999)。荧光定量PCR检测恙虫病东方体的灵敏度约为套式PCR的100倍,并且具有良好的重复性。用该定量PCR检测其它相关立克次体和病原菌DNA样本,检出结果均为0。用该定量PCR检测恙虫病东方体实验感染小鼠的血、脾脏、肺脏、肝脏标本,结果脾脏中东方体出现最早和检出量最多,肝脏和肺脏次之。血中的恙虫病东方体量较低。结论本研究建立的荧光定量PCR方法具有很高的特异性和敏感性,可用于东方体感染早期血样本的快速检测作恙虫病感染早期诊断,并且可以定量分析评价恙虫病东方体感染的程度。     

实时荧光定量PCR在手足口病肠道病毒快速检测中的应用

目的建立快速检测手足口病肠道病毒的实时荧光定量PCR法,并作出应用分析。方法采用卫生部《手足口病预防控制指南》(2008年版)推荐的RT-PCR法,对丽水市2008年4～5月间发生的172例临床诊断手足口病患者的324份标本进行人肠道病毒、柯萨奇病毒A组16型和肠道病毒EV71型特异性核酸的检测,同时采用实时荧光定量PCR法进行平行检测,比较两者的实验结果,分析实时荧光定量PCR方法的特异性和灵敏度。结果实时荧光定量PCR检测324份标本,肠道病毒通用核酸阳性70份,柯萨奇A16核酸阳性22份,肠道EV71病毒核酸阳性15份,与RT-PCR结果一致,符合率100%。结论实时荧光定量PCR法具有特异性强、灵敏度高等优点,是一种理想的手足口病肠道病毒的检测方法。     

定量PCR检测乙型肝炎患者血清HBV DNA及其临床意义

目的:了解不同临床类型乙型肝炎患者HBV DNA含量并探讨其临床意义。方法:应用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术检测163例乙型肝炎患者血清HBV DNA含量,应用ELISA法检测上述患者HBV感染血清免疫学标志物(HBV-M),并对两者进行比较。结果:血清HBV DNA水平在不同乙型肝炎临床类型中无显著性差异(P>0.05);与HBV-M对比,HBsAg、HBeAg、抗-HBc阳性病人的检出率为87.76％,HBsAg、抗-HBe、抗HBc病人的检出率为45.71％,HBsAg、抗-HBc病人的检出率为42.86％,抗-HBc单项阳性病人的检出率亦达40.00％;血清HBVDNA含量与黄疸的程度及转氨酶水平的高低未见相关。结论:提示HBV DNA的复制状态与不同乙型肝炎临床类型无明显相关关系;HBV DNA含量高低与肝功能受损程度亦无相关关系。     

Multiplex ARMS PCR to Detect 8 Common Mutations of ATP7B Gene in Patients With Wilson Disease

Background

Wilson disease is a rare disorder of copper metabolism due to mutation in ATP7B gene. Proper counseling of patients with Wilson disease, and their families necessitates finding mutation in ATP7B gene. Finding mutations in ATP7B gene with 21 exons, and more than 500 mutations is expensive and time-consuming.

Objectives

The aim of this study was to provide a simple multiplex amplification refractory mutation system PCR (M-ARMS-PCR) for screening eight common mutations in ATP7B gene.

Patients and Methods

Two sets of ARMS mutant and normal specific primer pairs were designed for genotyping of p.R778L, p.R969Q, p.H1069Q, and p.3400delC mutations as Set 1 and p.W779G, c.3061-1G > A, p.I1102T, and p.N1270S mutations as Set 2. The Multiplex ARMS assay was then subsequently tested in 65 patients with Wilson disease with known and unknown ATP7B mutations.

Results

Using these two sets, we identified H1069Q mutation in four patients, c.2335T > G mutation in three, c.3061-1G > A splice site mutation in five, c.3305T > C mutation in one, and c.3809A > G mutation in two patients.

Conclusions

The Multiplex ARMS assay used in this study can be an efficient, reliable, and cost effective method as a primary screen for patients with Wilson disease.     

PCR结合索氏转移杂交在结核病诊断中的应用

利用Ｈｅｒｍａｎｓ引物扩增插入序列ＩＳ９８６所得之２４５ｂｐ片断是一结核分支杆菌复合体特异性片断，采用随机引物法将地戈辛标记该片断。将纯化结核分支杆菌ＤＮＡ经聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增，索氏转移后与该探针杂交，检测灵敏度可达１ｆｇＤＮＡ。通过对７９例痰标本、１４例结核性胸腔积液及２６例结核性关节腔积液的ＰＣＲ和ＤＮＡ索氏杂交试验比较，认为采用２４５ｂｐ探针，将ＤＮＡ索氏转移杂交与ＰＣＲ体外扩增相结合，不仅提高了结核病基因诊断的敏感性，同时也提高了诊断的特异性。     

激光捕获显微切割技术在胃肠道肿瘤研究中的应用

激光捕获显微切割（LCM）技术是一种在显微镜直视下．通过激光捕获和切割从异质性组织中获得纯净目的细胞群或单个细胞的技术。该技术既解决了组织异质性问题,又不脱离体内环境,是连接病理学与分子生物学研究不可或缺的桥梁。我国是胃癌高发地区,近年来结直肠癌的发病率亦逐渐升高。为此,本文对LCM的操作步骤及其与多种技术结合．在胃肠道肿瘤研究中的应用作一综述。     

不同引物对PCR检测沙眼衣原体结果的影响

为了解不同引物对PCR检测泌尿生殖道沙眼衣原体（CT）感染的影响,作者以直接免疫荧光法（DIFA）为标准,选用引物不同的市售PCR试剂盒检测了209例泌尿生殖道可疑CT感染标本。结果引物1RCR阳性29例,引物2PCR阳性28例;在DIFA阳性25例中,引物1PCR阳性24例,引物2PCR阳性23例;引物1PCR敏感性为96．0％,特异性为97．8％;引物2PCR敏感性为92．0％,特异性为98．4％。与DIFA比较,两者在统计学上无显著差异（P＞0．05）,提示不同引物对PCR检测CT感染无明显影响。     

实时荧光定量PCR法检测日本血吸虫

目的 运用实时荧光定量PCR法检测日本血吸虫。 方法 根据日本血吸虫18 S小亚基单位核糖体核酸（18S rRNA）基因设计特异性引物,PCR扩增出1 450 bp序列,经TA克隆后转入大肠埃希菌DH5α,提取重组质粒,鉴定后作为模板制作荧光定量PCR 标准曲线。方法重现性评价,用初始循环数（Ct,拷贝/反应）进行标准差分析,并计算变异系数（CV）。 结果 制作的标准曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.998 7。方法重现性评价,在1.05×107～1.05×103个拷贝范围内,对应的Ct平均值分别为17.55、20.93、24.32、27.59和30.95;CV值分别为1.31%、1.53%、0.90%、1.85%及0.90%,在重复性试验中试验间数据平均变异系数为1.27%,无非特异性扩增。 在试验检测范围内（Ct≤30.95）,可检测的日本血吸虫基因组浓度为6.15 pg,3 h内完成。 结论 运用荧光定量PCR方法检测日本血吸虫DNA,快速、灵敏、特异性高。     

定量分析幽门螺杆菌根除前后部分肠道菌群的改变

背景:全球约半数人群存在幽门螺杆菌(Hp)感染,根除Hp是治疗其感染相关疾病的重要方法。目的:分析Hp根除前后部分肠道菌群的改变,探讨铋剂四联疗法对肠道微生态的影响。方法:纳入2016年1月—2017年1月在深圳市第三人民医院发现Hp感染阳性、接受铋剂四联疗法根除治疗并成功根除Hp的个体,采集其Hp根除前和根除治疗结束后3 d内的粪便标本,提取基因组DNA,采用菌属特异性引物行real-time PCR定量分析。结果:与根除前相比,Hp根除后粪便肠杆菌属、肠球菌属数量明显增加,双歧杆菌属、拟杆菌属、梭菌属和总菌数量明显减少,差异均有统计学意义(P<0.05),乳酸杆菌属数量无明显变化(P>0.05)。结论:采用铋剂四联疗法根除Hp可影响肠道菌群结构,导致肠道微生态失衡。     

Quantitative Real-time PCR: A Critique of Method and Practical Considerations

Gilbert's syndrome (GS) is a benign, familial condition characterized by recurrent asymptomatic non-hemolytic low-grade indirect hyper-bilirubinemia. Conditions related to fasting, stress or co-morbidity might reveal the disease in asymptomatic individuals. Seven patients who were treated for a hematological malignancy were identified with reversible indirect hyper-bilirubinemia. Liver function tests in all of them, including bilirubin levels were normal before the therapeutic maneuver, which was the delivery of combined chemotherapy in three cases and a bone marrow transplantation in four (three allografts and one autograft). Bilirubin levels returned to normal in all five patients following treatment. GS should not be overlooked in individuals exposed to these treatments who develop hyperbilirubinemia and jaundice.     

Development of a Polymerase Chain Reaction (PCR) method based on amplification of mitochondrial DNA to detect Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax

In this study we standardized a new technical approach in which the target mitochondrial DNA sequence (mtDNA) is amplified using a simple but sensitive PCR method as a tool to detect Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax. Specific primers were designed to hybridize with cytochrome c oxidase genes of P. falciparum (cox III) and P. vivax (cox I). Amplification products were obtained for all positive samples, presenting homology only for species-specific mtDNA. Sensitivity and specificity were 100%. The applicability of the method was tested in a cross-sectional study, in which 88 blood samples from individuals naturally exposed to malaria in the Brazilian Amazon region were analyzed. Based on the results, the sensitivity and specificity were 100% and 88.3%, respectively. This simple and sensitive PCR method can be useful in specific situations and in different settings of malaria management, in endemic as well as non-endemic areas (travelers), and in clinical or epidemiological studies, with applications in malaria control programs.     

聚合酶链反应检测肝硬化患者腹水中细菌DNA

目的:探讨PCR方法检测肝硬化患者腹水中细菌DNA的可行性.方法:在细菌16S rRNA基因保守区设计一对通用引物,对7种对照菌株、人基因组DNA、HBV DNA、37份肝硬化患者腹水进行聚合酶链反应扩增.结果:7种对照菌株均获得530 bp DNA片段.而与人基因组DNA、HBV DNA无交叉阳性反应,敏感性试验可检测出1pg的细菌DNA.37份腹水中有9份获得53bp DNA片段,阳性率24.3%(9/37),而腹水细菌培养阳性率为5.4%(2/37),两者比较差异有显著性意义(P＜0.05).结论:将通用引物通过PCR方法扩增细菌16S rRNA基因,具有高度敏感性、特异性,可应用于肝硬化患者腹水中细菌DNA的检测及细菌移位的研究.