Tet-on基因表达系统调控HIF-1α表达对肝癌细胞增殖的影响

目的 探讨HIF-1α表达对肝癌细胞增殖和细胞周期的影响.方法 利用Tet-on基因表达系统调控肝癌细胞系HepG2中HIF-1α的表达,检测细胞周期和细胞增殖的变化.结果 酶切和DNA测序证实Tet-on基因表达系统反应质粒PTRE-HIF-1α构建成功.获得了受强力霉素调控、稳定表达HIF-1α的肝癌细胞.随着强力霉素浓度增加,hiF-1α基因表达增加,HIF-1α在体外明显增加HepG2细胞增殖活性;G0/G1期细胞指数减少,细胞增殖指数增多.RT-PCR检测结果表明,随着HIF-1α基因表达增加,Cyclin A mRNA表达增加(P＜0.001),Cyclin D1和Cyclin E mRNA表达水平无明显变化(P＞0.05).结论 HIF-1α基因在体外可以通过HIF-1α表达水平的增加而促进肝癌细胞增殖活性,通过CyclinA表达增加缩短了肝癌细胞增殖周期.     

利用Tet-on调控系统建立人肝癌HepG2Tet-on细胞系

目的 构建可以用强力霉素调控表达的人肝癌HepG2Tet-on细胞系,为进一步研究肝癌相关基因功能奠定基础.方法 用脂质体转染法将pWHE146质粒转染到人肝癌HepG2细胞中,用G418筛选出稳定表达细胞克隆;单克隆分别扩增后,瞬时转染pTRE-hyg-luc质粒;强力霉素诱导表达后,检测荧光素酶表达活性,挑选出受强力霉素调控的低背景、高表达的HepG2Tet-on细胞株.结果 成功构建了一株受强力霉素调控的高表达低背景的HepG2Tet-on细胞株(诱导倍数达154.106倍).结论 HepG2Tet-on细胞株可用于外源基因的真核调控高表达,为研究真核基因功能提供一种可靠的细胞株.     

缺氧诱导因子1α的表达对HepG2细胞增殖与凋亡的影响

目的观察缺氧诱导因子1α（HIF-1α）对HepG2细胞增殖相关CyclinD1、CyclinA基因与凋亡相关Survivin、Bcl-2基因的影响。方法对Tet—on基因表达系统调控的缺氧诱导因子1α转染入HepG2细胞,用不同质量浓度的强力霉素对受强力霉素调控、稳定表达HIF—1α的HepG2^Tet-on进行凋亡诱导,检测肝癌细胞的凋亡和HIF-1α、CyclinD1、CyclinA、Survivin、Bcl-2的基因表达。结果终浓度分别为0、0．1、1、5mg／L的对HIFHepG2^Tet-on进行细胞凋亡诱导,细胞凋亡率分别为56．4％±7．8％、42．7％±4．9％、31．5％±6．1％、19．7％±4．5％;随着强力霉素浓度的增加,HIF-1α、CyclinD1、CyclinA、Survivin、Bcl-2基因表达水平增加,差异有统计学意义（P〈0．01）。结论HIF-1α基因在体外可以促进HepG2细胞的增殖,抑制其凋亡,而且随着HIF—1α基因表达水平的增加作用不断增强,这可能与HIF-1α诱导CyclinD1、CyclinA、Survivin、Bcl-2基因表达有关。     

Tet-on基因表达系统调控HIF-1α表达对肝癌细胞凋亡的影响

目的探讨HIF-1α表达在体外对肝癌细胞凋亡的影响。方法利用Tet—on基因表达系统调控HePG2细胞HIF-1α的表达，观察细胞凋亡。结果酶切和DNA测序证实Tet—on基因表达系统反应质粒P^tre-hif-1α构建成功。获得了受强力霉素调控、稳定表达HIF-1α的肝癌细胞。经阿霉素诱导凋亡后，强力霉素终浓度为0μg／ml、0．02μg／ml、0．2μg／ml、1μg／ml、2μg／ml、5μg／ml时的细胞凋亡率分别为59．6％、50．9％、38．1％、30．5％、23．9％、18．3％；强力霉素0．02μg／ml、0．2μg／ml、1μg／ml、2μg／ml、5μg／ml处理细胞后，Casepase-3活性分别降低了2．3、5．5、8．7、12．6、18．8倍。RT—PCR检测结果显示，随着强力霉素浓度的增加，HIF-1α表达水平增加，Survivin和Bcl-2基因表达强度逐渐增加，差异有统计学意义（P〈0．001）。结论HIF-1α基因在体外可以抑制肝癌细胞凋亡，而且随着HIF-1α表达水平的增加，对肝癌细胞的凋亡抑制作用进一步加强，可能与HIF-1α诱导survivin和Bcl-2的表达及抑制casepase-3的活性有关。     

EphA1基因可控性双稳转内皮祖细胞系EPCsTet-On-EphA1SiRNA的建立

目的建立可调控EphA1基因表达的内皮祖细胞系EPCsTet-On-EphA1SiRNA。方法将pWHE146质粒转染到内皮祖细胞系中,筛选出稳定表达的细胞克隆;扩增后瞬时转染pTRE-hyg-luc质粒,强力霉素诱导表达后,检测荧光素酶活性,挑选出高表达、低背景的受强力霉素调控的EPCsTet-On细胞株;再将重组质粒pTRE-EphA1SiRNA转染入EPCsTet-On细胞株,筛选出稳定表达细胞克隆EPCsTet-On-EphA1SiRNA;通过强力霉素诱导后,利用RT-PCR和Western blotting法检测EphA1基因mRNA与蛋白的表达。结果成功构建了受强力霉素调控的高表达低背景的EPCsTet-On-EphA1SiRNA细胞株;强力霉素可诱导EPCsTet-On-EphA1SiRNA细胞株中EphA1mRNA表达下调,较之未调控组其差异有统计学意义(P<0.05);强力霉素调控EphA1蛋白表达的能力在一定范围内呈剂量依赖性关系。结论成功建立强力霉素调控EphA1基因表达的大鼠双稳转内皮祖细胞系EPCsTet-On-EphA1SiRNA,为深入研究EphA1基因在内皮祖细胞参与肝癌血管生成过程中的作用提供了有效的实验手段。     

Omi/HtrA2预测肝细胞癌预后中的作用及其与缺氧诱导因子-1α的相关性

目的 探讨Omi/HtrA2的表达水平在预测肝细胞癌预后中的作用及其与缺氧诱导因子(HIF)-1α的相关性.方法 采用免疫组化法检测43例原发肝癌组织标本中Omi/HtrA2和HIF-1α的表达水平,并结合随访资料进行分析.将重组质粒pTRE-HIF-1α转染到HepG2Tet-on细胞,以含0、0.02、0.20、1.00、2.00、5.00 mg/L浓度强力霉素的培养液体外培养已转染pTRE-HIF-1α的HepG2Tet-on细胞,应用RT-PCR法检测不同表达水平HIF-1α对Omi/HtrA2表达的影响.结果 Omi/HtrA2表达与肝细胞癌肝门淋巴结转移和术后2年内肝内复发相关.Omi/HtrA2表达阳性患者肝癌切除术后1、2、3、4、5年累积生存率明显高于Omi/HtrA2表达阴性患者(x2=6.13,P=0.013).HIF-1α和Omi/HtrA2在免疫组化染色的同一切片中,HIF-1 α表达阴性或者弱阳性标本中Omi/HtrA2多表达为阳性或强阳性,HIF-1α表达阳性或者强阳性标本中Omi/HtrA2多表达为阴性或弱阳性.RT-PCR方法检测结果显示,随着HIF-1α表达水平的增加,Omi/HtrA2基因的表达强度逐渐降低(F=106.766,P＜0.01).结论 Omi/HtrA2可能成为预测肝细胞癌预后的一个重要分子标记.肝癌组织中Omi/HtrA2与HIF -1α表达水平呈负相关,在Omi/HtrA2参与肝癌细胞凋亡过程中,HIF-1α可能参与调控了Omi/HtrA2的表达.     

人骨形态蛋白-2可调控系统在大鼠骨髓间充质干细胞的表达

目的构建携带四环素真核诱导表达系统(Tet-on)调控的人骨形态发生蛋白2(h BMP-2)慢病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),为骨缺损修复提供可控的成骨活性细胞。方法设计目的基因h BMP-2引物,将扩增纯化的目的基因h BMP-2定向克隆至携带Tet-on的慢病毒GV347载体上并测序鉴定产物。h BMP-2-GV347质粒、空载的GV347质粒分别与辅助质粒共感染293T细胞以收获慢病毒浓缩液。用h BMP-2-GV347慢病毒转染大鼠BMSCs,得到h BMP-2阳性表达细胞,探索转染最佳感染复数(MOI)。用CCK8法比较BMSCs转染前后的增殖活性;强力霉素(DOX)诱导打开Tet-on,real-time PCR、Western Blot和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测转染后各组BMSCs中BMP-2蛋白及RNA的表达情况。结果 PCR后得到目的基因h BMP-2,定向克隆至携带Tet-on系统调控的GV347质粒上,经酶切后电泳、测序结果证实成功构建携带可调控系统的h BMP-2-GV347质粒。h BMP-2-GV347质粒与空载GV347质粒分别感染293T细胞后获得h BMP-2-GV347慢病毒浓缩液。在DOX诱导下,h BMP-2-GV347慢病毒载体在293T细胞内表达BMP-2蛋白。h BMP-2-GV347慢病毒载体转染最佳MOI值为9,且转染后的BMSC细胞增殖能力较普通BMSC强,并在DOX浓度为10μg/ml诱导下稳定表达BMP-2蛋白和RNA。结论本研究成功构建携带Tet-on系统调控h BMP-2慢病毒表达载体,转染BMSCs后在DOX调控下可持续高效表达BMP-2蛋白。     

受强力霉素调控表达的人肝癌HepG2细胞系的建立

目的建立受强力霉素 (doxycycline)调控表达的人肝癌HepG2细胞系。 方法用阳离子脂质体lipofectamine 2 0 0 0 0将pTet on质粒转染人肝癌HepG2细胞 ,通过G4 18筛选得到稳定转染的抗性克隆 ;将抗性克隆细胞分别培养扩增 ,通过 pTRE luc质粒瞬时转染 ,加入终浓度为 1μg/ml的doxycycline诱导剂培养 4 8h后 ,逐一检测每个细胞株的荧光素酶表达活性。 结果第 6号克隆的细胞诱导后荧光素酶的表达活性为 16 76 4 ,而非诱导状态下该细胞株的背景活性为 87,诱导后的活性增加 192倍。结论HepG2 /Tet on细胞株是可调控基因表达的人肝癌细胞株 ,为研究肝癌的发病和基因治疗提供了较为理想的研究工具。     

肾癌ACHN细胞HIF-1α基因siRNA真核表达质粒的构建与筛选

目的采用RNA干扰方法,构建及筛选对肾透明细胞癌ACHN细胞缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因有干扰沉默作用的真核表达质粒。方法 CoCl2缺氧诱导培养ACHN细胞高表达HIF-1α,设计并化学合成4条针对HIF-1α基因的小干扰RNA（siRNA）序列,构建相应真核表达质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1/2/3/4,经测序分析,质粒构建成功后,分别转染ACHN细胞后培养24h,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,计算转染效率,采用荧光实时定量PCR（real time-PCR）和免疫印记杂交法（Western blot）分别检测HIF-1α的mRNA与蛋白表达水平。结果质粒构建后经测序显示与设计完全一致;荧光显微镜下观察到ACHN细胞表达绿色荧光蛋白,证实重组质粒已转入细胞,转染效率约为78%;实时定量PCR与Western blot结果显示,siRNA-1/2组HIF-1α的mRNA与蛋白表达较对照组均明显下降（P〈0.05）,质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1/2明显干扰抑制ACHN细胞HIF-1α基因表达,其中以质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1效果最佳。结论本实验成功构建靶向HIF-1α基因的真核表达质粒,并筛选出能有效抑制ACHN细胞HIF-1α基因表达的质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1/2,这为肾癌的基因治疗提供了新的方法和手段。     

针对前列腺癌HIF-1α的2种pSUPER RNAi系统的构建及鉴定

目的 构建2种抑制HIF-1α的siRNA表达载体.方法 根据Gen Bank中HIF-1α序列信息并结合2种pSUPER载体的共同的酶切位点结构.化学合成2对编码短发夹RNA序列的靶向HIF-1α基因的寡核苷酸链,各60个碱基、退火、克隆到经Bgl Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切的2种pSUPER载体上,获得的2种重组RNAi质粒转化感受态大肠杆菌.挑选阳性克隆,抽取重组质粒,EcoR Ⅰ、HindⅢ双酶切电泳、测序鉴定,培养前列腺癌PC-3细胞通过Western blot检测2种重组BNAi载体干扰效果.结果 将重组构建的2种pSUPER质粒经双酶切电泳分析及插入基因片段进行序列分析,目的 基因片段成功插人到设计位点,并且序列完全一致.2种重组质粒可显著降低前列腺癌PC-3细胞蛋白的表达.结论 2种重组RNAi载体的成功构建,为进一步研究HIF-1α在前列腺癌发病机理及增殖、转移中的功能奠定了基础,同时可以用于其在其他肿瘤的功能研究.     

常氧条件下调控表达缺氧诱导因子1α对肝癌细胞增殖和侵袭能力的影响

目的探讨在体外常氧条件下,诱导表达缺氧诱导因子1d（HIF-1α）对肝癌细胞（HepG2）增殖及侵袭能力的影响。方法利用Tet—on基因调控系统构建能诱导表达HIF-1α的HepG2^Tet-on-HIF-1α“细胞系;常氧条件下,噻唑兰法检测HIF-1α对细胞增殖、黏附能力的影响,Transwell法检测其对HepG2细胞侵袭能力的影响。结果常氧条件下,强力霉素（1μg／m1）可诱导HepG2^Tet-on-HIF-1α“细胞HIF-1αmRNA和蛋白表达增加;增殖实验中,Dox（＋）组与Dox（一）组各时段吸光度A490nm值无差异（P〉0．05）;黏附实验中,Dox（＋）组的A490nm值明显高于Dox（-）组（P=0．008）;Dox（＋）组侵袭细胞数[（37．6114-8．424）个]明显高于Dox（-）组[（25．3334-8．117）个]（P〈0．01）。结论Tet—on基因调控系统可上调HIF-1α mRNA的转录并增加其蛋白的表达;常氧条件下,HIF-1α不影响HepG2细胞的增殖,但明显增加其黏附和侵袭能力。     

缺氧诱导因子1α在肝癌细胞上皮-间充质化中的作用

目的:探讨缺氧诱导因子1 α(HIF-1 α)在肝癌上皮-间充质化(EMT)中的作用.方法:采用可调控HIF-1 α表达的肝癌HepG2Tet-on-HIF-1α细胞系,首先用real-time PCR与Western blot方法检测低氧环境中HepG2Tet-on-HIF-1α细胞EMT相关分子(E-cadherin,vimentin,FSP-1)及HIF-1 α的mRNA和蛋白表达水平,然后在常氧环境下,采用强力霉素(Dox)诱导HepG2Tet-on-HIF-1α细胞HIF-1 α过表达,以及HepG2Tet-on-HIF-1α细胞经Dox处理后再转染HIF-1αsiRNA,观察上述分子的表达情况.结果:低氧处理后,HepG2Tet-on-HIF-1α细胞EMT相关分子及HIF-1 α的mRNA和蛋白表达水平较常氧状态下均明显增加(均P＜0.05);常氧环境下,Dox能诱导HepG2Tet-on-HIF-1α细胞HIF-1 α过表达,同时明显增加EMT相关分子的mRNA和蛋白表达水平(均P＜0.05),但转染HIF-1αsiRNA后,Dox的诱导作用被取消.结论:HIF-1α促进HepG2细胞EMT,并可能是肝癌基因治疗的有效靶点.     

缺氧应激对HepG2细胞中甲硫氨酸腺苷转移酶2A基因表达的影响

目的 观察体外缺氧条件下肝癌细胞株HepG2中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和甲硫氨酸腺苷转移酶2A(MAT2A)的表达,探讨HIF-1α在低氧条件下对MAT2A基因表达的调控作用.方法 构建人MAT2A启动子真核表达载体质粒,CoCl2化学模拟肿瘤缺氧环境,检测缺氧条件下MAT2A启动子活性,HIF-1α和MAT2A在HepG细胞中的共定位、mRNA和蛋白水平的表达.以及小干扰RNA(siRNA)沉默HIF-1α后对MAT2A基因表达的影响.结果　缺氧24 h能使HepG2细胞活性增加到高峰(41.26±2.34),同时MAT2A基因的表达也较常氧时显著升高(P＜0.01),siRNA转染HepG2细胞后能显著下调HIF-1α蛋白表达(抑制率90%),并导致MAT2A基因的表达也受到明显抑制.结论　缺氧促使HepG2细胞中HIF-1α在蛋白水平表达升高,缺氧时HIF-1α能上调MAT2A基因的表达水平.

Abstract：

Objective To observe the expression of hypoixa inducible factor-1α (HIF-α) and methionine adenosyltransferase-2A (MAT2A) gene in HepG2 cells under hypoxia in vitro, and explore the regulation of MAT2A gene expression by HIF-1α. Methods Human MAT2A promoter eukaryotic expression vector was constructed. CoCl2 was used as a chemical hypoxia-inducible reagent to mimic tumor bypoxic microenvironment. MAT2A promoter activity, and mRNA and protein expression of HIF-α were detected in the HepG2 cells transfected with RNA interference (RNAi) originated by small interfering RNA (siRNA). The change of MAT2A gene expression was observed after HIF-1α gene silencing. Results Under hypoxia for 24 h, HepG2 cell activity was increased to (41.26 ± 2. 34 ), and the mRNA and protein expression levels of MAT2A were up-regulated (P ＜0. 01 ). After siRNA targeting, the HIF-1α was downregulated efficiently in HepG2 cells (inhibition ratio: 90% ), and MAT2A gene was down-regulated as well. Conclusion Hypoxia can increase protein level of HIF-1α in HepG2 cells, and HIF-1α up-regulates the gene expression of MAT2A.     

微环境诱导肝细胞癌多药耐药的形成及机制

目的探讨微环境在肝癌多药耐药（MDR）表型形成中的作用，并初探其作用机制，为逆转肝癌耐药提供有效的新的分子靶点。方法模拟肝癌体内生长的局部微环境，使HepG2细胞分别在缺氧、低糖的微环境下生长或稳定整合HBX基因。应用荧光定量聚合酶链反应（PCR）技术和Westernblot技术分别检测这些局部微环境因素作用下的HepG2细胞内多药耐药相关基因mdr1、肺耐药相关蛋白基因（LRP）、多药耐药相关蛋白基因（MRP1）和缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的mRNA和蛋白水平的表达。同时运用免疫细胞化学技术检测肝癌耐药细胞株中HIF-1α蛋白的表达。以及检测转染了HIF-1α质粒的HepG2细胞中上述相关多药耐药基因的表达。结果在缺氧、低糖环境下生长或稳定整合了HBX基因的HepG2细胞均不同程度地高表达多药耐药相关基因和HIF-1α；在肝癌耐药细胞株中HIF-1α蛋白高表达；稳定转染了HIF-1α质粒的HepG2细胞显著高表达多药耐药相关基因。结论肝癌生长的微环境可通过核转录因子HIF-1α调控多药耐药相关基因的表达。从而诱导肝癌多药耐药表型的形成；HIF-1α有望成为逆转肝癌耐药的新的分子靶点。     

Tet-on基因表达系统转染骨髓基质干细胞和诱导调控效应检测

目的 探讨利用Tet-on基因表达系统调控目的基因在骨髓基质干细胞中表达的可能性和量效关系，为利用该系统调控BMP基因在骨髓基质干细胞中的表达奠定基础。方法 以荧光素酶（luciferase)基因为目的基因，应用Lipofectamine介导的瞬间转染方法。将pTet-on调节质粒和pTRE-luciferase反应质粒共转染骨髓基质干细胞，加入系列浓度的强力霉素（doxycyline)后，观察doxy-cyline的诱导效应。结果 （1）pTet-on表达系统质粒DNA经HindⅢ单酶切，琼脂糖凝胶电泳后，可见6.02kb和1.38kb两个片段；pTRE-luciferase质粒经HindⅢ单酶切线性化，可见5.2kb的片段，均符合质粒图谱。（2）随着doxycyline浓度的增加，荧光素酶的活性也逐渐增加，未转染的骨髓基质干细胞虽经doxycyline诱导，但其RLU值与空白对照（蒸馏水）非常接近，说明未转染的骨髓基质干细胞不受doxy-cyline诱导，而转染的骨髓基质干细胞在未加入诱导剂量，其RLU（relative-luciferase-unit)值也接近空白对照值。结论 转染Tet-on基因表达控制系统的骨髓基质干细胞对doxycyline诱导具有较好的反应性，目的基因荧光素酶基因的表达效力对doxycyline具在严格的计量依赖关系。因此，利用Tet-on基因调控系统对目标基因在骨髓基质干细胞中的表达进行调控是可行的。     

利用重构pc-MDR1质粒快速诱导肝癌细胞耐药

目的：从裸鼠原位耐药肿瘤组织中进行MDR1 cDNA的全克隆和pc-MDR1重组质粒的构建，并转染HepG2细胞，快速诱导其耐药，并筛选其抗性克隆。方法：设计单酶切位点引物，利甩长距离逆转录PcR(Long RT-PCR)技术，由HepG2耐药细胞扩增MDR1 cDNA，约3．8kb大小。将其插入至真核表达载体pcDNA3．0质粒中构建pc-MDR1诱导质粒，使其能够在真核细胞中表达p-gp蛋白。转染HepG2细胞，并用G418筛选出转染的细胞。结果：成功地扩增出3．8kb左右的MDR1 cDNA片段，经酶切鉴定、RT-PCR扩增特异片段和序列测序结果显示质粒构建初步成功，用G418筛选细胞耐药抗性克隆的时间约为14d。结论：从耐药肿瘤组织中进行MDR1 cDNA的全克隆和pc—MDR1诱导质粒的构建成功快速诱导了肝癌细胞发生耐药，为进一步研究肿瘤细胞的耐药机制奠定了很好的基础。     

白介素18对结肠癌sw480细胞移植瘤HIF-1α表达的影响

目的 观察人白介素18(hIL-18)对结肠癌sw480细胞的抑制效应及hIL-18对sw480细胞移植瘤缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达的影响.方法 噻唑蓝(MTT)法及流式细胞术(FCM)检测结肠癌sw480细胞、转染携带绿色荧光蛋白表达质粒的pEGFP-sw480细胞、转染携带hIL-18基因表达质粒(pE...     

多药耐药真核表达载体的构建及其生物学特性

目的 构建携带多药耐药相关蛋白（MRP）全长基因的真核表达载体，并研究其在人肝癌细胞株HepG2中的表达特性。方法 双酶切克隆质粒pGEM-mrp1，获得含mrp1全长的cDNA片段，再将此片段定向克隆到哺乳动物真核表达载体pCI-neo的多克隆位点，经脂质体法转染HepG2细胞，G418筛选获得稳定表达的转基因细胞系HepG2／mrp1。RT—PCR检测HepG2／mrp1细胞mrp1 mRNA表达，流式细胞仪检测HepG2／mrp1细胞MRP的含量。结果 本实验所构建的携带mrp1全长基因的表达载体pCI-mrp1能在HepG2细胞中表达，形成稳定的多药耐药细胞系HepG2／mrp1，其多药耐药性、MRP含量及mrp1mRNA表达均较未转染该载体的HepG2细胞显著增加。结论 将携带全长人多药耐药相关蛋白基因mrp1的载体导人人肝癌细胞株能够建立高效、稳定的多药耐药细胞株，为进一步研究多药耐药的机理及逆转多药耐药提供理想的细胞模型。     

稳定表达线粒体融合素基因2肝癌细胞株的建立及其意义

目的探讨将线粒体融合素基因2（mfn2）转染培养人肝癌细胞株HepG2，建立长期表达mfn2的肝癌细胞模型的可行性。方法基因重组构建mfn2真核表达质粒pEGFPnffn2，用脂质体将质粒转染培养人肝癌细胞株HepG2，经G418筛选阳性细胞克隆，逆转录-聚合酶链反应检测转染后30d细胞mfn2 mRNA的表达水平；Western—blot检测线粒体融合蛋白的表达。结果（1）成功构建表达真核质粒pEGFPmfn2；（2）成功将质粒pEGFPmfn2转染肝癌细胞株HepG2，并获得阳性细胞克隆；（3）经脂质体转染的人肝癌细胞株HepG2可较稳定表达mfn2。结论成功地建立稳定表达mfn2的肝癌细胞株，为进一步研究mfn2在肝癌发生发展中的作用奠定了基础。     

针对前列腺癌HIF—1α的2种pSUPER RNAi焦统的构建及鉴定

目的构建2种抑制HIF—1α的siRNA表达载体。方法根据GenBank中HIF—1α序列信息并结合2种pSUPER载体的共同的酶切位点结构,化学合成2对编码短发夹RNA序列的靶向HIF-1α基因的寡核苷酸链,各60个碱基、退火、克隆到经BglⅠ、HindⅢ双酶切的2种pSUPER载体上,获得的2种重组RNAi质粒转化感受态大肠杆菌,挑选阳性克隆,抽取重组质粒,EcoRⅠ、HindⅢ双酶切电泳、测序鉴定,培养前列腺癌PC-3细胞通过Western blot检测2种重组RNAi载体干扰效果。结果将重组构建的2种pSUPER质粒经双酶切电泳分析及插入基因片段进行序列分析,目的基因片段成功插入到设计位点,并且序列完全一致。2种重组质粒可显著降低前列腺癌PC-3细胞蛋白的表达。结论2种重组RNAi载体的成功构建,为进一步研究HIF—1α在前列腺癌发病机理及增殖、转移中的功能奠定了基础,同时可以用于其在其他肿瘤的功能研究。