融合蛋白AML1-ETO对C/EBPα基因表达的影

背景:已有研究显示AML1-ETO可以通过包括抑制C/EBPα的功能在内的机制引起分化的阻滞.目的:观察AML1-ETO对髓系分化相关基因C/EBPα表达的影响,探讨其在白血病发生中的作用.方法:应用流式细胞术检测急性单核细胞白血病细胞株U937、U937-MOCK和U937-A/E1细胞表面抗原CD11b、CD14 的表达;荧光实时定量PCR检测C/EBPα mRNA的表达;免疫印迹法检测C/EBPα蛋白的表达;染色质免疫沉淀技术研究转染细胞中AML1-ETO与C/EBPα基因启动子之间直接的相互作用情况.结果与结论:AML1-ETO转染细胞的细胞表面分化抗原CD11b 和CD14的表达明显下降,且转染了AML1-ETO的U937细胞系中,C/EBPα的mRNA与蛋白水平均下调,转染细胞沉淀富集的DNA中含有C/EBPα基因的启动子序列.结果提示C/EBPα是AML1-ETO 的直接靶基因,AML1-ETO能下调C/EBPα的表达.     

融合蛋白AML1-ETO对C/EBPα基因表达的影响

背景：已有研究显示AML1-ETO可以通过包括抑制C/EBPα的功能在内的机制引起分化的阻滞。目的：观察AML1-ETO对髓系分化相关基因C/EBPα表达的影响,探讨其在白血病发生中的作用。方法：应用流式细胞术检测急性单核细胞白血病细胞株U937、U937-MOCK和U937-A/E1细胞表面抗原CD11b、CD14的表达;荧光实时定量PCR检测C/EBPαmRNA的表达;免疫印迹法检测C/EBPα蛋白的表达;染色质免疫沉淀技术研究转染细胞中AML1-ETO与C/EBPα基因启动子之间直接的相互作用情况。结果与结论：AML1-ETO转染细胞的细胞表面分化抗原CD11b和CD14的表达明显下降,且转染了AML1-ETO的U937细胞系中,C/EBPα的mRNA与蛋白水平均下调,转染细胞沉淀富集的DNA中含有C/EBPα基因的启动子序列。结果提示C/EBPα是AML1-ETO的直接靶基因,AML1-ETO能下调C/EBPα的表达。     

AML1-ETO融合蛋白对BCL-2基因表达的影响

本研究旨在观察AML1-ETO在白血病细胞中对于抗凋亡基因日乳-2表达的影响,探讨其在白血病发生中的作用。应用流式细胞术检测急性单核细胞白血病细胞株U937-WT、U937-Mock和经AML1-ETO基因转染的U937-A／E1-4的细胞凋亡率;使用免疫印迹法检测cleavedcaspase-3蛋白的表达;荧光实时定量PCR检测转染细胞和对照组细胞以及AMLM2患者白血病细胞BCL-2mRNA的表达;染色质免疫沉淀技术研究转染细胞中AML1-ETO与BCL-2基因启动子之间直接的相互作用情况。结果表明：AML1-ETO转染细胞的凋亡率明显增加,且检测到cleavedcaspase-3蛋白的表达;转染了AML1—ETO 的U937细胞系和具有AML1—ETO融合基因的AML-M2患者中,BCL-2的mRNA表达水平显著下调;转染细胞沉淀富集的AML1-ETO直接结合的DNA中含有BCL-2基因的启动子序列。结论：BCL-2是AML-ETO的直接靶基因,AML1-ETO能下调BCL-2的表达。     

AML1-ETO融合蛋白对p14~(ARF)基因转录调控的影响

目的:探讨异常转录因子AML1-ETO融合蛋白对p14~(ARF)的转录调控机制。方法:应用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测转染细胞和对照组细胞以及AML-M2患者白血病细胞p14~(ARF)mRNA的表达;用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)对其p14~(ARF)启动子的甲基化状态进行分析;染色质免疫沉淀技术(Ch IP)研究转染细胞中AML1-ETO与p14~(ARF)启动子之间直接的相互作用情况;应用qRT-PCR检测5-氮杂胞苷(5-Aza)处理后细胞内p14~(ARF) mRNA表达水平。结果:转染了AML1-ETO的U937细胞系和具有AML1-ETO融合基因的AM L-M2患者中,p14~(ARF)的mRNA表达水平下调;p14~(ARF)启动子在对照组细胞株和无AML1-ETO融合基因的AML-M2患者中处于非甲基化状态,在转染细胞株和具有AML1-ETO融合基因的AML-M2患者中处于高甲基化状态;转染细胞沉淀富集的DNA中含有p14~(ARF)的启动子序列;5-Aza能上调p14~(ARF)mRNA的表达。结论:p14~(ARF)是AML1-ETO融合蛋白可能的靶基因,p14~(ARF)启动子高甲基化所致的基因沉默可能是M2b型白血病发生发展的一个重要因素。     

AML1-ETO 真核表达载体的构建及对 U937细胞增殖和分化的影响

目的 构建pcDNA3.1-AML1-ETO真核表达载体,并观察AML1-ETO融合蛋白在U937细胞内的表达并检测其对细胞增殖与分化的影响.方法 以原核表达载体pCMV5-AML1-ETO为模板扩增AML1-ETO目的 片段,将该基因重组于pcDNA3.1/V5-His-TOPO真核表达载体上,用脂质体转染技术将其导入 U937细胞,经G418筛选获得稳定转染的克隆,PCR检测AML1-ETO基因的整合,RT-PCR及 Western blot检测AML1-ETO mRNA和蛋白的表达,用锥虫蓝拒染人工计数法观察细胞增殖活性,流式细胞术检测髓系分化抗原表达的变化,瑞特染色法观察细胞形态改变.结果 pcDNA3.1-AML1-ETO经酶切鉴定及DNA测序证实序列完全正确,筛选出AML1-ETO基因高表达的亚克隆,证实AML1-ETO基因稳定转染到U937细胞中并得到表达;转染细胞增殖受抑(P<0.05),髓系分化抗原CD11b表达阳性率[(4.17±0.31)%]低于转染空载体和未转染对照组[(11.40±0.17)%、(11.03±0.15)%](P<0.001),形态呈低分化表现.转染细胞经TPA处理后,CD11b表达无明显变化(P>0.05).结论 成功构建pcDNA3.1-AML1-ETO表达载体,并在真核细胞中得到了正确表达,AML1-ETO 基因能抑制U937细胞的增殖与分化,为进一步研究该基因致白血病的机制奠定了基础.

Abstract：

Objective To construct a pcDNA3. 1 -AML1-ETO expression vector and investigate its effects on proliferation and differentiation of U937 leukemic cells. Methods AML1 -ETO gene was amplified by PCR from pCMV5-AML1-ETO and inserted into eukaryotic expression plasmid pcDNA3. 1/V5-His-TOPO. The recombinant plasmid was transfected into U937 cells by Lipofectamin 2000. Individual clones selected with G418 were isolated. The integration and the expression levels of AML1-ETO in transfectants were determined by PCR, RT-PCR and Western blot analysis respectively. Trypan blue refusal staining method was used to detect the proliferation of U937 cells. Light microscope was applied to observe the morphologic changes of the cell. The expression of myeloid cell differentiation antigen was detected using flow cytometry. Results The recombinant pcDNA3. 1-AML1-ETO was confirmed by enzyme digestion and sequencing. The highly expressing AML1-ETO subclone was established. AML1-ETO was expressed in U937 cells transfected with pcDNA3.1 -AML1-ETO. The growth of the monoclonal cells was inhibited evidently (P < 0. 05). The expression of CD11b in transfected group [(4. 17±0. 31)%] was lower than that in empty plasmid transfected group and non-transfected group [(11.40 ± 0. 17)% and (11.03 ± 0. 15) %] respectively (P < 0.001). Transfected cells displayed morphology of less differentiation. The expression level of CD11b was unchanged in transfected cells treated with TPA (P > 0. 05). Conclusion The eukaryotic expression vector for AML1ETO gene was successfully constructed and expressed in U937. AML1-ETO inhibits the proliferation and differentiation of transfected cells. It provides the basis for further study of mechanisms of AML1 -ETO in leukemogenesis.     

全反式维A酸诱导U937细胞分化的研究

目的:探讨全反式维A酸(all-trans retinoic acid,ATRA)诱导U937细胞分化的可能机制。方法:以急性单核细胞性白血病细胞株U937细胞为体外模型,以细胞表面分化抗原CD11b、四唑氮蓝(nitro-blue tetrazolium,NBT)还原实验和形态学观察,评估细胞分化。应用蛋白印迹法,检测ATRA对C/EBPβ、C/EBPε和PU.1蛋白表达水平的影响。结果:MEK特异性抑制剂U0126预处理不影响ATRA诱导U937细胞分化。蛋白印迹检测显示,ATRA可提高PU.1、C/EBPβ和C/EBPε蛋白水平。结论 :ATRA诱导U937细胞分化可能与PU.1、C/EBPβ、C/EBPε的蛋白表达调控相关,而并不涉及MEK-ERK信号转导途径。     

急性髓系白血病中TRIM58基因表达与其启动子甲基化水平的关系

目的：分析急性髓系白血病（AML）中三基序蛋白58(tripartite-motif protein 58,TRIM58)基因启动子甲基化水平与其mRNA表达的关系,探讨TRIM58基因在AML中的表达调控。方法：分别用亚硫酸氢盐修饰后PCR、实时荧光定量PCR技术检测原代CD34+和CD34-AML细胞以及白血病细胞株KG1a、K562中TRIM58基因启动子甲基化状态和TRIM58mRNA表达情况。结果：AML患者CD34+细胞TRIM58基因mRNA表达下调10例,CD34-细胞TRIM58基因mRNA表达下调12例,TRIM58基因启动子甲基化水平与正常对照比较存在统计学差异（P<0.05）;KG1a及K562细胞株中TRIM58mRNA表达下调,经地西他滨处理后TRIM58mRNA表达上调。结论：AML细胞中TRIM58mRNA表达下调,可能与其启动子甲基化状态具有相关性。     

全反式维甲酸诱导NB4和HL-60细胞分化过程中髓系分化相关的转录因子表达变化

造血干细胞的自我更新、增殖、分化与成熟过程与转录因子调节密切相关.转录因子功能失调可能导致急性髓系白血病的发生.为研究急性髓系白血病细胞体外分化过程中转录因子表达变化,采用全反式维甲酸诱导NB4和HL-60细胞分化模型,瑞氏-姬姆沙染色现察细胞形态,流式细胞术检测细胞表面标志CD11b的表达,定量RT-PCR检测转录因子PU.1,C/EBPα,ε,γ,GATA-1,GATA-2 mRNA的表达水平,用2(-△△CT)法对转录因子mRNA表达水平进行相对定量分析,并与对照组比较.结果表明:ATRA作用NB4细胞96小时,PU.1,C/EBPe mRNA表达水平显著上调,分别达到处理前的5.75倍和6.16倍;而C/EBPα,γ,GATA-1,GATA-2的mRNA表达水平均显著下调,仅为处理前的62%,31%,63%,8.7%,尤以GATA-2的表达水平下降最为显著.在HL-60细胞,ATRA作用96小时,PU.1,C/EBPα,ε的mRNA表达水平上调,分别为处理前1.97,1.95,2.35倍,而C/EBPγ,GATA-1,GATA-2的mRNA表达水平均显著下调,仅为处理前的20%,21%,18%.结论:转录因子异常表达在急性髓系白血病的发病中起重要作用.     

诱骗RNA靶向阻断RNA结合蛋白E2诱导K562细胞向粒系分化

目的 应用诱骗RNA(decoy RNA)靶向阻断RNA结合蛋白E2(hnRNP E2)调节CCAAT增强子结合蛋白(C/EBPα)基因异常翻译的作用,诱导白血病细胞株K562细胞向粒系分化,并初步探讨其分子机制.方法 将已构建的hnRNP E2 decoy RNA表达质粒经阳离子脂质体的介导转染K562细胞,用G418筛选出稳定表达细胞株,用RT-PCR和Western blot方法检测该细胞株C/EBPα和粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)的表达,通过瑞特-姬姆萨染色观察细胞形态,免疫细胞化学法分析细胞粒系分化抗原CD13、CD15的表达.结果 筛选到稳定表达细胞株pG细胞,与未转染的K562细胞相比,其C/EBPα mRNA水平无改变,但相对分子质量42×103的C/EBPα蛋白(42kD-C/EBPα)水平升高了(49.7±5.5)%(P＜0.05);G-CSFR mRNA水平升高了(42.1±3.6)%(P＜0.05),其蛋白水半也.升高了(37.4±6.2)%(P＜0.05);细胞形态学方面观察到pG细胞出现中、晚幼粒细胞甚至成熟粒细胞的特征,且免疫细胞化学法检测显示粒系分化抗原CD13、CD15表达增高[阳性细胞百分比分别为(18.7±2.5)%和(15.2±2.6)%].结论 hnRNP E2 decoy RNA能够诱导K562细胞向粒系分化,G-CSF对其分化过程有促进作用,其作用机制可能与decoy RNA靶向阻断hnRNP E2,调节C/EBPαmRNA翻译,恢复42kD-C/EBPα表达,上调42kD-C/EBPα下游分化基因G-CSFR的表达有关.     

AML1、AML1-ETO对nucb2基因转录调控活性的影响

本研究旨在探讨造血特异转录因子AML1及M2b型急性髓系白血病（AML-M2b）累及的异常融合蛋白AML1-ETO对凋亡相关基因nucb2（nucleobindin-2）启动子转录活性的影响,探索AML1-ETO对AML—M2h型白血病的分子致病机制。利用实时RT-PCR方法在AML1-ETO诱导型白血病细胞株中研究AML1-ETO在转录水平对于nucb2的调控情况;利用ChIP—qPCR方法在AML1-ETO阳性白血病细胞株中研究AML1、AML1-ETO与nucb2基因启动子之间直接的体内相互作用情况;采用双荧光素酶报告基因检测方法,研究AML1、AML1-ETO对nucb2启动子转录活性的调节作用。结果表明：AML1-ETO的表达与nucb2的表达呈负相关;nucb2可能是AML1、AML1-ETO的靶基因;AML1、AMLI—ETO皆对nucb2启动子具有转录抑制作用,且AML1-ETO对nucb2抑制更强。结论：nucb2是AML1、AML1-ETO的直接靶基因,AML1、AML1-ETO通过抑制nucb2启动子的活性对其进行转录调控。     

核糖体蛋白RPL36A siRNA对U937细胞的促增殖、抑凋亡作用

本研究探讨RPL36A基因在急性髓系白血病(AML)病人的表达情况及可能的作用机制。应用RT-PCR检测急性髓系白血病细胞、正常人单个核细胞、U937细胞中RPL36A基因的表达情况;RPL36A siRNA经脂质体介导转入U937细胞,采用MTT法及DNA倍体分析检测细胞增殖,AO/EB、TUNEL、Annexin V/FITV检测细胞凋亡,RT-PCR和Western blot检测RPL36A基因及蛋白表达水平的变化。结果表明:RPL36A在初治AML细胞和U937细胞中表达明显增高;MTT法及DNA倍体分析发现,U937细胞增殖受到抑制,细胞周期阻滞;AO/EB染色、TUNEL、Annexin V/FITV检测显示,转染RPL36A siRNA的细胞组凋亡率高于对照组;RPL36A siRNA作用可引起U937细胞的RPL36A的mRNA水平的降低和蛋白表达量的下降,且呈时间依赖性(r分别为0.9813和0.9537)。结论:AML细胞高表达RPL36A基因,RPL36A基因的高表达可能促进AML细胞的过度增殖并抑制其凋亡。     

C/EBPα转录因子与急性髓系白血病

转录因子C/EBPα调控髓系细胞的正常分化和增殖,体内实验证实C/EBPα功能的丢失将阻断髓系细胞的正常分化,并向急性髓系白血病(AML)的恶性细胞转化.在AML患者中发现C/EBPα功能下调与病变的发展之间有直接的关系.自2001年以来,对于转录因子C/EBPα与AML的发病、发展及预后等的研究已深入到一定程度,我们就近年来的相关研究进行综述.     

shRNA干扰CIAPIN1基因表达促进K562细胞粒系分化

目的探讨靶向干扰CIAPIN1基因表达对慢性粒细胞白血病（CML）细胞系K562粒系分化的影响。方法针对CIAPIN1基因设计并构建短发卡RNA（shRNA）真核表达载体,转染K562细胞并作为干扰组,以无关序列shRNA处理的K562细胞作为对照组。采用Real-time PCR及Western blot技术鉴定干扰效率;采用瑞氏染色和电镜分别观测K562细胞形态学和超微结构的改变;采用Real-time PCR方法检测粒系分化标志基因中性粒细胞胞浆因子1（NCF1）、血清黏蛋白1（ORM1）以及粒系分化转录因子CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBPα）、低氧诱导因子1α（HIF1α）mRNA水平的改变;流式细胞术检测K562细胞表面分化抗原CD11b表达的改变;Western blot技术检测ERK1/2、JNK、p38MAPK及Akt磷酸化水平的改变。结果与对照组相比,干扰组的CIAPIN1基因表达被有效抑制（P〈0.05）;K562细胞的形态和超微结构趋向成熟粒细胞阶段;NCF1、ORM1、C/EBPα及HIF1αmRNA表达水平升高（P〈0.05）;CD11b表达升高（P〈0.01）;ERK1/2磷酸化水平升高（P〈0.05）,而JNK、p38MAPK及Akt磷酸化水平未见明显改变。结论抑制CIAPIN1基因表达能促进K562细胞向成熟的粒细胞阶段分化,ERK1/2磷酸化水平的升高可能参与了该分化过程。     

急性髓系白血病患者hPer3基因启动子甲基化状态及其去甲基化对白血病细胞增殖的影响

目的 探讨急性髓系白血病(AML)患者hPer3基因启动子甲基化检测的临床意义,并观察地西他滨(DCA)诱导hPer3基冈表达对AML细胞系HL-60和U937增殖的影响.方法 应用甲基化聚合酶链反应(MS-PCR)和实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测206例AML患者骨髓细胞hPer3基因启动子甲基化状态和mRNA表达,以40例缺铁性贫血患者骨髓细胞作为对照.用不同浓度的DCA处理HL-60和U937细胞48和72 h,检测其hPer3基因启动子甲基化状态及其mRNA表达,用MTT法检测细胞增殖抑制率,Annexin V-FITC/PI标记法检测细胞凋亡,用流式细胞术检测CD14、CD11b抗原表达.结果 AML患者初发组、部分缓解组、完全缓解组、复发组中,hPer3基因启动子甲基化阳性率分别为93.65%(63例中59例)、54.39%(57例中31例)、24.66%(73例中18例)、61.54%(13例中8例),对照组无一例甲基化;hPer3 mRNA表达分别为0.19±0.08、6.28±2.11、52.76±14.17、8.18±4.36,明显低于对照组(75.03±18.16),除部分缓解组与复发组相比差异无统计学意义(P>0.05)外,其余组别两两比较差异均有统计学意义(P<0.01).DCA处理HL-60和U937细胞后,hPer3基因启动子甲基化水平降低,mRNA表达升高,细胞出现凋亡,CD14和CD11b表达升高,并呈剂量和时间依赖性.结论 AML患者骨髓细胞hPer3基因启动子甲基化状态和mRNA表达水平可能作为AML患者病情缓解程度的一个评价指标.体外应用DCA有助于诱导hPer3基因表达和促AML细胞凋亡.

Abstract：

Objective To investigate the clinical significance of promoter methylation status of hPer3 gene in acute myeloid leukemia( AML) patients and the in vitro effect of decitabine( DCA) on AML cell lines HL-60 and U937. Methods The promoter methylation status of hPer3 gene and mRNA expression levels in bone marrow of 206 AML and 40 iron deficiency anemia( IDA) patients ( as control) were detected by methylation specific PCR(MS-PCR) and real-time PCR(RT-PCR). The HL-60 and U937 cell lines were treated with different concertrations of DCA for 48 and 72 h. The inhibition rates of cell proliferation were detected by methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) ;the early apoptosis rates by staining with Annexin V and PI; the CD14 and CD11b expressions by flow cytometry( FCM) ; the promoter methylation status of hPer3 gene by MS-PCR;and the hPer3 mRNA expressions levels by RT-PCR. Results The promoter methylation rates of hPer3 in newly diagnosed( ND) group, partial remission ( PR) group, complete remission ( CR ) group, relapse (R)group and control group were 93.65% (59/63) ,54. 39% (31/57) ,24. 66% (18/73) ,61. 54% (8/13) and 0% (0/40), and the hPer3 mRNA expression levels were 0. 19 ±0.08,6.28 ±2. 11,52.76 ± 14.17,8. 18 ±4.36,75.03 ±18. 16, respeatively. There was a significant statistic difference between any two group (P <0.01) excepting for between PR and R group(P>0.05). After DCA treatment,the promoter hypermethylation status of hPer3 was reduced and the mRNA and CD14,CD11b expression levels were up regulated in a dose dependent manner with an induction of cell apoptosis. Conclusions Promoter methylation status and mRNA expression of hPer3 gene may be indicators for evaluating AML. DCA can induce the expression of hPer3 gene and cells apoptosis in AML.     

miR-328通过C/EBPα表达上调抑制K562细胞增殖

目的:本研究旨在探讨miR-328(microRNA-328)对慢性髓系白血病(CML)急变期细胞株K562增殖的影响及C/EBPα的介导作用。方法:构建miR-328靶向基因及抑制基因的真核表达载体hsa-miR-328及hsa-miR-328-inhibitor,并分别通过脂质体lipofectamineTM2000介导转染至K562细胞;通过荧光显微镜观察细胞转染情况;通过实时荧光定量RT-PCR检测miR-328、C/EBP mRNA的表达水平;Western-Blot方法测定C/EBPα蛋白的表达;CCK-8检测细胞增殖的情况。结果:本研究通过成功构建重组真核表达载体hsa-miR-328、hsa-miR-328-inhibitor;将载体转染K562细胞,24 h后在荧光显微镜下可见荧光细胞,表明载体成功转入K562细胞,48 h和72 h后可见荧光细胞数逐渐增多。实时荧光定量RT-PCR证实miR-328在K562细胞中成功表达,而miR-328对细胞C/EBPαmRNA表达无明显影响;通过Western blot检测发现miR-328恢复C/EBPα蛋白表达;细胞活力检测提示miR-328抑制K562细胞的增殖。结论:成功构建并转染miR-328基因至K562细胞,miR-328通过恢复C/EBPα的表达抑制K562细胞的增殖。     

CEBPA基因突变和表达异常在急性髓系白血病中的作用研究

CCAAT增强子结合蛋白A(CEBPA)基因及其编码的转录因子CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)通过促进造血干/祖细胞向粒系分化并抑制细胞增殖,在造血系统早期分化过程中起重要作用。CEBPA基因的突变及其在转录、翻译及翻译后水平受到的异常调控可引起C/EBPα蛋白结构或表达异常,导致粒系分化成熟障碍、不成熟粒系前体细胞异常增殖,是急性髓性白血病(AML)的重要发病机制。CEBPA基因突变和表达异常调节对AML患者的预后有重要影响,并可作为诱导分化治疗的靶点。本文就CEBPA基因突变与AML、C/EBPα蛋白表达调控异常与AML及C/EBPα蛋白与靶向治疗进行综述。     

靶向AATF基因shRNA表达载体的构建及其稳定表达的白血病U937细胞系的建立

本研究旨在构建靶向AATF基因的短发夹RNA（shRNA）真核表达载体,获得干扰质粒稳定转染的人白血病U937细胞系。根据GenBank数据库提供的AATF mRNA序列,以228～249、303～324、443～464位序列作为RNA干扰位点,排除同源可能,合成3对互补并编码mRNA基因的特异性shRNA序列的寡核苷酸,克隆至经BamHⅠ、HindⅢ双酶切线性化的pSilencer 3.1人H1启动子干扰载体中,利用测序鉴定所构建的重组载体是否正确,经电穿孔将3个重组载体（pSA-1、pSA-2、pSA-3）转染人白血病U937细胞系,G418（500 mg/L）有限稀释法持续筛选8周后,扩增获得稳定表达的细胞系;RT-PCR、Western blot分别检测稳定转染细胞系的AATF mRNA和AATF蛋白表达。结果表明,AATF干扰序列及读码框完全正确。稳定转染细胞AATF mRNA表达下调,AATF蛋白表达量下降（P〈0.05）。结论：成功地构建AATF shRNA真核表达载体及AATF表达稳定抑制的白血病U937细胞系,为以AATF基因为靶点的人白血病进一步研究奠定了实验基础。     

六亚甲基二乙酰胺对急性白血病细胞株HL-60和U937分化、凋亡的影响及其机制

目的　研究六亚甲基二乙酰胺 (HMBA)体外诱导HL 6 0和U937细胞分化、凋亡的作用及其机制。方法　流式细胞仪检测细胞分化抗原CD1 1b、CD1 4,细胞凋亡标记Annexin Ⅴ以及进行细胞周期分布和细胞内cyclinD、cyclinE、p2 7抗原的分析 ,RT PCR检测c myc、Rb、Bcl 2基因mRNA的表达。结果　HL 6 0、U937细胞经HMBA处理 72h后CD1 1b表达显著增高 ,高剂量HMBA促使Annexin Ⅴ表达增加。HMBA阻滞HL 6 0、U937细胞于G0 G1 期 ,并使该两种细胞内cyclinE表达显著下降 ,cyclinD、p2 7表达显著增高 ,呈剂量依赖关系 ;HMBA可使HL 6 0、U937细胞c myc、Bcl 2mRNA表达下调 ,而RbmRNA在HL 6 0细胞表达上调 ,在U937细胞则无显著改变。结论　HMBA能诱导HL 6 0、U937细胞出现明显的分化 ,高剂量的HMBA有促使HL 6 0、U937细胞凋亡的倾向 ,其机制可能是通过影响细胞周期调控分子以及有关的增殖分化相关基因的表达 ,从而抑制细胞增殖 ,促进细胞分化。     

低氧诱导因子抑制剂对白血病细胞株HIF-1α和VEGF表达及诱导细胞凋亡作用的研究

本研究探讨低氧诱导因子抑制剂3-(5′-hydroxymethyl-2′-furyl)-1-benzylindazole(YC-1)对人急性白血病病细胞低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor1α,HIF-1α)和血管内皮因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的调节及诱导细胞凋亡作用。应用DAPI染色检查凋亡细胞的形态;流式细胞术检测细胞凋亡率;RT-PCR检测K562、U937、Jurkat白血病细胞株hif-1α和vegf mRNA表达以及YC-1对U937细胞hif-1α、vegf mRNA表达影响;Western blot检测YC-1对U937细胞HIF-1α和VEGF蛋白表达,以及BAX、BCL-2、caspase-3蛋白变化,分析YC-1诱导U937细胞凋亡的可能机制。结果表明:在3种白血病细胞株均可见hif-1α和vegf mRNA表达。4μmol/L YC-1处理U937细胞(0、8、16和24小时)后,可见凋亡细胞出现的典型凋亡形态特征;流式细胞术检测的细胞0、8、16和24小时凋亡率分别为(4.87±0.70)%、(27.27±2.00)%、(51.53±2.81)%及(60.5±3.20)%;vegf mRNA表达下调,而hif-1αmRNA表达无明显变化;HIF-1α蛋白、VEGF蛋白和BCL-2蛋白表达下调,而BAX和caspase-3蛋白表达上调,BAX/BCL-2比率升高并呈时间依赖性(r=0.973,p0.01)。结论:3种白血病细胞株均显示hif-1α和vegf mRNA表达,YC-1可以抑制白血病细胞HIF-1α蛋白表达,进而下调VEGF,并通过上调BAX/BCL-2比率、caspase-3蛋白表达诱导细胞凋亡。     

尿激酶受体基因反义RNA转移体系的建立及其在白血病研究中的应用

尿激酶受体 (uPAR)表达与肿瘤 /白血病细胞的侵袭与转移能力明显相关。为探讨逆转录病毒载体介导的uPAR基因反义RNA转移体系在抑制白血病细胞表达uPAR中的价值 ,构建了表达反义uPAR基因的逆转录病毒载体LaCD87SN ,用脂质体转染 交互感染策略建立uPAR基因反义RNA转移体系 ,并以双嗜型aCD87病毒转导U937白血病细胞 ;用PCR分析反义uPAR基因的整合和表达 ;用流式细胞术和明胶酶谱分别检测白血病细胞CD87表达和基质金属蛋白酶 (MMP)活性。结果显示 :通过转染 交互感染获得上清中病毒滴度为 6 .3× 10 5cfu/ml的双嗜型病毒产生细胞Am12 /aCD87;aCD87病毒感染的U937/aCD87细胞内存在aCD87原病毒的整合 ,并高水平表达uPAR基因反义RNA。此外 ,与载体对照的U937/NeoR细胞相比 ,U937/aCD87细胞表面CD87分子表达并无明显降低 ,但其分泌MMP 9的能力显著下降。结论 :逆转录病毒载体介导的反义RNA转移不能有效地下调白血病细胞表面uPAR表达 ,但可能干扰CD87分子与MMP的相互作用。