雷公藤MCT基因的全长克隆与表达分析

根据雷公藤转录组数据提供的基因片段设计特异引物,采用全长PCR方法克隆TwMCT全长cDNA,分析序列同源性,预测TwMCT蛋白结构,并进行序列多重比对和构建系统进化树分析;采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR),以actin为内参,分析雷公藤悬浮细胞受茉莉酸甲酯(MeJA)诱导后0~72 h TwMCT基因的相对表达量。克隆得到全长1318 bp TwMCT全长cDNA,具有完整编码框,编码311个氨基酸,蛋白相对分子质量为34.14 kDa,理论等电点为8.65;RT-qPCR结果表明该基因受MeJA诱导后表达逐渐上升,在24 h时达到最高值。克隆雷公藤TwMCT全长cDNA和分析表达特性,为进一步研究该基因的功能和雷公藤次生代谢调控提供了基因元件。     

雷公藤4-(5'-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶基因的全长克隆与表达分析

4-(5-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶[4-(cytidine-5-diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol kinase, CMK]是雷公藤甲素等萜类成分生物合成途径上关键酶之一。根据获得的雷公藤转录组数据中TwCMK片段设计特异性引物,采用全长PCR方法克隆TwCMK全长cDNA,并进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测茉莉酸甲酯(MeJA)诱导雷公藤悬浮细胞后0~72 h TwCMK基因的表达水平。结果表明,TwCMK全长cDNA由1732个核苷酸组成,具有完整的开放阅读框,共编码387个氨基酸,蛋白相对分子质量为42.85 kDa,理论等电点为5.79;TwCMK基因受MeJA诱导后表达逐渐上升,在24 h时达到最高值。为进一步研究雷公藤甲素等萜类成分次生代谢调控和生物合成奠定了基础。     

腊梅葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH1)基因的克隆及表达分析

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是磷酸戊糖途径中的关键限速酶。研究根据已经报道的G6PDH基因的保守序列引物扩增腊梅花中G6PDH基因的核心序列,利用RACE技术从腊梅中首次克隆得到一个G6PDH基因cDNA全长,命名为G6PDH1,并对G6PDH1蛋白质进行细胞定位预测、跨膜结构分析、三维结构模拟及聚类分析,预测G6PDH1的生物学信息;利用实时荧光定量PCR检测G6PDH1在腊梅不同组织中和冷处理条件下的表达差异分析。该研究中克隆获得的G6PDH1基因的全长为2011 bp,开放阅读框1551 bp,编码516个氨基酸。组织表达分析的结果显示,G6PDH1基因主要在花和根中表达,在叶和茎中表达量较低。通过冷处理,该基因在12 h时达到最高表达水平。研究通过对腊梅花中G6PDH1基因全长cDNA克隆和表达特异性分析,为以后深入研究腊梅的抗寒机制奠定了基础。     

雷公藤4α-甲基氧化酶基因(TwSMO1)的cDNA全长克隆及表达分析

目的:克隆得到雷公藤一型4α-甲基氧化酶(Tw SMO1)(Gen Bank KX987126)全长基因,并对其进行序列分析及初步的功能验证。方法:根据雷公藤转录组数据,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆得到雷公藤4α-甲基氧化酶基因(TwSMO1),并利用相关软件对所得核酸序列及其所编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。用茉莉酸甲酯(MeJA)诱导雷公藤悬浮细胞,用实时荧光定量(RT-PCR)的方法分析诱导不同时间点后雷公藤悬浮细胞中的TwSMO1基因的相对表达量。结果:克隆所得的TwSMO1基因cDNA全长1505 bp,开放阅读框900 bp,编码299个氨基酸,在线预测其所编码蛋白分子量为34.55 k Da,理论等电点为6.89。多重序列比对结果显示其与其他物种的SMO1氨基酸序列有较高同源性,且包含SMO1基因家族的3个保守域,系统进化树将其归为4α-甲基氧化酶第一家族基因,遂将其命名为TwSMO1。RT-PCR结果表明MeJA诱导后TwSMO1基因在1 h后表达量达到最高,约是对照组的450倍。结论:本研究首次克隆得到雷公藤TwSMO1基因,并对其进行生物信息学分析及MeJA诱导表达分析,为深入研究此基因功能及阐述雷公藤甾醇生物合成途径奠定基础。     

铁皮石斛丙酮酸激酶基因的克隆与表达分析

目的 克隆珍稀濒危药用植物铁皮石斛丙酮酸激酶（pyruvate kinase,PK）基因（DoPK）,并进行生物信息学分析以及检测基因在不同器官中的表达情况。方法 采用RACE技术获得基因的全长cDNA;利用生物信息学软件预测蛋白的理化性质、结构域及亚细胞定位等分子特性;用DNASTAR 6.0和MEGA 4.0分别进行氨基酸多序列比对和进化关系分析;借助r实时荧光 (real-time quantitative) PCR (RT-qPCR)分析基因在不同器官中的表达情况。结果 克隆获得DoPK（GenBank注册号KC178572）的cDNA全长1 895 bp,编码一条由511个氨基酸组成的多肽,相对分子质量为55 040,等电点7.00;DoPK基因与江南卷柏、拟南芥、马铃薯和葡萄等植物的PK基因有71%、86%、89%和91%的相似性;DoPK蛋白包含保守的丙酮酸激酶结构域（21～497）和活性位点（235～247）;DoPK属于胞质型的CYTOSOLIC-1亚类,与单子叶植物亲缘关系较近;DoPK基因为组成型表达,其转录本在石斛茎中的相对表达量较高,为叶中的2.29倍,根中次之,为叶中的1.28倍。结论 克隆了胞质型的铁皮石斛DoPK基因的全长cDNA序列,为进一步研究其在铁皮石斛生长发育中的作用奠定基础。     

红花光调控信号途径关键基因CtHY5的克隆及表达分析

目的 以药用植物红花Carthamus tinctorius为研究对象,克隆光信号途径关键转录因子HY5基因,并对其进行生物信息学和表达模式分析,为红花HY5基因的功能研究提供参考。方法 以红花转录数据为参考,设计引物,采用PCR扩增方法从红花中克隆得到HY5的全长cDNA和DNA序列。运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测编码蛋白的结构与功能,并通过荧光定量PCR方法检测CtHY5基因在红花不同组织及花发育不同时期的表达情况。结果 CtHY5基因的cDNA全长为462 bp,编码153个氨基酸,DNA全长为1941 bp,包含4个外显子和3个内含子。生物信息学分析表明,CtHY5为亲水性蛋白,定位于细胞核中。系统进化树及模体结构分析结果表明CtHY5与来自菊科的刺菜蓟、黄花蒿、薇甘菊、向日葵、莴苣中的HY5进化关系较近。定量分析表明,在白色红花和红色红花中,CtHY5基因均在花中表达量最高,其次为茎和苞片,在根中表达量最低。此外,除了根外,CtHY5基因在白色红花各组织中的表达量要明显高于红色红花。结论 首次从红花中克隆得到了光信号途径关键转录因子CtHY5基因,并研究了该基因在不同花色红花品系中的表达模式,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

雷公藤PTEN基因全长克隆及表达分析

目的获得雷公藤Tripterygium wilfordii磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸肌醇3-磷酸酶(Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate 3-phosphatase,PTEN)基因的c DNA全长,并预测其生物学功能。方法根据雷公藤转录组数据设计引物,对雷公藤PTEN(TwPTEN)基因进行全长克隆;通过生物信息学方法对得到的TwPTEN基因进行分析,主要包括多重序列比对,蛋白结构预测和构建进化树分析等。结果根据分析结果 TwPTEN基因全长为2 247 bp,共编码614个氨基酸,等电点为5.84,相对分子质量为66 900,多重序列比对显示其与其他植物的PTEN基因具有较高的同源性。雷公藤悬浮细胞经外源茉莉酸甲酯(Me JA)诱导后,实时荧光定量结果显示,TwPTEN的表达量明显增加,并在12 h达到最高,提示PTEN基因与植物的次生代谢产物的产生有关。结论本研究首次从雷公藤悬浮细胞中克隆得到PTEN基因,为进一步研究TwPTEN基因的功能奠定基础。     

当归4-香豆酸辅酶A连接酶基因克隆与组织表达分析

4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate coenzyme A ligase,4CL)为高等植物苯丙烷代谢途径关键酶之一,在当归阿魏酸的生物合成中起调控作用。研究利用同源克隆结合cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆当归4CL编码基因全长cDNA序列,并用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析4CL基因在当归幼苗生长过程中根、茎、叶组织中的表达特征。结果表明,获得的4CL cDNA序列(在GenBank已注册,登录号为KT880508) 全长1 815 bp,含有1个1 632 bp 的完整开放阅读框(opening reading frame,ORF),编码544个氨基酸的多肽链。4CL基因在当归幼苗不同生长阶段的根、茎、叶组织中均有表达,随着苗龄增大,茎、叶中的相对表达量显著增加(P<0.05),而根中表达量变化不大,表明4CL基因在当归幼苗中的表达具有明显的时空性。该研究为进一步研究4CL基因的结构与功能,解析当归阿魏酸的合成代谢机制和时空调控的分子基础奠定了工作基础。     

蟾蜍TNFRSF11b、TNFRSF9基因克隆及生物信息学分析

目的 克隆中华蟾蜍肿瘤坏死因子受体超家族（TNFRSF）BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因的全长序列,并分析其序列特征。方法 根据转录组测序所得的TNFRSF11b、TNFRSF9基因片段设计特异性引物,以中华蟾蜍蟾皮为材料,利用逆转录聚合酶链式反应（PCR）技术获得BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因全长互补脱氧核糖核酸（cDNA）序列,并采用生物信息学手段分析其序列特征,通过实时荧光定量PCR方法检测BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因在中华蟾蜍7种组织/器官中的表达情况。结果 克隆获得蟾蜍BbgTNFRSF11b基因的全长cDNA序列为1233 bp,编码410个氨基酸,理论相对分子质量为46.97 kDa,等电点为8.64,不存在跨膜区及信号肽,为亲水性蛋白,具有多个磷酸化位点。BbgTNFRSF9基因的全长cDNA序列为829 bp,编码247个氨基酸,理论相对分子质量为67.874 kDa,理论等电点为5.12,存在信号肽,为疏水性蛋白,具有多个磷酸化位点,进化树分析发现BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因与其他动物TNFRSF11b、TNFRSF9基因相似度不高,表明该基因虽有特殊结构域但不同物种间差异较大。组织表达分析显示,BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因在耳后腺中表达显著高于其他部位。结论 成功获得蟾蜍BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因序列,掌握其序列特征,为后续深入研究该蛋白的功能提供参考。     

雷公藤单加氧酶基因全长克隆及表达分析

目的:单加氧酶(Monooxygenase,MO)是一类通过在底物上加一个氧原子的加氧酶,在动植物体内参与多种代谢途径。本实验致力于从雷公藤转录组数据中克隆得到单加氧酶基因c DNA全长,并对克隆得到的MO基因进行初步的功能分析。方法:通过对雷公藤转录组数据中筛选得到MO基因片段设计特异性引物,克隆MO基因c DNA全长,通过生物信息学方法对得到的MO基因进行分析,主要包括多重序列比对,蛋白结构预测和构建进化树分析等。结果:根据分析结果Tw MO基因全长为2 193 bp,共编码507个氨基酸,等电点为8.84,相对分子质量为55.20 k Da,多重序列比对显示它与其他植物的MO基因具有较高的同源性。雷公藤悬浮细胞经外源茉莉酸甲酯(Me JA)诱导后,实时荧光定量结果显示,TwMO的表达量明显增加,并在48 h达到最高,提示Tw MO基因与雷公藤的次生代谢产物的生成有关。结论:本研究首次从雷公藤悬浮细胞中克隆得到MO基因,为进一步研究该基因的功能奠定基础。     

白木香AsNINJA1基因全长cDNA克隆及其在愈伤组织中的茉莉酸甲酯诱导表达

目的 克隆国产沉香基原植物白木香Aquilaria sinensis互作蛋白(jasmonate Zim-domain,JAZ)基因(NINJA),为深入研究其在沉香倍半萜合成途径中的功能奠定基础。方法 以白木香总RNA为模板,采用RACE法和RT-PCR方法,克隆白木香NINJA基因cDNA全长,并进行生物信息学的分析;采用实时荧光定量(qRT-PCR)方法分析经茉莉酸甲酯(MeJA)处理的白木香愈伤组织中AsNINJA1基因的表达模式。结果 获得白木香NINJA基因全长cDNA,命名为AsNINJA1。序列分析表明,该基因的序列全长为1 982 bp,包含一个1 221 bp的开放阅读框,编码406个氨基酸,蛋白质相对分子质量为43 697,等电点为6.02。qRT-PCR结果显示,经MeJA处理4 h后AsNINJA1基因相对表达量最高,是对照(未经MeJA处理的白木香愈伤组织)的近100倍,随后显著下降。结论 获得AsNINJA1基因全长cDNA序列,该基因对MeJA诱导极为敏感,且能在伤害早期响应。     

雷公藤贝壳杉烯酸氧化酶基因的全长cDNA克隆与表达分析

贝壳杉烯酸氧化酶(kaurenoic acid oxidase)是二萜赤霉素生物合成途径上的关键酶,参与植物生长发育等重要生物学过程。该文根据雷公藤转录组数据设计特异性引物,采用PCR技术克隆得到贝壳杉烯酸氧化酶全长c DNA序列,并进行生物信息学分析;使用实时定量PCR(qRT-PCR)研究基因的诱导表达水平。克隆得到Tw KAO长度为1 874 bp,编码487个氨基酸,蛋白相对分子质量56.02 k Da,理论等电点8.89;经茉莉酸甲酯(Me JA)诱导后,Tw KAO基因相对表达量在12 h达到峰值;经植株组织表达分析证实,Tw KAO基因在雷公藤的叶中表达量最高,根中最低。该研究首次克隆得到雷公藤KAO基因,并分析其mRNA表达特征,为深入研究雷公藤生长发育以及萜类活性成分次生代谢研究奠定基础。     

白木香JAZ1基因全长cDNA克隆及其在愈伤组织中的伤害诱导表达分析

目的克隆国产沉香基原植物白木香Aquilaria sinensis茉莉酸(JA)信号途径核心抑制蛋白基因(jasmonate-zim-domain protein,JAZ),为深入研究其在沉香倍半萜合成途径中的功能奠定基础。方法以白木香总RNA为模板,采用RACE法和RT-PCR方法,克隆JAZ基因cDNA全长,并进行生物信息学的分析;采用实时荧光定量(qR T-PCR)方法分析经茉莉酸甲酯(MeJA)和机械伤害处理的白木香愈伤组织中JAZ基因的表达模式。结果获得白木香JAZ基因全长cDNA,命名为AsJAZ1,GenBank登录号为KP677281。序列分析表明,该基因的序列全长为1507 bp,包含一个990 bp的开放阅读框,编码330个氨基酸,蛋白质相对分子质量为34280,等电点为6.89。qRT-PCR结果显示,经MeJA处理0.5 h后AsJAZ1基因相对表达量最高,约是对照组(未经MeJA处理的白木香愈伤组织)的27倍,随后显著下降;经机械处理2h后AsJAZ1基因相对表达量最高,约是对照组(未经机械处理的白木香愈伤组织)的17倍,随后又快速降低,到24h基本恢复正常。结论获得AsJAZ1基因全长cDNA序列,该基因对伤害诱导极敏感,且能在伤害早期响应。     

雷公藤单萜合酶基因TwMS的克隆及蛋白表达分析

该研究克隆得到1条雷公藤单萜合酶基因TwMS。其完整开放阅读框为1797bp,编码579个氨基酸,相对分子质量为69.75kDa、理论等电点为5.37。生物信息学分析表明,TwMS具有单萜合酶的特征结构域,属于萜类合酶TPSb亚家族。实时荧光定量PCR检测显示,经茉莉酸甲酯(MeJA)诱导后,TwMS的相对表达量显著上调,并在24 h达到最高。此外,该研究在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达TwMS蛋白,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

三七多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因的克隆及表达分析

目的克隆三七Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase-inhibiting protein,PGIP)基因(Pn PGIP)的全长c DNA序列,分析该基因的表达特性。方法根据三七中编码PGIP的EST(expressed sequence tag)序列设计引物,采用c DNA末端快速扩增技术克隆Pn PGIP基因的全长c DNA序列;用q RT-PCR分析Pn PGIP基因的表达水平。结果 PnPGIP基因的cDNA全长为1 171 bp,含有981 bp的开放阅读框,13 bp的5’-非翻译区以及177 bp的3’-非翻译区,编码含326个氨基酸的蛋白质,PnPGIP蛋白的相对分子质量约为36 770,等电点约为5.83;q RT-PCR分析结果显示,Pn PGIP基因的表达量分别在三七接种茄腐镰刀菌和人参链格孢后4 h和2 h内迅速上升;此外,信号分子茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,Me JA)、乙烯利(ethylene,ETH)、H2O2、水杨酸(salicylic acid,SA)处理均能不同程度地诱导Pn PGIP基因的表达水平。结论 PnPGIP基因在转录水平响应茄腐镰刀菌和人参链格孢的侵染,并受几种逆境胁迫相关信号分子的诱导,Pn PGIP基因可能参与三七对茄腐镰刀菌和人参链格孢的防卫反应。     

马蓝BcASB基因的克隆、生物信息学及表达分析

目的克隆马蓝邻氨基苯甲酸合成酶(anthranilate synthase,AS)BcASB基因(GenBank登录号QCF61930.1),并对其进行生物信息学分析、时空表达分析以及检测马蓝有效成分靛蓝、靛玉红积累量随时间的变化。方法通过RT-PCR和RACE技术,克隆BcASB基因全长,应用生物信息学的方法对该基因编码的蛋白进行各种理化性质测定,二级结构和三级结构预测分析以及对核苷酸和氨基酸序列进行比对;利用qRT-PCR技术检测BcASB基因在马蓝不同器官(根、茎、叶)中的表达模式以及在外源诱导子茉莉酸甲酯(methyl-jasmonate,MeJA)、脱落酸(abscisic acid,ABA)、水杨酸(salicylic acid,SA)和乙烯利(ethylene,ETH)诱导下的表达情况;同时运用HPLC测定吲哚类生物碱靛蓝、靛玉红含量的变化情况。结果克隆获得BcASB基因,开放阅读框(open reading frame,ORF)长度为765 bp,编码256个氨基酸,生物信息学表明,该蛋白不含信号肽且无跨膜区,亚细胞结构定位于叶绿体;qRT-PCR检测结果表明,BcASB基因在马蓝叶和茎中的表达量较高,在根中表达较低;BcASB基因可响应不同外源诱导处理,而影响其转录;HPLC检测结果显示靛蓝、靛玉红含量有着明显的变化。结论成功克隆马蓝邻氨基苯甲酸合成酶BcASB基因,为进一步阐释该基因在马蓝吲哚类生物碱合成途径的作用及表达调控研究奠定基础。     

菘蓝莽草酸羟基肉桂酸酰转移酶IiHCT基因的克隆和表达分析

根据菘蓝转录组数据,克隆了菘蓝莽草酸羟基肉桂酸酰转移酶IiHCT的全长cDNA并进行生物信息学分析,进一步利用实时荧光定量PCR技术分析了IiHCT基因的表达模式。IiHCT ORF为1290 bp,编码430个氨基酸,等电点为5.77,相对分子质量为47.68 kDa。IiHCT主要在菘蓝茎中表达,幼根、叶、花蕾中几乎不表达。同时发现离体菘蓝毛状根中可以检测到IiHCT的表达,外源茉莉酸甲酯(MeJA)处理后,IiHCT相对表达量明显增加,在4 h达到原先的4.3倍。研究首次从菘蓝中克隆得到HCT基因,为进一步解析菘蓝苯丙素类成分的生物合成途径奠定基础。     

阳春砂3个萜类合酶基因启动子的克隆及其参与萜类调控的分析

目的获得药用植物阳春砂Amomum villosum萜类合酶基因Av BPPS(bornyl diphosphate synthase)、AvLIS(linalool synthase)和AvHUS(humulene synthase)的启动子,探究其顺式作用调控元件参与萜类合成的调控。方法从阳春砂叶片基因组DNA(genomic DNA,gDNA)中分别克隆获得AvBPPS、AvLIS和AvHUS的gDNA序列,据此设计特异引物,再通过FPNI-PCR(fusion primer and nested integrated PCR,FPNI-PCR)方法分别克隆其启动子并进行生物信息学分析,结合转录组及对应萜类含量数据,分析其较为关键的顺式作用调控元件与萜类调控的关系。结果获得Av BPPS、AvLIS和AvHUS的gDNA长度分别为2374、2295、2362 bp,均包含相应基因的完整编码区和7个外显子。进一步克隆获得470、934、762 bp的启动子。AvBPPS启动子含有参与胚乳表达的顺式作用调控元件GCN4-motif,结合基因表达量的分析,该顺式作用调控元件调控了AvB...     

三七香叶基香叶基焦磷酸合酶基因的克隆及表达分析

基于三七转录组测序结果,选择萜类代谢骨架上香叶基香叶基焦磷酸合酶基因(GGPPS),结合RACE技术,克隆得到全长1 203 bp的cDNA序列,最长开放阅读框为1 035 bp,命名为PnGGPPS,GeneBank登录号为KM486564,PnGGPPS基因全长2 370 bp,包含1个内含子和2个外显子,该基因编码344个氨基酸,与蓖麻Ricinus communis、丹参Salvia miltiorrhiza等植物GGPPS的同源性达到73%以上,具有富天冬氨酸区等多个结构域,属于类异戊二烯合成酶超家族。实时荧光定量PCR结果显示,PnGGPPS在一至三年生三七的根、茎、叶和三年生的花等不同器官组织中均有表达,但以三年生叶中具有显著水平的高表达量,暗示其既具有调节三七生长发育的基本功能,也与三七叶绿素和类胡萝卜素的合成、叶绿体的发育、阴生适应性,以及品质的形成有关。