人β神经生长因子基因转染体外培养猫角膜内皮细胞促进分裂再生的研究

目的 探讨人β神经生长因子真核表达载体(pcDNA4-13-NGF)转染体外培养猫角膜内皮细胞并促进细胞分裂再生的机制,为将该基因应用于促进人角膜内皮细胞再生的研究打下基础.方法 为实验研究.通过EffecteneTM脂质体介导将自行构建并经测序证实的人pcDNA4-B-NGF转染到体外培养的猫角膜内皮细胞中.采用分组对照的方法研究转染前后猫角膜内皮细胞分裂再生能力.转基因后48 h通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化学染色方法分别在mRNA和蛋白水平检测人β神经生长因子(β-NGF)的表达.转基因后96 h采用细胞四甲基偶氮唑盐染色(MTT)测量吸光度值、细胞有丝分裂指数、流式细胞仪检测G1期细胞比例及细胞损伤后愈合面积测量等方法检测目的 基因对猫角膜内皮细胞增殖活性的作用.结果 EffecteneTM脂质体可有效介导重组真核表达载体peDNA4-β-NGF转染到经改良方法体外培养的猫角膜内皮细胞中,转染效率为11.3%,并促进该细胞表达β-NGF.正常对照组β-NGF/β-actin比值结果为3.14,加脂质体组为3.23,pcDNA4质粒转染组为3.21,pcDNA4-β-NGF重组质粒转染组为4.53.培养液、正常对照组、加脂质体组、pcDNA4质粒转染组及pcDNA4-β-NGF重组质粒转染组平均A值分别为0.178±0.007、0.482±0.033、0.488±0.017、0.520±0.021及0.623±0.041.正常对照组、加脂质体组、pcDNA4质粒转染组及pcDNA4-β-NGF重组质粒转染组细胞有丝分裂指数分别为3.3%、3.0%、3.1%及7.7%.正常对照组、加脂质体组、pcDNA4质粒转染组及pcDNA4-β-NGF重组质粒转染组G1期细胞比例分别为68.1%、51.6%、60.4%及87.9%.结论 人β-NGF基因可通过EffecteneTM脂质体介导有效转染到体外培养的猫角膜内皮细胞中,并促进细胞分裂再生,为进一步将此基因转入人角膜内皮细胞的研究提供实验经验.     

角膜内皮细胞体外培养的研究进展

角膜内皮是角膜的重要组成部分,由单层的角膜内皮细胞(corneal endothelial cell,CEC)组成,在维持角膜正常的透明度方面发挥着重要的作用.CEC在出生后即丧失增殖能力,一旦受损或丢失会导致不可逆性角膜疾病.但是,大量的研究表明CEC可以在体外增殖,这为体外培养人CEC用于角膜疾病的治疗提供了可行性,但至今仍没有建立一套标准的CEC体外培养方法.本文将归纳总结近年来CEC体外培养方法.以利于今后优化CEC体外培养体系.     

人角膜内皮细胞的体外培养及其鉴定的研究进展

角膜内皮细胞对维持角膜的透明性和厚度起着关键性的作用。人体内角膜内皮细胞有限的增殖能力及角膜供体的短缺,使组织工程人角膜内皮的体外重建受到了关注。目前,人角膜内皮细胞的培养方法已基本成熟。但是体外培养的人角膜内皮细胞的功能评价及鉴定标准却尚未建立。本文就人角膜内皮细胞的体外培养及其鉴定的研究进展进行综述。     

体外培养的角膜内皮细胞移植研究新进展

随着组织细胞培养方法的不断完善,大量研究表明,人类及灵长目动物的角膜内皮细胞(corneal endothelial cell,CEC)可以在组织培养的条件下生长并形成单层,其细胞形态与活体人CEC类似,这为采用培养的CEC进行移植以恢复损伤的内皮功能提供了技术支持。本文就有关CEC体外培养、载体选择以及移植方法的最新进展进行综述,对目前仍需解决的问题和前景进行展望。     

猫角膜内皮细胞的快速体外培养及其鉴定

角膜内皮细胞是维持角膜正常生理功能的关键细胞，角膜内皮细胞体外培养的纯度是进一步研究该细胞生物学功能的关键。本研究组织块法体外培养猫角膜内皮细胞，通过细胞形态学观察、神经特异性烯醇化酶（neuron—specific enolase，NSE）的特异染色及透射电镜观察来鉴定细胞的类型、纯度及生理特性。     

压力对体外培养的牛角膜内皮细胞的影响

目的观察压力对体外培养的牛角膜内皮细胞形态结构及细胞活力的影响。方法对体外培养的牛眼角膜内皮细胞施以2.67kPa、5.33kPa及8.00kPa的压力各6、12、24、36、48h,以不加压组作为对照组。用倒置相差显微镜及电镜观察细胞形态结构,以台盼蓝染色观察比较48h时各组细胞活力的差别,用单因素方差分析比较不同压力下阳性细胞率。结果当作用于细胞的压力为2.67kPa(1kPa=7.5mmHg),作用时间为6、12、24、36、48h时,与对照组比较,细胞形态结构均无明显变化;48h时台盼蓝计数与对照组比较差异无统计学意义(P=0.776)。当压力为5.33kPa,作用时间为24h时,细胞形态结构出现轻度的损伤,在36、48h时加重;48h时台盼蓝计数与对照组比较,差异有统计学意义(P=0.00)。当压力为8.00kPa时,6h时即出现明显细胞形态结构损害,随着压力和作用时间的进一步增加,细胞的损伤程度也进一步加重;48h时台盼蓝计数与对照组比较差异有统计学意义(P=0.000)。结论牛角膜内皮细胞在加压48h时只能承受2.67kPa的压力,当压力为5.33kPa及8.00kPa,施压48h时,将造成细胞...     

人表皮生长因子对体外培养兔角膜内皮细胞影响的实验研究

目的：明确人表皮生长因子（ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ,ｈＥＧＦ）对角膜内皮细胞的影响。方法：采用体外培养的兔角膜内皮细胞,观察接种后不同时点ｈＥＧＦ对其生长状态的影响;兔角膜片内皮损伤模型,离体培养后行Ｈ－Ｅ染色和Ｈ＾３－ＴｄＲ掺入放射自显影,观察ｈＥＧＦ对其修复的影响。结果：兔角膜内皮细胞体外培养ｈＥＧＦ组细胞数高于对照组,并使细胞形态产生纺锤形改变;角膜内皮细胞     

角膜内皮细胞体外增生、培养和鉴定

角膜内皮细胞对维持角膜透明和脱水状态具有重要作用,体外成功培养对研究角膜内皮细胞的结构和功能具有重要意义,也是角膜组织工程开展的基础工作之一。但是角膜内皮细胞体外培养受其增生能力、培养条件和细胞鉴定等多种因素限制,成为角膜生物学及角膜组织工程的研究热点,本文就角膜内皮细胞体外增生、培养和鉴定的研究进展进行综述。     

人胚肺成纤维细胞饲养兔角膜上皮和内皮细胞的体外培养

目的 研究人胚肺成纤维饲细胞体外培养兔角膜上皮和内皮细胞。方法 人胚肺成纤维细胞系细胞。经丝裂霉素C处理成饲细胞,兔角膜上皮和内皮细胞组织块原代培养,消化接种于人胚肺饲细胞瓶传代培养,体外培养的角膜上皮和内皮细胞行常规病理形态学检查。角膜上皮细胞行角蛋白,内皮细胞行神经烯醇化酶免疫组化染色检测。结果 人胚肺成纤维细胞形态均一。易于分辨,经丝裂霉素处理后推动增殖能力。角膜上皮和内皮细胞原代培养5-7天。细胞密集,经人胚肺饲细胞共培养5代。细胞无衰老现象,检测角膜上皮细胞角蛋白,内皮细胞神经烯醇化酶表达阳性,人胚肺饲细胞表达阴性。结论 人胚肺饲细胞能够明显增强角膜上皮和内皮细胞的体外生存能力。提高细胞的增殖能力。     

兔角膜内皮细胞体外原代培养及形态学观察

目的：研究培养兔角膜内皮细胞,为实验提供基础。方法：通过改良的细胞收获,培养技术,在体外进行兔角膜内皮细胞的培养,细胞的类型由电镜证实,观察hEGF不同时间点对角膜内皮细胞生长状态的影响。结果：未加入任何促细胞分裂剂的情况下,细胞在体外生长良好,约一周左右形成密集状态,形态类似天然细胞,经倒置显微镜和电镜证实为角膜内皮细胞。在有hEGF存在时,细胞生长迅速3－4天形成单层,各个时间点EGF组的细胞数高于对照组,结论：该技术可为角膜内皮细胞的研究提供较多的纯内皮细胞。     

深低温保存人角膜内皮细胞复苏培养观察

作者采用自控程序降温机对角膜内皮细胞进行超低温冷冻方法保存,并对复温后的角膜内皮细胞进行培养观察,研究超低温长期保存角膜内皮细胞的可行性.     

角膜内皮细胞培养方法的改进

介绍三种角膜内皮细胞的原代培养方法，这三种方法的特点是简便、易行、不需特殊的试剂和设备。应用这些方法，均获得良好的单层角膜内皮原代培养细胞。     

角膜内皮细胞培养的研究进展

角膜内皮功能失代偿引起的失明可通过角膜移植来治疗.人们通过体外培养角膜内皮细胞并使其增殖,进行角膜内皮细胞移植和角膜组织工程学研究.目前常用的分离角膜内皮细胞的方法是从供体上撕除后弹力层和角膜内皮层,利用酶消化作用使角膜内皮细胞分离.常用的培养基为基础培养基加各种生长因子.这些生长因子在一定程度上促进细胞增殖,但培养的角膜内皮细胞长期传代后仍难以维持正常的细胞形态和功能.基因转染技术建立了永生化角膜内皮细胞系,有关细胞周期、信号通路和离子通道的研究成果也促进了角膜内皮细胞体外培养的研究进展.本文综述了角膜内皮细胞体外培养各个环节的最近进展.     

黄酮对体外培养人角膜内皮细胞的影响及其抗氧化作用

目的:确定黄酮对人角膜内皮细胞(human corneal endothelial cells,HCEC)的影响及其对因氧化损伤所致细胞凋亡的抗氧化保护作用。方法:利用体外培养的HCEC,通过添加不同浓度的黄酮继续培养,或经不同浓度黄酮预处理后再添加过氧化氢(H2O2)继续培养,采用光镜形态观察、吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双染色和DNA琼脂糖凝胶电泳等技术手段,研究黄酮对HCEC的影响及其抗氧化作用。结果:黄酮浓度高于85μmol/L时可诱导HCEC发生细胞凋亡,而低于70μmol/L时对HCEC没有影响;55和70μmol/L黄酮预处理对600μmol/LH2O2所引起的HCEC细胞凋亡具有显著的抑制作用(60%→22%,8%;P<0.01),而85和100μmol/L黄酮预处理对H2O2所引起的HCEC细胞凋亡没有显著的抑制作用。结论:55~70μmol/L黄酮对HCEC具有显著的抗氧化保护作用,而浓度高于85μmol/L的黄酮反而能诱发HCEC发生细胞凋亡。     

角膜内皮细胞移植

角膜内皮细胞移植是治疗角膜内皮疾病很有潜力的一种方法,目前仍停留于动物实验阶段,主要难点是供体角膜内皮细胞的培养和维持、细胞载体和手术技巧等问题,本文围绕这些问题进行综述。     

转化生长因子-β2体外抑制人角膜内皮细胞增殖的作用

目的:研究转化生长因子TGF-β2对体外培养人角膜内皮细胞(HCEC)增殖的影响机制。方法:体外培养经血清饥饿法获得同步化的HCEC,用不同浓度TGF-β2对HCEC进行不同时间的处理,采用细胞计数、MTT染色以及流式细胞仪(FCM)和RealtimePCR检测TGF-β2对HCEC的增殖、细胞周期及细胞中p27kip1和p21cip1表达的影响。结果:TGF-β21～15μg/L对HCEC有显著的增殖抑制作用,具有浓度和时间依赖性,9μg/L是TGF-β2抑制HCEC细胞增殖的峰浓度。9μg/LTGF-β2处理后,处于G1/G0期HCEC数量显著增加,并具有时间依赖性。9μg/LTGF-β2处理24h后,p27kip1表达量显著增加,48h后p27kip1和p21cip1的表达量均显著增加,也具有时间依赖性。结论:TGF-β2对HCEC具有显著的浓度和时间依赖性增殖抑制作用,可能通过先后诱导p27kip1和p21cip1表达量的增加将细胞拘留在G1/G0期来实现的。     

体外培养角膜内皮细胞移植的实验研究

目的　探讨体外培养角膜内皮细胞移植的手术方法及移植后在活体的生理功能。方法　植片 :以直径 7 5mm、厚 10 0 μm、冷冻脱水保存的猪角膜后弹力膜 (Descemet′smembrane ,DM ) /基质为载体 ,原代接种兔角膜内皮细胞 ,体外培养 7～ 10d ,用于移植。受眼 :新西兰兔 3 0只 ( 3 0眼 ) ,实验组 2 0眼 ,对照组 10眼 ,全角膜范围去除术眼内皮细胞 ,5周后施行手术 ;做直径 9mm、3 / 4角膜厚的带蒂前层角膜瓣并掀置一侧 ,再用直径 7 2 5mm的环钻钻去中央后层角膜 ,形成植床 ;将植片置于植床 ,8-0可吸收线间断缝合 ,10 -0尼龙线间断缝合前层角膜瓣 ,术后观察 1～ 12个月。结果　术后角膜持续透明 6个月 14眼 ( 14 / 18、 77% ) ,12个月 8眼 ( 8/ 14、 5 7% ) ;术后 6个月内皮细胞密度 ( 193 4± 3 0 7)个 /mm2 ,角膜厚度平均为 ( 3 92± 3 9) μm。 结论　以异种DM /基质为载体培养的兔角膜内皮细胞 ,行同种异体移植后 ,能够在活体上成活 ,并具有正常内皮细胞的生物学功能 ,维持角膜透明 ,深板层角膜内皮移植术是体外培养内皮细胞移植的一种有效术式。     

体外培养的兔角膜内皮细胞生物学特性

背景如何选择高质量、生物学特性更接近在体生理状态的角膜内皮种子细胞是组织工程角膜研究的基础。角膜内皮细胞（CECs）的培养、鉴定及生物学特性检测是优选角膜内皮种子细胞的瓶颈问题。目的建立兔CECs原代培养及鉴定的方法,检测传代后细胞的生物学特性。方法从30只新西兰大白兔的角膜组织完整撕除后弹力层及CECs层,采用胰蛋白酶消化法进行原代培养,观察培养细胞的生长状态。分别从形态学、基因水平和蛋白水平鉴定细胞：茜素红染色法观察细胞形态,并与新鲜角膜组织的内皮细胞进行对比;逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测IVα2型胶原（COL4A2）、血管内皮生长因子受体2（FLK1）、Na^-K^＋ATP酶α亚单位（ATPIA1）、水通道蛋白1（AQP1）、电压依丛性阴离子通道（VDACs）等相对特异性基因;免疫细胞化学法观察神经元特异性烯醇化酶（NSE）、Na^-K^＋ATP酶及紧密连接蛋白ZO-1的表达。采用MTT比色法测定传代细胞的增生活性变化,采用超微量ATP酶试剂盒及免疫荧光法分别测定传代细胞Na^-K^＋ATP酶活性及其表达量的变化。结果原代培养的兔CECs多在24h内贴壁,2—3d达融合,形态呈六边形。随着传代代数的增加,细胞形态逐渐发生改变,第2代、第3代细胞可见空泡样变。原代培养的细胞茜素红染色可见清晰的细胞轮廓,与在体的CECs形态相似。RT—PCR法检测可见COL4A2、FLKl、ATP1Al、AQP1、VDACs等基因在培养细胞中表达。免疫荧光染色结果显示NSE、Na^-K^＋ATP酶、ZO-1在培养细胞中呈阳性表达。MTT检测结果显示,传代后细胞的增生活性逐渐下降,尤其第2代、第3代细胞下降明显。定量检测结果显示随着传代代数的增加,兔CECs的Na^-K^＋ATP酶活性逐渐降低,各代细胞的Na^-K^＋ATP酶活性总体比较的差异有统计学意义（F=77．174,P=0．000）。结论成功用酶消化法建立了体外培养兔CECs的方法,并从多个层次建立了纯化细胞的鉴定方法。研究结果证实经传代后的CECs的增生活性和功能均有所下降,因此在进行相关的研究时应选用前2代的细胞。     

丝裂霉素对体外培养兔角膜内皮细胞的毒性影响

目的探讨丝裂霉素C(mitomycinC,MMC)对角膜内皮细胞的毒性作用。方法体外培养家兔角膜内皮细胞,接种于96孔板,加入不同浓度的MMC,分别为1×10-6g·L-1、1×10-5g·L-1、1×10-4g·L-1、1×10-3g·L-1、1×10-2g·L-1、1×10-1g·L-1,动态观察细胞的形态变化和增殖情况,加药22h后MTT法检测吸光度值,应用t检验比较各组间的差异。结果10-2g·L-1、10-1g·L-1浓度组8h后细胞部分死亡,20h细胞几乎全部死亡,其余各组变化不明显。统计学结果显示:10-6g·L-1、10-5g·L-1组和对照组比较无显著性差异(P>0.05),10-4g·L-1组有显著性差异(0.01相似文献