基因重组降钙素原蛋白在大肠杆菌中的克隆表达及纯化

目的构建降钙素原（PCT）基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达,以获取高产量、低成本、高纯度的PCT蛋白。方法按人的全长PCT cDNA序列,设计引物用标准的聚合酶链反应（PCR）法全基因合成步骤合成扣除信号肽外PCT的片段,应用基因重组技术将该片段克隆到质粒pET21a（＋）中,进行限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定。将重组质粒转化大肠杆菌E．coli（DH5α）,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后,用镍-氮三乙酸（Ni-NTA）亲和层析纯化获取蛋白,用十二烷基硫酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western blot）的方法鉴定。结果扩增出的人PCT片段于原核表达载体中克隆,经酶切和核酸测序鉴定,得到正确的重组质粒pET-PCT,并在大肠杆菌中得以表达。纯化后的蛋白经考马氏亮蓝染色呈单一条带;用抗PCT的抗体进行Western blot分析证明目的蛋白有反应性。结论本研究成功构建了表达基因重组人PCT的原核表达载体,基因重组人PCT蛋白在大肠杆菌中获得了表达和纯化,为进一步获取高纯度、高效价的单克隆抗体和开展临床检测提供了必要的条件。     

HBHA截短体蛋白的表达纯化及其诊断活性研究

目的原核表达HBHAΔC及HBHAΔN蛋白,比较HBHA系列蛋白活性。为进一步研究HBHA临床诊断价值提供实验依据。方法克隆HBHAΔC和HBHAΔN目的基因,用于大肠杆菌(E.coli)BL-21系统表达纯化。将蛋白通过CL-6B柱检测肝素结合能力。并加入到培养BCG的7H9液体培养基中,观察其诱导BCG聚集情况。结果nHBHA,rHBHA及HBHAΔN蛋白均具有肝素结合能力。nHBHA、rHBHA和HBHAΔC蛋白具备诱导BCG聚集的作用。结论成功获得HBHA截短体蛋白;证实HBHA蛋白碳端参与肝素结合功能;蛋白氮端参与诱导BCG聚集反应。该实验结果为进一步研究TB感染分子机制及临床诊断应用奠定基础。     

乳腺珠蛋白基因在大肠杆菌中的诱导表达及纯化研究

目的 克隆乳腺珠蛋白（human mammaglobin,hMAM）编码全长cDNA,原核表达并纯化蛋白产物,为后期研制乳腺癌早期诊断试剂盒奠定基础,从而为早期发现乳腺癌提供科学的监测方法。方法 自乳腺癌组织提取总RNA,通过RT-PCR克隆hMAMcDNA,构建pQFA0-hMAM表达质粒,在大肠杆菌M15中表达,利用镍-亚硝胺乙酸组氨酸（Ni-NTA-His）亲和层析法对重组蛋白进行纯化。结果 表达的融合蛋白以不溶性包涵体形式存在,纯化后得到纯度为97％的目的蛋白。结论 成功地纯化出hMAM重组蛋白。     

重组人骨形态发生蛋白2在大肠杆菌中的可溶性表达和纯化

背景:骨形态发生蛋白是一类调节骨组织发育的生长因子,其中骨形态发生蛋白2诱骨活性最强,在骨组织工程研究中需要大量的骨形态发生蛋白2.目的:克隆表达骨形态发生蛋白2基因,并进行蛋白表达及蛋白纯化定量.设计、时间及地点:单一样奉观察,于2008-05/07在宝牛物工程(大连)有限公司开放实验室完成.材料:表达载体pET28a Vector及相应的宿主细胞E.coil BL21(DE3)购于Novagen公司;分子伴侣质粒pTF16、pGr07、PKJE7购于宝生物工程(大连)有限公司.方法:利用基因重组技术,优化片人工合成骨形态发生蛋白2基因,亚克隆至含T7启动子的原核表达载体pET28a中,构建表达载体pET-BMP.将重组质粒pET-BMP与3种含分子伴侣质粒共转入宿主菌E.coil BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达.菌体经超声波破碎,镍柱亲和层析纯化并定量.主要观察指标:①3种表达质粒的表达及町溶性检测及表达上清的westem blotting检测.②pET-BMPg的纯化.结果:在表达宿主菌中,骨形态发生蛋白 2基因获得了高效表达,其中一组为可溶性表达,表达产物经亲和层析纯化后,可溶性表达量达12.18 mg/L培养基.结论:人骨形态发生蛋白2基凼能在PET表达系统中得到高效可溶性表达.     

Gal-4蛋白在大肠癌中的表达及其临床意义

目的 探讨Gal-4蛋白在大肠癌中的表达及其临床意义. 方法 分别收集83例和31例石蜡包埋的大肠癌和正常大肠组织.免疫组化检测Gal-4蛋白在大肠癌及正常大肠组织中的表达.统计分析Gal-4蛋白表达变化与大肠癌临床参数之间的相关性. 结果 Gal-4蛋白在大肠癌中的表达明显下调.此外,下调表达的Gal-4蛋白明显与大...     

NK4基因在重组腺病毒中的表达与初步鉴定

目的 构建含有肝细胞生长因子(HGF)NK4基因的重组腺病毒载体，为应用HGF／NK4进行肿瘤基因治疗奠定实验基础。方法 应用AdEasy腺病毒载体系统，将PCR扩增所得的NK4基因片段与穿梭质粒pShuttle-CMV进行连接，获得重组质粒pShuttle-CMV-NK4，将该质粒与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5l83获得重组腺病毒质粒pAdCMV-NK4，用该质粒转染293细胞包装产生出重组腺病毒rvAdCMV-NK4。重组腺病毒分别经电子显微镜技术及RT-PCR、Western Blot等方法进行鉴定。结果 得到含有NK4基因的重组腺病毒rvAdCMV-NK4，电子显微镜下可见典型腺病毒颗粒形态，RT-PCR及Westem Blot分析显示rvAdCMV-NK4感染293细胞后NK4基因可有效转录并表达。结论 成功构建出含有NK4基因的重组腺病毒rvAdcMV-NK4，为下一步开展关于NK4基因的肿瘤治疗提供了基础。     

人心肌型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)在大肠杆菌中的表达和纯化

目的获得重组人心肌型脂肪酸结合蛋白,为进一步开发应用奠定基础。方法根据已报道的心肌型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因序列,采用RT-PCR的方法获得心肌型脂肪酸结合蛋白基因。将所得的PCR产物插入原核表达载体pQE30中,得重组质粒(pQE-H-FABP)并转化大肠杆菌(E.coli)M15,通过IPTG诱导表达出带有六个组氨酸的融合蛋白。经镍固定金属亲和层析纯化。结果序列分析表明:H-FABP基因成熟肽编码区含有396bp,编码132个氨基酸;与GenBank(NM004012)中已报道的H-FABP分离物的核苷酸序列有99·9%同源性。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析显示,表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的27%,分子质量约为15kDa并与商品化的H-FABP单抗(Clone6B6)呈特异性反应。经Ni 2-NTAagarose纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带。结论在大肠杆菌中获得了人心肌型脂肪酸结合蛋白的高效表达,为研究其生物学功能和制备单克隆抗体奠定了基础。     

瑞替普酶在大肠杆菌中的表达与活性测定

目的构建带组氨酸标签(His_6·Tag)的瑞替普酶(Reteplase,r-PA)的表达载体,并在大肠杆菌中表达和活性检测。方法通过引物设计在r-PA基因5’端加上组氨酸标签(His_6·Tag)。克隆到pET23a原核表达载体中,转化E．coli BL21 (DE3),进行IPTG诱导表达。表达产物经亲和层析纯化后,用FAPA法测定其纤溶活性。结果构建的原核表达载体经PCR、酶切鉴定、测序后正确。表达产物分子质量39kDa,为r-PA特异性条带,纯化产物具有纤溶活性。结论成功地在大肠杆菌表达了带有标签的r-PA,简化了下游分离纯化和复性步骤。     

细胞周期蛋白E在胃癌中的表达及其与细胞增殖活性的关系

目的 :研究细胞周期蛋白E有胃癌组织中的表达与细胞增殖活性及其它临床病理因素的关系。方法 :用免疫组织化学方法检测 40例胃癌组织中细胞周期蛋白E和Ki-6 7的表达。结果 :胃癌组织中细胞周期蛋白E和Ki-6 7表达阳性率分别为 45 %和 72 5 % ,在细胞周期蛋白E阳性胃癌中Ki-6 7阳性率明显高于细胞周期蛋白E阴性胃癌 (P <0 0 5 )。此外还发现细胞周期蛋白E在胃癌中的表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和TNM分期密切相关 ( P <0 0 5 )。结论 :提示细胞周期蛋白E在胃癌中的表达与Ki-6 7的表达有关 ,并在肿瘤的进展中起一定作用     

细胞周期蛋白E在胃癌中的表达及其与细胞增殖活性的关系

目的：研究细胞周期蛋白Ｅ有胃部细胞中的表达与细胞增殖活性经临床病理因素的关系。方法：用免疫组织化学方法检测４０例胃部细胞中细胞周期蛋白Ｅ和Ｋｉ－６７的表达。结果：胃癌细胞中细胞周期蛋白Ｅ和Ｋｉ－６７表达阳性率分别为４５％和７２．５％,在细胞周期蛋白Ｅ阳性胃癌中Ｋｉ－６７阳性率明显高于细胞周期蛋白Ｅ阳性胃癌（Ｐ〈０．０５）。此外还发现细胞周期蛋白Ｅ在胃癌中的表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和ＴＮＭ分期     

重组人转化生长因子β 1在大肠杆菌中的表达及其活性检测

目的运用基因重组的方法，对人转化生长因子β1(TGF－β1)进行基因克隆，并在大肠杆菌中表达。同时检测其生物活性。方法以pBV220作为原核细胞表达载体，用限制性内切酶将pBSksTGF－β1中的TGF－β1cDNA片段定向重组到pBV200的多克隆位点上，经酶切分析，筛选构建了原核细胞表达性质粒pTGF－β1。将该质粒分别转化至大肠杆菌中，建立TGF－β1原核表达体系pTGF－β1－DH5α和pTGF－β1－JM109,进行温度诱导表达。结果表达产物经SDS－PAGE分析，Westernblot、SDS、PAGE光密度扫描检测证实，该体系可高效表达TGF－β1，其表达产物约占菌体可溶性蛋白的23％。用NRK细胞对表达产物进行活性检测证明，本研究生产的TGF－β1具有该蛋白的野生活性。结论TGF－β1原核表达体系的建立为TGF－β1的生产提供了高效的表达工程菌株，为进一步研究其分离纯化工艺提供了重要的实验模型。     

人肌酸激酶MM同工酶在大肠杆菌中的高效可溶性表达及纯化研究

目的构建肌酸激酶MM同工酶原核表达系统,纯化重组酶蛋白并对其稳定性进行研究,为其作为参考品或校准品应用于临床奠定基础。方法提取胎儿心肌组织总RNA,反转录扩增人肌酸激酶M亚基基因,构建pET-15b-CK、E.coliBL21(DE3)pLysS原核表达系统,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达。利用重组蛋白的组氨酸标签(H is-tag)进行金属螯合亲和层析纯化,观察重组酶在不同保存条件下的稳定性。结果重组质粒经酶切及测序鉴定与预期相符,诱导表达后细菌裂解液上清酶活性可达280 000 U/L,纯化后SDS-PAGE在分子量45 000处显示单一蛋白条带,在-20℃加入70g/L BSA、1 mmol/L DTT、2 mmol/L EDTA的PBS(pH 7.4)保存体系中,重组酶活性在30 d观察期内基本不变。结论成功表达并纯化了人肌酸激酶MM同工酶,重组酶稳定性良好,初步具备了作为基因工程人源酶校准品的基本特点。     

重组人胱抑素C在大肠杆菌中的表达及纯化

目的研究构建人胱抑素C(Cys C)的重组表达质粒及其在大肠杆菌中的表达和纯化。方法采用反转录-聚合酶链反应从人肝组织中获取Cys C cDNA,并将其插入到pET-28a(+)质粒中,重组质粒pET-28a-CysC转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)pLysS,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达可溶性CysC。重组CysC采用Ni2+-NTA系统进行层析纯化。结果核酸序列测定与预期一致,CysC表达水平达到146mg/L,约占菌体总可溶性蛋白的13.5%,表达产物用SDS-PAGE鉴定,其相对分子质量为13.3×103,经纯化后蛋白纯度达90%。结论成功构建Cys C原核表达系统和蛋白纯化,为制备抗体以及研制Cys C免疫纳米微球测定试剂奠定了基础。     

再生基因4(REG4)真核表达载体的构建及其蛋白在HEK 293T细胞中的表达、纯化

目的构建再生基因4(regenerating gene 4,REG4)的真核表达载体,转染人胚肾细胞293T(human embryonic kidney 293T cells,HEK 293T),获得重组人再生胰岛衍生蛋白IV (regenerating islet-derived protein IV, Reg IV)。方法 根据NCBI数据库REG4基因序列进行基因优化、合成,将其克隆至pCDNA3.4载体并进行双酶切和测序鉴定,通过转染试剂聚乙烯亚胺（polyethylenimine, PEI）将pCDNA3.4-REG4质粒瞬时转染至HEK 293T细胞（实验组）,同时以pEGFP-C1质粒作为转染对照组,未转染重组质粒的HEK 293T细胞作为空白对照组。荧光显微镜观察转染对照组转染效率,分别收集实验组及空白对照组细胞和细胞培养液上清,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）与免疫印迹试验（Western-Blot,WB）检测Reg IV蛋白表达水...     

Smad4蛋白在结直肠癌组织中的表达及其临床意义

目的:探讨Smad4蛋白在结直肠癌组织中的表达及其与患者临床表现和病理结果之间的关系。方法:采用免疫组织化学S-P法检测60例结直肠癌组织和27例相应的癌旁正常组织中Smad4的表达,并对表达情况评分。癌组织与癌旁正常组织中Smad4表达情况的比较,采用Mann-Whitney检验。结果:Smad4蛋白在结直肠癌组织和癌旁正常组织中的表达水平有显著差异(P<0.001)。Smad4的表达水平与肿瘤的浸润层次、淋巴结转移及Dukes分期显著相关(P<0.05)。结论:Smad4的低表达可能与结直肠癌的发生、发展有关,故Smad4有望作为结直肠癌的预后指标和基因靶向治疗的有效靶点。     

自剪切重组麦芽糖结合蛋白-人鼻病毒3C 蛋白酶融合蛋白在大肠杆菌表达系统中表达、纯化及活性检测

目的：利用大肠杆菌表达系统高效表达一种可以自剪切的重组的麦芽糖结合蛋白-人鼻病毒3C蛋白酶融合蛋白酶，获得一种可溶性好、酶切特异性强，且在低温下仍保持酶活性的新型基因工程工具酶。方法将编码人鼻病毒3C 蛋白酶的遗传微粒克隆入表达载体 pRSF-duet，转化大肠杆菌 BL21（DE3），经镍柱亲和层析纯化得到人鼻病毒3C 蛋白酶。通过自身体内酶切实验进行活性检测。结果人鼻病毒3C 蛋白酶在大肠杆菌表达系统中得到了高效的表达，并可特异性识别及剪切人鼻病毒3C蛋白酶酶切位点。结论获得了新型的基因工程工具酶。     

hDaxx融合蛋白在原核细胞中表达与纯化

目的：GST－hDaxx融合蛋白在原核细胞中表达并纯化，以便进一步在体外探讨hDaxx的生物学活性。方法：构建GST－hDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX-4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。表达产物用亲和层析柱加以纯化后，Western blot鉴定表达产物及其纯化物。结果：pGEX-4T/hDaxx能用IPTG在E.coli中诱导表达GST－hDaxx融合蛋白。结论：原核细胞表达了GST－hDaxx融合蛋白。     

重组人转化生长因子β_1在大肠杆菌中的表达及其活性检测

目的运用基因重组的方法,对人转化生长因子β 1(TGF－β 1)进行基因克隆,并在大肠杆菌中表达。同时检测其生物活性。方法以 pBV220作为原核细胞表达载体,用限制性内切酶将 pBSksTGF－β 1中的 TGF－β 1cDNA片段定向重组到 pBV200的多克隆位点上,经酶切分析,筛选构建了原核细胞表达性质粒 pTGF－β 1。将该质粒分别转化至大肠杆菌中,建立 TGF－β 1原核表达体系 pTGF－β 1-DH5α和 pTGF－β 1-JM109,进行温度诱导表达。结果表达产物经 SDS-PAGE分析, Western- blot、 SDS、 PAGE光密度扫描检测证实,该体系可高效表达 TGF－β 1,其表达产物约占菌体可溶性蛋白的 23％。用 NRK细胞对表达产物进行活性检测证明,本研究生产的 TGF－β 1具有该蛋白的野生活性。结论 TGF－β 1原核表达体系的建立为 TGF－β 1的生产提供了高效的表达工程菌株,为进一步研究其分离纯化工艺提供了重要的实验模型。     

重组人Flt3配体在大肠杆菌中的表达、纯化与功能鉴定

目的：建立重组人Flt3配体（rhFL)的原核高效表达系统及目标蛋白的纯化途径,为大规模获得rhFL产品,促进干细胞体外扩增,移植等新技术在临床的应用创造条件,方法：将FL细胞段cDNA与pProEXFT载体连接,重组体引入大肠菌菌并在异丙基－β－D－硫化半乳糖苷诱导下表达,提取包涵体,经变性,复性等处理,用金属离子螯合层析纯化表达产物,观察纯化所得rhFL刺激CD^ 34细胞的增殖情况,结果：rhFL的表达约占菌体蛋白总量的15％,经亲和纯化纯度达90％以上,rhFL CG-CSF＋Fpo刺激CD34^ 细胞增殖约400倍,结论：获得了rhFL在大肠肝菌中的高效表达,并初步建立了产物纯化途径,纯化后的rhFL具有产强的刺激造血干／祖细胞增殖的能力。     

骨肉瘤细胞热休克蛋白70基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的从人的骨肉瘤细胞中钓取热休克蛋白70(HSP70)基因并在大肠杆菌中表达出热休克蛋白,为进行热休克蛋白的功能试验提供抗原。方法热休克人骨肉瘤细胞后,采用One-Step,RT-PCR方法从人骨肉瘤细胞中钓取HSP70基因,DNA测序正确的HSP70基因和表达载体pET28a连接后,构建成功了重组表达质粒pET28a-HSP70,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导蛋白表达后,进行SDS-PAGE及Westernblot鉴定。结果人骨肉瘤细胞HSP70基因的PCR产物约为1.9 kb,DNA序列测定结果证实,所获目的序列与文献报道的基本一致,仅有两个碱基的差异。构建的重组表达质粒pET28a-HSP70,能够在大肠杆菌中表达。结论从人骨肉瘤细胞中成功地钓取了HSP70基因并在大肠杆菌中表达出HSP70蛋白,为研究人骨肉瘤细胞HSP70的结构、功能与临床应用奠定了基础。