人转录因子USF基因在大肠杆菌中的表达、纯化及在FAK启动子中的结合研究

目的：在大肠杆菌中表达人源转录因子USF（upstream stimulatory factor）并进行分离纯化,进一步分析其在FAK（focal adhesion kinase）启动子中的DNA结合能力。方法：将人源USF cDNA克隆到表达质粒pET28a载体,然后将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达带His6-Tag的融合蛋白His-USF,通过镍柱亲和层析纯化,SDS-PAGE分析鉴定。EM-SA分析纯化后的蛋白与FAK启动子的DNA结合情况。结果：His-USF在大肠杆菌中获得高效表达,镍柱亲和层析纯化得到了高纯度的蛋白,并能够结合到FAK的启动子上。结论：获得高效表达的高纯度His-USF融合蛋白,为USF对其靶基因的结合与转录调控的进一步研究奠定了基础。     

人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶hAPE1融合蛋白的构建、纯化及其功能的初步研究

目的 构建人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶(hAEP1)原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白,对其活性进行初步分析.方法 用PCR法扩增hAEP1基因,克隆入pET28a载体中,获得重组质粒pET28a-hAPE1.将重组质粒转化入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达并鉴定.用His亲和层析技术进行蛋白纯化,得到hAPE1融合蛋白.用Western blot及电泳迁移率变动分析实验分析hAPE1融合蛋白的抗原性及活性.结果 所构建的重组质粒pET28-hAPE1经双酶切及DNA测序鉴定表明构建正确.IPTG诱导表达后,经SDS-PAGE及Western blot鉴定均在预期位置出现阳性条带,His亲和层析纯化后得到hAPE1融合蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定正确.Western blot及电泳迁移率变动分析实验证明hAPE1融合蛋白具有抗原性、AP修复及氧化还原活性.结论 成功构建了人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶的原核表达载体pET28a-hAPE1,并在E. coli BL21(DE3)中高效表达和纯化得到有抗原性及活性的hAPE1融合蛋白.     

人血管内皮抑制素vasostatin120-180在大肠杆菌中的表达纯化及初步的抗血管生成活性研究

目的：在大肠杆菌中克隆和表达人源血管内皮抑制素vasostatin120-180（VAS）基因，并进行分离纯化及抑制新生血管生成活性鉴定。方法：根据大肠杆菌偏爱密码子，应用化学合成和分子克隆方法得到人源血管内皮抑制素120-180片段（即VAS）的编码基因。通过PCR和限制性内切酶消解，将VAS编码基因克隆入大肠杆菌表达载体pET28a中，并在BL21（DE3）菌株中经IPTG诱导、表达带有His融合标签的His-VAS重组蛋白。VAS蛋白的表达水平大约占细菌总蛋白的45％，大多数目的蛋白以包涵体形式存在，经过体外包涵体变性、复性及纯化，采用SDS-PAGE分析鉴定，用鸡胚尿囊膜血管生成抑制试验进行重组蛋白活性的生物活性鉴定。结果：经DNA序列分析鉴定，重组质粒pET28a-VAS构建成功，IPTG诱导后的融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达，Western blotting分析并鉴定了VAS的分子属性。通过鸡胚尿囊膜试验验证，重组VAS蛋白能够很好地抑制微血管生成。结论：获得高效表达的、高纯度的VAS，为VAS进一步的功能分析和抑制血管生成活性研究奠定了基础。     

蓝氏贾第鞭毛虫甲硫氨酸硫氧化物还原酶基因的克隆、表达与纯化

目的 蓝氏贾第鞭毛虫（简称为贾第虫）甲硫氨酸硫氧化物还原酶基因（GlMSR）,进行原核表达获得其重组蛋白。方法 依据GenBank中GlMSR序列设计引物,以贾第虫中国C2 克隆株基因组DNA 为模板,通过PCR扩增编码序列,将所得片段连接至质粒pET28a以构建原核表达载体pET28a-GlMSR,将pET28a-GlMSR导入大肠杆菌E.coli JM109并挑取阳性克隆进行基因测序和鉴定。用化学方法将经测序验证的重组质粒pET28a-GlMSR转化至E.coli BL21（DE3）。经异丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-Thiogalactoside, IPTG）诱导表达后,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测重组蛋白表达结果。收集沉淀中的重组表达产物,镍柱亲和层析纯化带组氨酸标签的重组蛋白,并通过免疫印迹鉴定纯化结果。结果 电泳结果显示在约624 bp处出现目的DNA条带,表明成功得到GlMSR编码序列;PCR 鉴定、酶切鉴定以及基因测序结果表明成功构建重组表达载体pET28a-GlMSR,经IPTG诱导后在沉淀中获得目的蛋白,目的蛋白分子量（Mr）约为25 000,与预期分子量（Mr）22 800基本相符。经Western blot分析显示该重组蛋白含有His6标签。结论 本研究克隆、表达了蓝氏贾第虫GlMSR基因,并纯化获得重组蛋白,为进一步探索该酶的功能奠定了基础。     

TAT-EGFP融合蛋白表达载体的构建及表达

目的:构建TAT-EGFP原核表达载体,在E.coli BL21中高效表达并纯化.方法:人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT重组质粒,再连接绿色荧光蛋白(EGFP)基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子.转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达.表达产物用十二烷基硫钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白.结果及结论:成功地构建了TAT-EGFP融合蛋白的原核表达载体,在诱导后获得了高效表达并纯化,为进一步研究TAT的蛋白转导作用奠定了基础.     

HSP-沙眼衣原体MOMP T细胞表位基因的重组、原核表达和蛋白质纯化

目的：构建热休克蛋白65（HSP65）与沙眼衣原体（C.trachomatis,Ct）主要外膜蛋白（MOMP）T细胞表位（简称ctm1）融合蛋白（简称H-ctm1）的原核表达载体,并将其表达及纯化。方法：用PCR技术获得HSP65基因和ctm1基因,并分别将其克隆入pMD18-T载体,采用酶切与连接的方法从pMD18-T载体上获得HSP65基因片段,并将其克隆入pET28a表达质粒,再用相同的方法将ctm1基因连接于HSP65基因片段的下游,从而完成H-ctm1的基因重组。用IPTG诱导转化H-ctm1表达载体的大肠杆菌,以镍金属螯合亲和层析法纯化融合蛋白质。结果：构建了HSP65与ctm1的表达载体pET28a-H-ctm1,DNA序列测定结果表明构建正确。以镍金属螯合亲和层析获得纯度为98%的融合蛋白质。结论：用分子克隆技术正确构建HSP65与Ct MOMP T细胞表位融合蛋白的表达载体,并成功表达与纯化出具有生物活性的融合蛋白。     

丙型肝炎病毒F蛋白原核表达载体的构建、表达和纯化

目的:构建丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)F蛋白的原核表达载体,表达pET32a(+)-HCVF融合蛋白.方法:根据丙型肝炎病毒F基因的全序列设计引物,以HCV1a型cDNA质粒H/FL为模板,通过PCR方法扩增得到F基因的编码区序列,将其定向克隆于含有6×His tag的原核表达载体pET32a(+),转化大肠杆菌JM109,经菌落PCR筛选,双酶切和测序鉴定阳性克隆后,转化大肠杆菌BL21,采用IVTG诱导表达融合蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测鉴定,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化.结果:F基因以正确的方式插入到pET32a(+)载体中,重组质粒转化大肠杆菌BL21后经IPTG诱导表达,出现了与预期分子量相符的蛋白条带,该蛋白通过Western blot检测具有6×His tag蛋白的免疫学活性.结论:成功构建了丙型肝炎病毒F蛋白的原核表达载体pET32a(+)-HCVF并表达和纯化出重组融合蛋白,为进一步研究F蛋白的生物学功能奠定了基础.     

人血管内皮抑制素vasostatin120-180在大肠杆菌中的表达纯化及初步的抗血管生成活性研究

目的:在大肠杆菌中克隆和表达人源血管内皮抑制素vasostatin120-180(VAS)基因,并进行分离纯化及抑制新生血管生成活性鉴定。方法:根据大肠杆菌偏爱密码子,应用化学合成和分子克隆方法得到人源血管内皮抑制素120-180片段(即VAS)的编码基因。通过PCR和限制性内切酶消解,将VAS编码基因克隆入大肠杆菌表达载体pET28a中,并在BL21(DE3)菌株中经IPTG诱导、表达带有His融合标签的His-VAS重组蛋白。VAS蛋白的表达水平大约占细菌总蛋白的45%,大多数目的蛋白以包涵体形式存在,经过体外包涵体变性、复性及纯化,采用SDS-PAGE分析鉴定,用鸡胚尿囊膜血管生成抑制试验进行重组蛋白活性的生物活性鉴定。结果:经DNA序列分析鉴定,重组质粒pET28a-VAS构建成功,IPTG诱导后的融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,Western blotting分析并鉴定了VAS的分子属性。通过鸡胚尿囊膜试验验证,重组VAS蛋白能够很好地抑制微血管生成。结论:获得高效表达的、高纯度的VAS,为VAS进一步的功能分析和抑制血管生成活性研究奠定了基础。     

人可溶性CD83基因的克隆、原核表达和纯化

目的:构建人可溶性CD83基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达和纯化.方法:利用反转录PCR方法从正常人外周血单个核细胞中获得可溶性CD83基因,克隆到表达载体pET-32a载体,构成重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达6×His融合蛋白,并经SDS-PAGE及Western blot检测和鉴定.表达产物包涵体经Ni-NTA亲和层析纯化.结果:经酶切鉴定及测序证实可溶性CD83蛋白基因的原核表达载体构建正确.经SDS-PAGE及Western blot显示在M,约32 000处出现融合表达条带.融合蛋白的表达量约占菌体蛋白总量的45%.重组蛋白经Ni-NTA亲和层析进行纯化后,得到了高纯度的融合蛋白.结论:成功克隆人外周血单个核细胞来源的可溶性CD83基因片段,并在大肠杆菌B121(DE3)中高效表达,亲和层析纯化后获得高纯度融合蛋白.     

人转录因子sp1在大肠杆菌中的表达与体外纯化

目的：在大肠杆菌中表达人源转录因子spl蛋白,并进行体外纯化。方法：首先将人源sp1真核表达质粒pCMV-sp1中的sp1 cDNA用限制性内切酶切开,连入原核表达质粒pET28b,构建原核表达重组质粒pET28b-sp1-699c;然后将重组质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）菌株,经IPTG诱导表达带His-Tag的融合蛋白His-sp1（88-786aa）,通过包涵体的变复性和Ni-IDA亲和层析纯化后,SDS-PAGE鉴定纯化后的蛋白。结果：融合蛋白His-sp1在大肠杆菌内得到高效表达,纯化后可得到较高纯度的蛋白。结论：本研究获得了较高纯度的融合蛋白His-sp1,为进一步研究sp1蛋白对靶基因的转录调控奠定了基础。     

rhTL1A基因原核表达载体的构建、表达与纯化

目的：构建人肿瘤坏死因子样分子1A（TL1A）原核表达质粒并诱导其表达,纯化及鉴定目的蛋白。方法：人HUVECs总RNA经逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增TL1A基因,克隆到pTA2载体,酶切和测序鉴定正确后构建重组原核表达质粒pQE-TL1A,并转化大肠杆菌M15［pREP4］。IPTG诱导目的蛋白表达并进行Western blotting鉴定;镍离子亲和层析柱(Ni²⁺-NTA)纯化靶蛋白。结果：目的基因经酶切其结果与预期相符,测序结果显示目的基因与GenBank登录的序列(登录号AF520785)完全一致;工程化大肠杆菌M15［pREP4］经IPTG诱导表达相对分子质量约22 000的目的蛋白;Western blotting鉴定结果显示,重组蛋白能够与抗His单克隆抗体特异性结合。结论：成功地构建了重组原核表达质粒pQE-Tl1A,并纯化获得高纯度重组TL1A蛋白。     

人分化抑制因子3基因原核表达载体的构建及融合蛋白的表达

目的:在大肠埃希菌中表达和纯化人分化抑制因子3(Id3),为进一步研究Id3的生物学活性打下基础. 方法:PCR扩增人Id3基因编码区的DNA片段,将PCR产物克隆至pGEM-T Esay载体中并测序鉴定.将Id3 cDNA片段重组入原核表达质粒pET-32a( ),转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白的表达,表达产物经Western blot 鉴定,并通过镍亲和层析柱纯化His-Tag标记的融合蛋白. 结果:成功地构建了Id3的原核表达载体.Western blot分析证实,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了His-Tag融合蛋白,亲和层析法纯化后获相对分子质量为34 000的Id3融合蛋白. 结论:重组质粒pET32a( )-Id3能在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,镍亲和层析柱可纯化获得融合蛋白.     

乙型肝炎病毒截短C基因与前S1基因在大肠杆菌中的融合表达及纯化

目的：构建乙型肝炎病毒（HBV）截短C基因和前S1基因重组原核表达质粒,获得融合蛋白的表达并进行抗原性分析．方法：PCR扩增获得截短C基因片段和前S1基因,双酶切后克隆至原核表达质粒pET28a,转化E．coli DH5α,酶切鉴定得阳性重组质粒pET28a并测序;然后转化E．coli B121,IPTG诱导融合蛋白表达,薄层扫描分析表达蛋白组成;可溶性分析后用Ni^2＋ -NTA凝胶亲和层析柱纯化、透析并浓缩融合蛋白,Westem Blot分析特异性和抗原性．结果：成功构建了HBV截短C基因和前S1基因融合的原核表达质粒pET28a—Ct—preS1,目的基因可高效表达,表达产物主要以包涵体形式存在,Ni^2＋ -NTA纯化可获得目的蛋白,纯化蛋白具有良好的抗原性和特异性．结论：HBV截短HBcAg和preS1抗原融合蛋白可高效表达并得到纯化,为研究新型乙肝疫苗奠定了基础．     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白在pET原核表达系统中的表达与纯化

目的　构建能在pET原核表达系统中表达结核分枝杆菌ESAT -6蛋白的重组表达质粒 ,并对其表达产物进行纯化。　方法　用PCR方法从结核分枝杆菌H3 7Rv基因组中扩增出ESAT -6基因片段 ,克隆至pMD18-T载体 ,PCR筛选阳性克隆并测序 ;用限制性内切酶消化后 ,目的片段亚克隆至表达载体pET -2 3a( ) ,构建pET -ESAT -6重组质粒 ,将其转化入大肠杆菌BL2 1(DE3 ) ;PCR和双酶切鉴定转化菌落 ;将阳性菌株经IPTG诱导 ,SDS -PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达 ;用His·BindTM柱亲和层析法纯化融合蛋白。　结果　从结核分枝杆菌H3 7Rv基因组DNA中扩增出ESAT -6基因片段 ,成功构建重组表达质粒pET -ESAT -6,SDS -PAGE显示表达产物分子量约为 6kD ,经亲和纯化后的ESAT -6重组蛋白纯度高 ,且能被结核病人血清所识别。　结论　利用pET原核表达系统成功表达和纯化了结核分枝杆菌ESAT -6重组蛋白 ,为结核病诊断抗原和疫苗研究奠定了基础。     

重组 CARDs TX 融合蛋白的表达纯化与复性

目的:构建 pET28α-CARDs TX 重组质粒,诱导 CARDs TX 融合蛋白表达,并对其进行纯化与复性研究。方法:将 CARDs TX 基因（MPN 372）克隆入 pET28α 载体,经 8 次点突变获得 pET28α-CARDs TX 重组质粒。转化大肠杆菌 BL21,IPTG 诱导表达。利用亲和层析技术纯化蛋白并通过 SDS-PAGE 和 Wetern Blot 检测 CARDs TX 的表达和纯化效果。利用尿素梯度复性法和扩大体积透析法对蛋白进行复性研究。结果:酶切和测序结果证明 pET28α-CARDs TX 重组质粒的 DNA 序列完全正确,在 BL21 中 CARDs TX 融合蛋白可高效表达,并可获得高纯度目的蛋白。利用扩大体积透析法对目的蛋白复性有较好的效果。 结论:成功构建出 pET28α-CARDs TX 重组质粒,且 CARDs TX 可在大肠杆菌中高效表达,并可获得高纯度的目的蛋白,为深入研究 CARDs TX 的生物学特性奠定了基础。     

重组猪生长抑素的基因克隆、表达与纯化

目的：在大肠杆菌中克隆表达猪重组生长抑素基因,并进行纯化和鉴定．方法：根据GenBank公布的猪生长抑素基因序列,按照大肠杆菌偏爱密码子设计并合成2条DNA单链,退火后获得猪生长抑素基因序列．克隆至原核表达载体pGEX-4T-1质粒中,转化感受态细胞DH5α,经IPTG诱导表达重组融合蛋白并用GST亲和柱对其进行纯化．结果：重组质粒经酶切鉴定和DNA序列测定证明基因完全正确,经IPTG诱导后在大肠杆菌DH5α中得到高水平表达,表达产物经超声和溶菌酶破碎和Glutathione Sepharose4B亲和层析纯化获得重组蛋白．结论：猪生长抑素基因得到了高水平表达,纯化后纯度达到95％以上,为表达产物的大量制备、重组疫苗的进一步优化及在畜牧业生产上的应用研究奠定了基础．     

TAT-SOD融合蛋白表达载体的构建

目的:构建pET28a-TAT-SOD原核表达载体,纯化并测定其活性。方法:PCR法扩增TAT-SOD片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT-SOD重组表达子,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导TAT-SOD融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE电泳鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白,利用SOD活性测定试剂盒测定其活性。结果:构建了高表达重组子pET28a-TAT-SOD,获得了相对分子质量约为25000的具有活性的融合蛋白TAT-SOD,纯度达90%。纯化的蛋白浓度为700mg/L,活性为197.54U/L。结论:成功构建了具有活性TAT-SOD融合蛋白的表达载体。     

结核分枝杆菌RpfA蛋白的表达纯化与鉴定

目的:表达和纯化RpfA融合蛋白.方法:将含有RpfA基因片段的质粒用NdeI与BamHⅠ双酶切,然后将目的基因片段克隆入pcDNA3.1 载体构建重组载体pcDNA3.1 -RpfA,测序正确后再将目的基因片段亚克隆入pET19b原核表达载体并转化E.coli DE3,IPTG诱导表达融合蛋白,Western blot鉴定融合蛋白.在变性条件下Ni2 -NTA 亲和色谱柱纯化目的融合蛋白.结果:目的基因片段测序与Genbank报道一致(切去了5'端99 bp).SDS-PAGE显示,在Mr约为80 ku处有表达条带,Western blot鉴定为(His)6融合蛋白,并与小鼠抗Rv1884和抗Rv2389免疫血清有交叉反应.可溶性分析发现融合蛋白主要以包涵体形式存在.经Ni2 -NTA亲和色谱柱纯化得到了融合有6个组氨酸残基的RpfA融合蛋白.结论:成功构建了pET19b-RpfA表达载体,并在E.coli DE3中高效表达,亲和层析后获得了纯化目的蛋白.     

铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF原核表达载体的构建及表达

目的 克隆铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF基因,构建原核表达载体并鉴定表达。方法 从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA,PCR扩增OprF羧基端,克隆至原核表达载体pET28b中,构建重组表达载体pET28b-F。重组质粒经酶切和序列测定后,转化E.coli BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,进行SDS-PAGE检测。经Ni-NTA亲和层析柱纯化后OprF蛋白免疫BALB/C小鼠,通过杂交瘤方法制备相应单克隆抗体并用ELISA方法进行鉴定。结果 pET28b-F原核表达载体构建成功。重组表达质粒经IPTG诱导后表达外膜蛋白OprF。获得4株高分泌型特异性单克隆细胞株,其中2株单克隆抗体可用于制备双抗体夹心法ELISA试剂盒,检测铜绿假单胞菌。结论 成功克隆铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF羧基端基因片段并在大肠杆菌中进行表达,筛选出特异性抗OprF单克隆抗体。     

人tau融合蛋白的原核表达及纯化

目的构建人His-tau和GST-tau融合蛋白表达质粒并在大肠杆菌中诱导表达及纯化。方法以质粒pEGFP-tau为模板通过PCR扩增出人tau全长cDNA,并构建到原核表达载体pET28a和pGEX-5X-1中,挑选阳性重组子,经限制性内切酶鉴定后转化到大肠杆菌BL21中,然后用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE染色及Western-blot方法鉴定表达的融合蛋白。分别使用His Bind Resin和Glutathione Sepharose 4B与融合蛋白结合来纯化融合蛋白。结果成功构建原核表达质粒pET28a-tau和pGEX-5X-1-tau并在大肠杆菌BL21中诱导其大量表达。经His Bind Resin和Glutathione Sepharose 4B纯化后,可以得到较纯化的His-tau和GST-tau融合蛋白。SDS-PAGE及Western-blot分析显示,特异性的抗tau单克隆抗体(tau-5)所识别的融合蛋白分子量与理论值相近。结论构建了人tau两种原核表达的融合蛋白质粒,并高效表达和纯化了该蛋白,为进一步的tau与其它功能性蛋白的相互作用研究奠定了基础。