E－选择素cDNA克隆和表达

从内皮细胞总ＲＮＡ中用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出Ｅ－选择素ｃＤＮＡ全长编码区，并将其克隆到ｐＵＣ１８载体中，构建了重组质粒ｐＵＣ１８／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ，对此质粒进行了酶切及ＤＮＡ序列分析鉴定。将Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎｃＤＮＡ插入到天坛株痘苗病毒载体ＳｍａＩ位点，构建了表达质粒ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ。采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法，ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ转染ＴＫ－１４３细胞，用ＢｕｄＲ和ＬａｃＺ双筛选，获得带有人Ｅ－选择素ｃＤＮＡ的重组痘苗病毒。经活细胞荧光染色和ＡＰＡＭ检测，重组痘苗病毒能有效地表达人Ｅ－选择素ｃＤＮＡ。     

KGla细胞免疫小鼠脾细胞scFv噬菌体展示文库的构建及其表达

用噬菌体展示技术构建ＫＧｌａ免疫小鼠的脾细胞ｓｃＦｖ表达文库。方法：用人髓系白血病细胞系ＫＧｌａ细胞免疫小鼠,取其脾细胞,ＲＴ－ＰＣＲ扩增ＶＨ和Ｖｋ基因并克隆入呼 体展示表达载体,构建ｓｃＦｖ文库,并测定文库的库容量和ＢｓｔＮ１酶切单个克隆分析文库的多样性。用ＫＧｌａ作为固相抗原,进行四轮吸附－洗脱－富集的筛选,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检验筛选后文库ｓｃＦｖ的呈示表达。结果：文库的库容为３＊１０＾６ｃｆｕ     

E—选择素cDNA克隆和表达

从内皮细胞总ＲＮＡ中用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出Ｅ选择素ｃＤＮＡ全长编码区，并将其克隆到ｐＵＣ１８载体中，构建了组质粒ｐＵＣ１８／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ对此质粒进行了酶切及ＤＮＡ序列分析鉴定，将Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎｃＤＮＡ插入一以天坛株痘苗病毒载体ＳｍａＩ位构建了表达质粒ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ，采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法，ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ转染ＴＫ＾－１４３细胞，用     

生长激素诱导心肌细胞外信号调节酶激活及其上游调控

目的和方法：用生长激素（ＧＨ）刺激培养的新生大鼠心肌细胞,用含ＭＢＰ凝胶分离法测定细胞外信号调节酶（ＥＲＫｓ）活性,用Ｗｈａｔｍａｎ Ｐａｐｅｒ Ｆｉｌｔｅｒ法测定Ｒａｆ－１活性,观察ＧＨ是否激活心肌细胞Ｒａｆ－１－ＥＲＫ级联反应。观察负显突变Ｒａｓ质粒（Ｄ．Ｎ．Ｒａｓ）与ＨＡ－ＥＲＫ２质粒复合转染或有关抑制剂对ＧＨ诱导ＥＲＫ激活的影响。结果：ＧＨ以时间和浓度依赖性方式激活心肌细胞ＥＲＫ１和ＥＲＫ     

人树突状细胞cDNA质粒文库的构建及其大规模随机测序体系的 …

目的：建立人树突状细胞的ｃＤＮＡ文库。通过大规模随机测序克隆免疫新分子,方法：来源于正常人外周血的单核细胞,体外经ＧＭ－ＣＳＦ和ＩＬ－４培养,扩增出高纯度的ＤＣ,抽提纯化ｍＲＮＡ,转录成ｃＤＮＡ,定向插入ｐＳＰＯＲＴ２．０载体,建立人ＤＣ的ｃＤＮＡ质粒文库;用ＡＢＩ３７７全自动测序仪对该文库进行随机测序,将得到的ＥＳＴ在Ｓｕｎ－Ｅ４５０服务器中与ＥＭＢＬ及Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ数据库进行同源性比较,筛     

单核细胞趋化蛋白－1在大肠杆菌中的表达

将人单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）的ｃＤＮＡ插入融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１中，构建成质粒ｐＧＥＸ／ＭＣＰ转化大肠杆菌ＪＭ１０９，经ＩＰＴＧ诱导后合成ＧＳＴ－ＭＣＰ－１融合蛋白。用１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测在３０ｋＤ左右有新生蛋白条带出现，表达量约占菌体总蛋白的３１．７％。趋化实验证明，该产物具备明确的单核细胞趋化活性。     

恶性疟原虫海南分离株FCC1／HN有性期特异抗原Pfs48／45基 …

采用基因工程技术,将编码恶性疟原虫有性期特异抗原Ｐｆｓ８／４５的基因克隆到真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３,并进行ＤＮＡ序列测定,再通过磷酸钙－ＤＮＡ共沉淀转化法将重组质粒ｐｃＤＮＡ３－ｐＦＳ４８／４５导入Ｈｅｌａ细胞,建立稳定分泌Ｐｆｓ４８／４５蛋白的阳性克隆株,结果显示,我国海南ＦＣＣ１／ＨＮ株Ｐｆｓ４８／４５抗原基因序鲁与ＨＦ５４株者高度同源,提示该基因在不同虫株高度保守,是研制疟疾疫苗的理想靶抗原     

中国版纳猪MHCI类P1分子全长的原核表达与纯化

目的：获得原核表达的中国版纳猪ＳＬＡＩ类Ｐ１蛋白质分子。方法：ＰＣＲ扩增去信号肽的ＳＬＡＩ类Ｐ１ｃＤＮＡ序列，亚克隆至ｐＧＥＭＴ载体，测序。将亚克隆的Ｐ１　ｃＤＮＡ片段插入表达载体ｐＥＴ４２ｂ（＋），构建重组表达质粒ｐＥＴ－４２ｂ（＋）／ｓｌａ－ｐｌ，转化Ｅ·ｃｏｌｉ表达菌 ＢＬ２１－ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）－ＲＩＬ，ＩＰＴＧ诱导 Ｐ１－８ ｘ ｈｉｓ融合蛋白表达，经包涵体洗涤，８ ｍｏｌ／Ｌ尿素变性溶解，Ｎｉ２＋亲和层析，梯度透析后，定量保存。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ鉴定目的蛋白的表达与纯化。结果：目的蛋白（分子量３９．５ ｋＤ）表达量占细菌总蛋白 １５％，每升表达菌获得纯度９５％的目的蛋白 ４０ ｍｇ～６０ｍｇ。结论：成功建立猪 ＳＬＡ分子全长原核表达、纯化体系，为建立间接识别猪移植抗原ＳＬＡＩ类分子的人Ｔ细胞系及表位分析打下基础。     

人细胞间粘附分子1基因功能区Ⅰ,Ⅱ的克隆及高效表达

用ＰＣＲ聚合酶链反应技术从人细胞间粘附分子１（ＩＣＡＭ－１）ｃＤＮＡ中获取了其编码细胞外氨基端功能区Ⅰ、Ⅱ１８５个氨基酸的ＤＮＡ序列，构建了重组质粒ｐＥＴ／ｒｓＩＣＡＭ－１。经转化宿主菌，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，薄层扫描和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ，证明目的基因在大肠杆菌中获得了高效表达。     

美蓝与消炎痛对高血压大鼠内脏血管内皮依赖性舒张减弱的影响

本文应用双标本微量生物测定法观察自发高血压大鼠（ＳＨＲ）及其常压对照（ＷＫＹ）大鼠肠系膜动脉Ａｃｈ内皮依赖性舒张（ＥＤＲ）的变化，并对其机制进行初步探讨，结果发现：ＳＨＲ的ＡｃｈＥＤＲ显著弱于ＷＫＹ者；鸟苷酸环化酶抑制剂美蓝（５×１０－５ｍｏｌ／Ｌ）可明显减弱ＳＨＲ与ＷｋＹ的ＡＣｈＥＤＲ，此时ＳＨＲ的舒张仍明显弱于ＷＫＹ。灌流消炎痛（５×１０－５ｍｏｌ／Ｌ）后，卒中易感型自发高血压大鼠（ＳＨＲｓｐ）的ＡｃｈＥＤＲ增强，ＷＫＹ的舒张反应几乎不变。此时ＳＨＲｓｐ与ＷＫＹ的肠系膜动脉的ＡｃｈＥＤＲ的差异消失。以上结果支持高血压的内脏血管ＥＤＲ减弱的结论，并且可以认为乙酰胆碱（Ａｃｈ）激发的血管内皮舒张因子（ＥＤＲＦ）通过ｃＧＭＰ环节的功能发生变化。以及血管内皮细胞释放的收缩因子（ＥＤＣＦ）增多是这一减弱的原因之一。     

Tec家族蛋白酪氨酸激酶ItkPH结构域的克隆鉴定及其在酵母双杂交系统中自激活作用的检测

Tec家族蛋白酪氨酸激酶Itk特异地表达于T细胞 ,对T细胞的成熟与活化等具有很大影响 ,因而可能在T细胞的信号转导过程中处于重要位置。我们利用PCR的方法从含Itk基因全长cDNA的pME18S EMT质粒中扩增出其PH结构域基因片段 ,并将其克隆入酵母双杂交载体pLexA ,经测序鉴定正确 ,转化酵母细胞EGY48(p8op lacZ ) ,挑取阳性克隆 ,利用液相法和平板法检测 ,证实PH结构域无自激活作用 ,且对宿主菌无毒性作用 ,可用于T细胞cDNA文库的筛选 ,捕捉与之相互作用的蛋白。     

酵母双杂交筛选与转录因子ZNF580相互作用的蛋白

目的: 寻找可能与锌指转录因子ZNF580存在相互作用的蛋白。方法: 以ZNF580基因开放阅读框作为模版,PCR扩增后连接入酵母表达质粒pGB。诱饵质粒pGB-ZNF580经测序验证后转化酵母菌株Y190,人胎脑cDNA文库亦转化到能稳定表达诱饵蛋白的Y190酵母菌株中,并铺到含有营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-His/-Leu)的培养皿上进行初步筛选。所得阳性克隆再进行β-半乳糖苷酶克隆转移滤纸实验进一步去除假阳性。随机挑取部分阳性克隆,逐一转化入含有诱饵质粒的Y190 酵母菌进行一对一验证。分离阳性克隆质粒测序,并应用生物信息学方法分析阳性克隆cDNA编码的蛋白。结果: 确定了14种与ZNF580可能存在相互作用的蛋白。结论: 初步探讨了ZNF580的功能及其可能参与的信号转导通路,为进一步研究转录因子ZNF580参与动脉粥样硬化的机制奠定了实验基础。     

Interaction between two domains of the P. yoelii MSP-1 protein detected using the yeast two-hybrid system

Several model systems of plasmodia have demonstrated the potential of the merozoite surface protein, MSP-1, to induce protective immunity. However, little is known about the function of this protein or its interaction with other surface molecules that may also serve as immunological targets. To identify potentially significant inter- and intra-molecular interactions involving MSP-1, we have utilized the yeast two-hybrid system. A cDNA activation domain library was constructed from the erythrocytic stages of the murine malarial parasite Plasmodium yoelii yoelii 17XL. A 795 bp region of Py17XL MSP-1 (bait), homologous to the Plasmodium falciparum MSP1(33) fragment, was inserted into a Gal4p DNA binding domain vector and used to screen the activation domain library (target). Several randomly selected clones that demonstrated bait-target interaction were found to express overlapping regions of Py17XL MSP-1. Deletion constructs further localized the peptide fragments retaining interaction indicating that a region within the MSP-1(38) fragment interacts with the MSP-1 bait domain. Subsequent studies confirmed this interaction, as both peptides were co-precipitated from cell lysate by a peptide tag-specific antibody. It was observed that the interaction of these two fragments significantly increased the half-life of the MSP-1(38) within yeast cells. The specific interaction described here demonstrates the potential of this approach to elucidate additional inter- or intra-molecular interactions of Py17XL MSP1 and other malarial proteins.     

酵母双杂交系统筛选CLN8P相互作用蛋白

目的：应用酵母双杂交系统筛选CLN8P相互作用蛋白质,通过对相互作用蛋白质的筛选及研究,探讨CLN8的功能,为NCL8和NCLs疾病群的发病机制研究提供线索,并为疾病的蛋白质相互作用网络提供资料。方法 应用酵母双杂交技术,以pLexA-CLN8为诱饵质粒筛选人胎脑cDNA文库,得到Leu+LacZ+阳性克隆,进一步进行验证,并对验证后的阳性克隆的外源性片断进行测序及同源性分析。结果 从人胎脑cDNA文库中筛选得到60个Leu+LacZ+阳性克隆;将获得的具有外源性片段的文库质粒与诱饵质粒一对一重新转入酵母体内对相互作用进行验证,共获得阳性克隆22个;对验证后阳性克隆测序并进行同源性分析,共获得不同的候选基因序列10个。结论 应用酵母双杂交系统,共筛选得到10个不同的基因,其编码蛋白与CLN8P有相互作用,可能与NCLs 发病机制相关。     

酵母双杂交技术筛选小鼠脑cDNA文库中鼠巨细胞病毒即刻早期蛋白M122相互作用蛋白的研究

目的 应用酵母双杂交技术筛选小鼠脑cDNA文库中与鼠巨细胞病毒即刻早期蛋白M122相互作用的宿主因子,为进一步研究巨细胞病毒的致病机制奠定实验基础.方法将诱饵质粒pGBKT7-M122转化酵母菌AH109,Western blot检测诱饵蛋白在酵母细胞中的表达.阳性重组AH109菌株与小鼠脑cDNA文库进行配合,在色氨酸、亮氨酸、组氨酸和腺嘌呤缺陷培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有Ⅹ-α-gal的SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上进行筛选,提取阳性酵母菌质粒,转化大肠杆菌后提取质粒测序,对测序结果进行序列比对和分析.将阳性文库质粒与诱饵质粒共同转化酵母AH109感受态细胞,重新验证其在酵母中的相互作用,同时阳性文库质粒与空载体pGBKT7亦被用同样的方法转入AH109感受态细胞,以排除阳性文库质粒的自激活作用.结果筛选出与M122蛋白相互作用的21种已知基因编码的蛋白质和3种未知基因编码的蛋白,其中21种已知蛋白分别为:突触融合蛋白8(syntaxin 8,Stx8)、磷酸葡萄糖变位酶2(phosphoglucomutase 2,Pgm2)、Shaker型电压依赖性钾通道的β1亚单位(potassium voltage-gated channel,shaker-related subfamily,beta member 1,Kcnab1)、19型胶原蛋白(collagen,type ⅪⅩ,alpha 1,Col19a1)、古蛋白1(archain 1,Arcn1)、胞嘧啶核苷酸激酶(cytidylate kinase,Cmpk)、热休克蛋白DnaJ同系物A亚家族成员1[DnaJ(Hsp40)homolog,subfamily A,member 1,Dnaja1]、Na+、K+ATP转运酶β3亚单位(ATPase,Na+/K+ transporting,beta 3 polypeptide,Atp1b3)、SH3结构域GRB2样相互作用蛋白1[SH3-domain GRB2-like(endophilin)interacting protein 1,Sgip1]、锚蛋白重复域17(ankyrin repeat domain 17,Ankrd17)、无义介导的mRNA 降解因子Smg-7同系物(Smg-7 homolog,nonsense mediated mRNA decay factor,Smg7)、精子相关抗原9(sperm associated antigen 9,Spag9)、FK506结合蛋白1A(FK506 binding protein 1a,Fkbp1a)、MYST组蛋白乙酰转移酶4[MYST histone acetyltransferase(monocytic leukemia)4,Myst4]、透明质酸和蛋白多糖连接蛋白1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1,Hapln1)、自噬相关蛋白3(autophagy-related 3,Atg3)、精氨酸/色氨酸富集的剪切因子5(splicing factor,arginine/serine-rich 5,Sfrs5)、C3HC型锌指蛋白(zinc finger,C3HC-type containing 1,Zc3hc1)、硫氧还蛋白相关的跨膜蛋白1(thioredoxin-related transmembrane protein 1,Txndc1)、接头蛋白复合物AP-1亚单位(adaptor protein complex AP-1,gamma 1 subunit,Aplg1)和Cul1蛋白(cullin 1,Cul1).回返验证实验进一步证实这些蛋白与M122蛋白能够在酵母细胞AH109发生相互作用,但Aplg1和Cul1被证实具有自激活作用.结论 筛选到的其中19种已知基因编码的蛋白可能与巨细胞病毒的致病机制相关,但仍需进一步的验证.     

利用酵母双杂交技术筛选鉴定STCH与RanBP9的相互作用

以人应激和分子伴侣蛋白(STCH)为诱饵蛋白,利用酵母双杂交技术在高严格条件下筛选人脑cDNA文库。在SD/-4培养基上共获得156个阳性克隆,将酵母菌扩增后抽提质粒,转化大肠杆菌,进行序列分析,并经过回复杂交验证,潜在的与STCH相互作用的蛋白有:VDAC、MBP2、ZNF251、RanBP9、Phosophate glycolase、β-tubulin、up1、up2和WW adaptor蛋白。基于各候选蛋白与神经系统疾病的关系,选择RanBP9作进一步验证实验。经体外GST-Pulldown和体内免疫共沉淀实验证实RanBP9和STCH能够相互作用,明确RanBP9的羧基端为相互作用的最小功能域。此结果为我们进一步揭示STCH作用的分子机制提供了线索。     

乙型肝炎病毒e抗原基因作为酵母双杂交体系结合域载体的构建及表达

目的　以乙型肝炎病毒e抗原 (HBeAg)全基因为外源片段 ,构建酵母双杂交体系中结合域载体 ,研究其在酵母细胞中的表达 ,排除自身激活作用及毒性作用 ,验证其适用性。方法　根据报道序列设计、合成HBeAg全基因巢式引物 ,取患者血清 ,通过PCR方法分离HBeAg全基因片段 ,克隆入T载体 ,酶切鉴定及序列测定后 ,克隆入酵母双杂交体系结合域载体pGBKT7,构建pGBKT7 eAg载体。再次酶切鉴定阳性克隆后转入酵母 ,验证毒性作用 ;通过Western blot实验证实外源基因在酵母中的表达 ;并进一步验证自身激活作用。结果　由血清中分离的及 2次酶切鉴定的片段大小分别为 6 5 7bp和 6 39bp ,与预期大小一致 ;序列测定与报道的HBV分离株核酸及氨基酸同源性分别为96 %和 10 0 % ;转人酵母后无毒性及自身激活作用 ;Western blot实验出现阳性与预期大小 (2 4 .3× 10 3)一致的条带。结论　pGBKT7 eAg载体在酵母细胞中表达出融合蛋白 ,进一步验证无自身激活及毒性作用 ,此载体构建成功 ,适用于酵母双杂交体系。     

HCV核心蛋白结合蛋白基因6的克隆

目的：克隆与丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白结合的肝细胞中的未知蛋白基因。方法：应用酶母双杂交系统，构建丙型肝炎病毒核心蛋白诱铒质粒，转化酵母AH109后与含文库质粒的酵母Y187进行配合，在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选。筛选出30个克隆，既能在四缺营养缺陷培养基上生长(SD/Trp-Leu-Ade-His）又能在涂有x-α-gal的四缺培养平皿上长出蓝色菌落，提取此酵母克隆的质粒，转化大肠埃希菌后进行测序，进行生物信息学分析。结果：分析结果显示，其中6号克隆的测序结果与Genbank中的2个未知功能序列有98％的同源性，初步证明了此基因与丙型肝炎病毒核心蛋白有结合性。结论：丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白肝基因克隆成功。     

Functional analysis of the yeast genome: use of two-dimensional gel electrophoresis to detect genes in randomly cloned DNA sequences

Summary Genes are overexpressed when present in yeast cells on multicopy plasmids. Taking advantage of the protein amplification which results from this overexpression, a method has been developed for large scale detection of yeast genes on randomly cloned DNA sequences. It is based on the analysis, by two-dimensional gel electrophoresis, of the proteins from yeast cells transformed with a yeast genomic DNA library constructed in a multicopy vector. We demonstrate here the applicability of this method for exploring the yeast genome. In addition, we report results which suggest that this method may also be useful for detecting regulatory genes.