戊型肝炎病毒结构区OFR2基因在毕赤酵母中的分泌型表达

为寻求新型表达系统来研制戊型肝炎基因工程疫苗，利用甲醇营养型酵母Pichia pastoris表达系统表达戊型肝炎病毒（HEV）结构区ORF2 1．3kb基因。对构建的酵母分泌型表达载体pHIL-S1/HEV和pPIC9/HEV重组体，酶切线性化后转化入GS115酵母菌，经表型鉴定，PCR扩增筛选阳性克隆，对不同表型，不同表达载体的重组株用含甲醇的培养基诱导表达，ELISA及SDS－PAGE筛选表达活性菌株，Western-blot证实表达蛋白与HEVORF2单克隆抗体有特异性反应。得到有效表达HEVORF2蛋白的菌株并初步优化表达条件。     

Exendin-4真核表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

目的:构建Exendin-4基因真核表达载体,并在巴斯德毕赤酵母GS115中进行表达,为大量获得Exendin-4奠定基础。方法:采用重叠聚合酶链反应法扩增出Exendin-4的完整序列,将其亚克隆到表达载体pPIC9K上,得到重组质粒pPIC9K-Exendin-4。重组质粒经SacI线性化后用电穿孔法导入到GS115中,经组氨酸缺陷筛选、G418高拷贝筛选及摇瓶表达筛选,甲醇诱导表达后用凝胶电泳法分析Exendin-4的表达。结果:序列测定结果表明成功地构建了毕赤酵母表达载体,电泳结果证明Exendin-4在毕赤酵母中能高效表达。结论:实现了Exendin-4单体在毕赤酵母中的表达,为Exendin-4的规模化生产奠定了基础。     

多拷贝水蛭素基因在毕赤酵母中的分泌型表达

目的:通过多拷贝克隆技术实现水蛭素(Hirudin)基因在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达.方法:利用基因重组技术,从pPIC9-Hirudin中扩增α-facor-Hirudin插入到载体pA0815中,并构建pA0815-(α-Hirudin)n多拷贝重组质粒,转化毕赤酵母GS115后进行诱导表达,并鉴定表达产物活性.结果:PCR证实成功构建了水蛭素多拷贝毕赤酵母表达载体pA0815-(α-Hirudin)n,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实能成功高效分泌重组水蛭素,活性测定表明表达的水蛭素有良好的抗凝血活性.结论:成功构建了分泌型水蛭素多拷贝质粒,筛选出多拷贝稳定整合表达菌株,成功表达出具有抗凝血活性的1 600 ATU/mL重组水蛭素,为大规模表达纯化水蛭素蛋白及其临床应用奠定了基础.     

D-氨基酸氧化酶在巴斯德毕赤酵母中的表达研究

用分子生物学方法获得了D-氨基酸氧化酶(DAAO)的表达质粒(pPIC3.5k-DAAO),用其电转化巴斯德毕赤酵母GS115获得重组菌,经筛选获得高表达菌株PD27,并对其高密度培养和诱导条件进行了优化.PD27工程菌经250ml摇瓶发酵得到的DAAO活力达到2500～2600IU/L,在14L发酵罐中的表达水平优于其它表达系统.     

幽门螺杆菌多表位肽在毕赤酵母中的分泌表达

构建分泌表达幽门螺杆菌多表位肽CTB-UE的毕赤酵母。以原核表达载体pET-22b-CTB-UE为模板,通过PCR扩增得到融合His-tag的ctb-ue基因序列,将其插入酵母表达载体pPIC9K,得到重组表达载体pPIC9K-CTB-UE。重组表达载体pPIC9K-CTB-UE经内切酶Sal I线性化后,电击转化进毕赤酵母GS115,通过组氨酸缺陷性MD平板筛选重组菌株,G418抗性筛选多拷贝转化子,阳性转化子经PCR鉴定,摇瓶发酵表达,取上清经过超滤浓缩,Ni-NTP亲和层析纯化,透析脱盐,SDS-PAGE检测,Western blot验证。结果获得了整合有ctb-ue基因的毕赤酵母,诱导后分泌表达的CTB-UE蛋白能够与His-tag抗体发生特异性反应。成功构建了分泌型毕赤酵母GS115(pPIC9K-CTB-UE),能分泌表达幽门螺杆菌多表位肽CTB-UE。     

重组人可溶性TRAIL在毕赤酵母中表达与纯化及其抗肿瘤细胞活性

目的研究重组人可溶性TRAIL(sTRAIL)蛋白的表达和纯化,以及对HepG2细胞增殖与凋亡的影响。方法将人sTRAIL基因插入毕赤酵母表达载体pPIC9中,构建甲醇酵母分泌型表达载体pPIC9-sTRAIL,电击转化至GS115(his4),MD平板筛选出阳性菌株。对工程菌株发酵培养基成分、pH、甲醇浓度、诱导表达时间等条件进行优化,并初步分析重组sTRAIL蛋白的体外抗肿瘤活性。结果工程菌株在BMMY培养基(pH6.0)、1%甲醇条件下诱导表达48h目的蛋白浓度最高可达(58.7±2.4)mg/L。重组人sTRAIL蛋白能抑制HepG2细胞的增殖、诱导HepG2细胞的凋亡。结论优化了人sTRAIL的表达和纯化工艺条件,所生产的sTRAIL可用于抗肝癌新药的开发。     

N-糖基化IL-24的表达及体外诱导肿瘤细胞凋亡的研究

目的构建IL-24基因的真核表达载体,在毕赤酵母GS115中高效表达,研究重组N-糖基化IL-24蛋白体外诱导肿瘤细胞凋亡的活性。方法借助过渡质粒α/pUC18,将IL-24基因插入到质粒pPIC9K的BamHⅠ和EcoRⅠ之间,构建重组质粒IL-24/pPIC9K,转化毕赤酵母GS115分泌表达,Tricine-SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白,ELISA检测蛋白表达量,糖苷酶PNGaseF分析IL-24糖基化形式和程度。MTT法和形态学分析重组IL-24诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡的活性。结果成功构建重组表达质粒IL-24/pPIC9K,IL-24在毕赤酵母最高表达量为(81.31±14.46)mg·L-1。约70%的IL-24发生了N-糖基化。重组IL-24诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡,对正常人肺成纤维细胞NHLF没有影响。N-糖基化IL-24对MCF-7抑制率约高于去糖基化IL-24。结论毕赤酵母分泌形式的表达和适度的糖基化修饰都有利于目的蛋白IL-24的生物学活性,为后续的研究提供基础。     

葡激酶在毕赤酵母中的表达及纯化

目的探索葡激酶基因在毕赤酵母中的表达和纯化方法。方法根据毕赤酵母的偏性合成了葡激酶基因,克隆到分泌型酵母表达载体pPIC9K中,重组载体线性化后,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。应用DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和Sephacry1 S-200凝胶过滤层析法纯化表达产物,采用溶圈法对纯化产物进行生物学活性测定。结果葡激酶在毕赤酵母中GS115的表达量约站总蛋白的45%;表达产物经DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和SephacrylS-200纯化后纯度达到95%;测得其比活为5.2×10^4AU/mg。结论利用毕赤酵母成功进行了重组葡激酶基因的表达及其表达产物的纯化。     

重组rPA基因在毕赤酵母细胞中的胞内表达研究

目的构建含rPA全长基因的重组酵母胞内表达质粒pPIC9K rPA ,并在毕赤酵母中进行表达。方法用限制性内切酶BamHI和NotI将含有rPA全长基因的质粒pJZ1 6双酶切后 ,克隆至酵母表达载体pPIC9K中 ,构建酵母重组表达质粒。rPA基因经DNA序列测定准确无误。通过电穿孔法转染毕赤酵母菌GS1 1 5 ,PCR鉴定阳性酵母转化子 ,将rPA基因整合入酵母基因组DNA ,在毕赤酵母中实现了胞内非融合表达。表达产物进行SDS PAGE、Western blots以及溶纤维蛋白活性检测。结果表达产物以胞内包涵体的形式存在 ,未糖基化。SDS PAGE结果显示表达蛋白质的相对分子量约为 39kD。Western blots检测表明表达蛋白质能与单克隆抗体发生特异性反应。包涵体经 8mol L脲溶液溶解后 ,有明显的溶纤维蛋白活性。结论在毕赤酵母中成功地实现了rPA重组蛋白的胞内表达     

改造的sTRAIL基因在重组毕赤氏酵母菌中的表达及活性分析

利用甲醇毕赤氏酵母系统对改造的TRAIL基因进行优化表达研究及产物活性分析,确定改造后的基因表达量是否提高。应用电转化技术将4种重组表达载体转化毕赤氏酵母菌GS115,经Zeocin抗生素筛选、PCR检测获得阳性酵母工程菌,采用摇瓶发酵及SDS-PAGE进行高效表达菌株的筛选,经CM-柱层析、Western blot及MTT法对重组蛋白进行初步纯化、抗原活性检测和生物学活性分析,确定了最佳摇瓶发酵条件:培养基最适pH值5.5~6.5,最佳甲醇诱导浓度为1%,最适甲醇诱导周期为96h。筛选到高效表达菌株pPICZα-A-sTRAIL/GS115、pPICZα-A-sTRAILK/GS115、pPICZα-A-sTRAILA/GS115、pPICZα-A-sTRAILAK/GS115,其表达量分别达到67,113.4,98,145mg/L,改造后的TRAIL具有抗原活性和生物学活性。对TRAIL基因的改造可以提高其在甲醇毕赤氏酵母系统中的表达。     

人可溶性血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体Flt-1基因在甲醇酵母中的克隆表达

应用RT－PCR技术，从人脐静脉内皮细胞中扩增出编码Flt-1，胞外区前四个结构域的基因片段，将Flt-1基因片段连接到表达载体PIC9K上，获得重组质粒pPIC9K-F，将重组质粒转化到甲醇酵母Pichia pastoris GS115中，得到基因工程菌株P.pastoris(pPIC9K-F)，对培养上清进行SDS－PAGE和Western blot分析。结果显示在74.2ku处有阳性条带出现，表明sFLT-1在甲醇酵母中获得了成功表达。受体配基结合实际显示表达产物与VEGF可特异性结合，表明其具有配基结合生物活性。     

B36-04通过含胶粘红酵母环氧化物水解酶的重组巴斯德毕赤酵母生产S-氧化苯乙烯Lee EY等Enzyme MicrobTechnol

构建了一株携带来源于胶粘红酵母的编码环氧化物水解酶(EH)基因的重组巴斯德毕赤酵母，可以对一些苯乙烯氧化物的外消旋混合物对映体选择性水解以生产Ｓ－氧化苯乙烯。EH基因是通过对胶粘红酵母的ＣDNA文库的PCR扩增获得的，并整合到巴斯德毕赤酵母的染色体DNA上，在AOX启动子的调控下表达EH。     

T4溶菌酶在毕赤酵母中的诱导表达及抑菌活性测定

目的利用毕赤酵母诱导表达T4溶菌酶蛋白并测定其抗菌活性。方法T4溶菌酶（T4lysozyme）基因以N端融合的方式被准确插入到质粒pPIC9K的EcoR I-Not I位点内,得到分泌型重组表达载体 pPIC9K-T4L。该载体首先经限制性内切酶Sal I酶切,进而采用电击方法将线性化的重组质粒DNA导入到毕赤酵母中。经过梯度筛选得到多个单拷贝和多拷贝转化重组子。随机挑取部分重组子PCR扩增阳性克隆,经菌体培养和甲醇诱导后获得了分泌表达,表达产物存在于培养上清液中。结果表达蛋白经琼脂孔扩散抗菌实验显示抑菌圈明显;重组蛋白对金黄色葡萄球菌与肺炎链球菌均具有显著抑制作用;多拷贝与单拷贝重组表达子没有抗菌活性差异与蛋白表达量的差异;加热煮沸对于T4溶菌酶蛋白的抗菌活性无明显影响。结论T4溶菌酶在毕赤酵母中得以成功诱导与表达;表达产物不受拷贝数影响并具热稳定性。     

猪囊尾蚴cCl亚单位疫苗毕赤酵母高表达体系的优化

目的 优化猪囊尾幼cCl亚单位疫苗毕赤酵母表达系统。方法 毕赤酵母转化菌在BMMY、BMM、MM及各加1％酪蛋白水解物(CA)的诱导培养基中经0．5％甲醇诱导表达后，上清液行SDS—PAGE。结果 高拷贝毕赤酵母转化菌SMDll68的表达水平高于酵母转化菌GS115，Mut^s型比Mut 型表达量高，表达水平与拷贝数呈正相关，即拷贝数越高，表达量也越高；在诱导培养基BMMY中的表达水平明显高于其它诱导培养基；阴性对照菌末见目的表达条带。结论 猪囊尾蚴cCl亚单位疫苗在毕赤酵母高表达系统中得到优化，为大量制备生产打下了基础。     

重组人白介素-18在毕赤酵母中的表达和纯化

构建了含重组人白介素-18(rhIL-18)基因的酵母表达载体pPIC9k-il18,利用电转化法将pPIC9k-il18线性化质粒转入毕赤酵母GS115中,筛选出高表达菌株.通过离子交换亲和层析和分子筛凝胶层析两步纯化,可获得rhuIL-18试剂品HPLC纯度>97%,纯化得率49mg·L-1发酵液.IL-18具有促进KG-1细胞产生IFN-γ的活性,并且产生的IFN-γ的量与IL-18的量成剂量依赖性,测定产生IFN-γ量与商业化的rHu-IL18标准品相当.本研究为进一步规模化制备rHu-IL18奠定了基础.     

人sCR1酵母分泌型表达载体构建及其高拷贝转化子的快速筛选

目的采用酵母分泌型载体表达人可溶性补体受体1型(sCR1),研究人sCR1高拷贝重组阳性转化子的快速筛选及鉴定。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9k-sCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化。结果获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCR1,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性。     

重组鼠干扰素α4在毕赤酵母中的表达与鉴定

目的 本研究旨在获得稳定、高表达的重组鼠干扰素α4.方法 通过密码子优化对天然的鼠干扰素α4进行优化,采用全基因合成方法合成了rmIFNα4,构建了pPIC9k-rmIFNα4质粒,DNA测序无误后转至毕赤酵母GS115中,经蛋白表达筛选获得了稳定、高表达的基因工程菌.经离子交换柱层析及疏水凝胶层析纯化可获得rmIFN...     

用酵母载体pPIC9k重组构建表达sCR1

目的采用酵母细胞分泌型载体pPIC9k表达人可溶性补体受体(sCR1),研究重组人sCR1融合蛋白的体外生物学活性。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9k-sCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western Blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行生物学活性鉴定。结果获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCR1,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western Blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。     

Kex2蛋白酶在毕赤酵母中的表达、纯化和性质研究

目的研究Kex2(EC.3.4.21.61)蛋白酶在毕赤酵母中的重组表达、纯化和部分性质。方法 Kex2基因整合进p PIC9K质粒中,通过电转构建重组毕赤酵母GS115-Kex2,G418筛选多拷贝子,甲醇诱导得到目的蛋白。通过强阴离子交换层析Q-FF对重组蛋白进行纯化,对纯化后的蛋白进行酶学性质研究。结果通过毕赤酵母表达可以得到具有活性的重组Kex2蛋白酶,以Boc-Gln-Arg-Arg-p NA(叔丁氧羰-谷氨酰胺-精氨酸-精氨酸-对硝基苯胺,Boc-QRR-p NA)为底物检测酶的活性,发酵外液活性达270U/L,SDS-PAGE检测目的蛋白的分子量为67k Da,经Q-FF纯化后,目的蛋白的活性回收率为84%。重组Kex2蛋白酶在p H 5.0~6.0之间稳定,p H 9.0时活性最高。在25℃,p H 5.0条件下放置12 h活力可保持88.2%。以Boc-QRR-p NA为底物,测得重组Kex2蛋白酶的Km值为0.0167 mmol/L,Vmax值为333.3μmol/min。结论利用毕赤酵母可成功表达分泌Kex2蛋白,经Q-FF纯化后可得到较纯的Kex2蛋白酶。     

鲑鱼降钙素前体多肽在毕赤酵母中的分泌表达

将鲑鱼降钙素前体多肽（sCTGly）基因克隆到表达载体pPIC9K上,然后转化毕赤酵母营养缺陷型菌株GS115,利用酿酒酵母分泌信号肽α-factor将目的产物分泌到发酵上清液中.经组氨酸缺陷筛选、G418高拷贝筛选及摇瓶表达筛选,获得较高水平表达菌株GS115-sCTGly.酶联免疫反应检测上清液中酶的活性,表明sCTGly产量在10mg/L以上.通过5L发酵罐发酵条件优化,表达水平提高到200mg/L上.