ctxB和ureB抗原表位的融合表达及其免疫学活性

为研制新型有效的幽门螺杆菌疫苗，设计了一个由ctxB(去除信号肽部分)和ureB抗原表位融合的新型分子。PCR扩增霍乱弧菌的ctxB基因，插入到质粒pEl32a上，再将化学合成的ureB抗原表位序列(编码的氨基酸为CHHLDKSIKEDVQFAQSRI）连接到ctxB下游，融合基因命名为ctube。将含有融合基因的pET32a转化到大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达后SDS-PAGE测定融合蛋白ctube的分子质量，ELISA法检测ctube对神经节苷脂GM1的结合活性，Western blotting检测对兔抗幽门螺杆菌(Hp)多抗的结合活性。序列分析结果表明，ctube基因全长387bp，编码129个氨基酸，其中ctxB的密码子与GenBank上的序列同源性达到99％。转化后的大肠杆菌BL21（DE3)经IPTG诱导表达后，产生了一个分子质量为2．5万的蛋白，经肠激酶酶切后的产物为ctube。ELISA试验和West Blotting表明，ctube与神经节苷脂性GM1、兔抗Hp多抗均具有很好的结合活性，有希望成为一个具有抗幽门螺杆菌感染的新的活性分子。     

幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白分子内佐剂融合疫苗的构建、纯化及活性研究

目的构建幽门螺杆菌（HP）中性粒细胞激活蛋白基因（napA）与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（heat-labile enterotoxin B subunit，LTB）的分子内佐剂融合蛋白疫苗，并通过口服免疫小鼠研究其抗原性，为疫苗的开发奠定基础。方法利用分子克隆技术构建携带naDA—LTB融合基因的重组原核表达质粒pET-22b—napA—LTB，转化E、coli BL21（DE3），进行原核表达，重组表达蛋白采用亲和层析柱Chelating Sepharose进行纯化，Tris—Tricine电泳和Western blot鉴定，GM1-EUSA检测rNAP-LTB与神经节苷脂的结合。口服免疫BALB／c小鼠，检测重组融合蛋白的抗原性。结果重叠延伸PCR扩增出了约760bp的napA—LTB融合基因，其核苷酸序列与GenBank公布的相关序列一致。重组融合蛋白以可溶和包涵体两种形式表达，表达量约占细菌总蛋白的30％，Tris—Tricine初步测定目的蛋白的相对分子质量（Mr）约29000，纯化后纯度大于90％。Western blot检测其具有良好的抗原性。该重组蛋白保持了与GM1神经节苷脂结合的生物学活性。动物实验表明，分子内佐剂疫苗口服免疫小鼠后血清特异性IgG，IgA和胃黏液、肠黏液的抗原特异性sIgA抗体显著高于无佐剂单一亚单位疫苗。结论所获得的重组融合蛋白具有良好的抗原性和黏膜佐剂活性，为进一步的疫苗研究奠定了基础。     

前列腺特异膜抗原基因的表达

目的克隆前列腺特异膜抗原（PSMA）基因的编码区序列,构建PSMA真核表达载体。方法用RT．PCR方法扩增前列腺癌组织标本中的PSMAeDNA序列,并将其克隆至真核表达载体pcDNA3．0。用脂质体转染法,把pcDNA3．0-PSMA转染哺乳动物细胞,鉴定PSMA蛋白的表达。结果两条引物之间的片断长度为2279bp,与预期长度一致。将克隆的编码区序列与Genebank的PSMA序列同源性为99．7％;表达的蛋白质为膜蛋白,免疫印迹表明表达蛋白质的相对分子质量为100kD。结论扩增PSMA编码区序列,可构建PSMA真核表达载体,建立PSMA稳定表达的细胞株。PSMA具有良好的抗原性。     

儿童幽门螺杆菌感染检测方法临床适用性分析

目的 分析13C-尿素呼气试验(13C-UBT)、血清幽门螺杆菌-IgG抗体、粪便幽门螺杆菌抗原和幽门螺杆菌培养试验方法检测儿童幽门螺杆菌感染的适用性. 方法 92例怀疑幽门螺杆菌感染患儿进行幽门螺杆菌培养,其中41例(44.57%)培养出幽门螺杆菌.将41例幽门螺杆菌感染患儿和30例健康体检儿童同时行13C-UBT、血清幽门螺杆菌-IgG抗体检测、粪便幽门螺杆菌抗原检测. 结果 粪便幽门螺杆菌抗原检测敏感性为46.34%,13C-UBT和血清幽门螺杆菌-IgG检测敏感性较高,分别为92.68%和90.24%.13C-UBT和血清幽门螺杆菌-IgG检测相比差异无统计学意义(P>0.05),13C-UBT和血清幽门螺杆菌-IgG检测敏感性均高于粪便幽门螺杆菌抗原检测(P<0.05);13C-UBT和粪便幽门螺杆菌抗原检测特异性和阳性预测值均高于血清幽门螺杆菌-IgG检测 (P<0.05);粪便幽门螺杆菌抗原检测的阴性预测值明显小于其他方法(P<0.05).结论 13C-UBT检测的敏感性及特异性均较高,更能反映幽门螺杆菌感染的变化状况,可作为临床诊断幽门螺杆菌感染的首选方法.血清幽门螺杆菌-IgG特异性较低,不宜单独作为幽门螺杆菌感染的诊断依据,可用于幽门螺杆菌感染的流行病学调查.     

幽门螺杆菌PCR—RFLP分型的研究

目的：建立幽门螺杆菌PCR检测及RFLP分型方法。方法：用PCR扩增幽门螺杆菌（HP）尿素酶C基因，扩增产物用HindⅢ酶切分析。结果：35株HP分为4种酶切谱型：I型19株（54％），Ⅱ型11株（31％），Ⅲ型4株（11％），Ⅳ型1株（3％）。结论：该方法重复性好，分辨力高，可有效地对HP作出鉴定并将其分型。对HP感染的传染源、传播途径及复发原因的探讨具有重要意义。     

幽门螺杆菌抗原在慢性肝病胃粘膜的表达及诊断价值

慢性乙型肝炎(慢肝)、乙型肝炎后肝硬化(肝硬化)伴随胃粘膜病变且有幽门螺杆菌感染者并不少见,目前常用快速尿素酶试验、特殊染色、幽门螺杆菌镜检进行检测,本文报告以幽门螺杆菌IgG型抗体对胃粘膜作免疫组织化学检测幽门螺杆菌抗原表达,并与上述方法比较,进行评价.     

Persephin基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 :获取Persephin(PSP)基因并实现其高效表达。 方法 :利用PCR方法以染色体DNA为模板 ,扩增编码人PSP成熟蛋白的基因片段 ,将其克隆于 pUC19质粒 ,进行序列分析 ,将基因重组于硫氧还蛋白融合表达载体pThioHisA并进行表达。结果 :序列分析结果与文献报道一致 ,表达的hPSP占菌体总蛋白质 15 %左右。结论 :人PSP基因在大肠杆菌Top10中获得了高效、稳定表达 ,为进一步的基础研究与临床应用奠定了基础。     

质粒序列在CHO细胞培养中的整合、扩增和稳定性

中国仓鼠卵巢细胞/二氢叶酸还原酶(CHO/DHFR)表达系统是一种利用哺乳动物细胞来合成大量结构复杂的蛋白质的有效工具。本文综述了表达序列在CHO细胞中的整合、扩增和遗传稳定性等特征。采用CHO/DHFR表达系统,可简化重组体细胞的筛选,且能使目的基因高拷贝扩增以提高表达水平。用DHFR基因表达载体,将目的基因带入DHFR-CHO突变株,用去除DHFR代谢产物的培养基筛选含有目的基因的重组细胞,其特征为可利用DHFR的表达     

鼠肺组织直接用于汉坦病毒S基因序列分析

目的：应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、核苷酸序列分析等技术，尝试建立一种可直接从鼠肺标本中进行汉坦病毒基因分析的方法。方法：提取经免疫荧光法检测汉坦病毒抗原阳性的鼠肺细胞总RNA，经逆转录获取病毒cDNA．纯化，克隆于pMD-18T载体，测定S基因片段核苷酸序列。结果：采用RT—PCRT／A克隆技术成功地从鼠肺组织中扩增出汉坦病毒S基因全序列，序列长为1701nt。只有一个编码N蛋白的开放读码框架（ORF），起始密码子为第37nt，终止于1326nt，推导其编码的蛋白长为429个氨基酸。与该标本分离株（简称TJJ16毒株）S基因的全序列相一致。结论：该方法可对汉坦病毒抗原检测阳性而病毒分离阴性的鼠肺标本进行分子生物学特征性分析，从而建立一种对汉坦病毒在宿主间的流行情况分析的方法。     

黄瓜花叶病毒2b蛋白在大肠杆菌中的表达及抗血清制备

从黄瓜花叶病毒（CMV）中提取总RNA，通过反转录-PCR（RTPCR）扩增得到其运动蛋白2b基因，将扩增产物克隆到pMD-18T载体上。DNA序列分析表明，所得到2b基因全长为303bp与已发表CMV序列相同。将目的片段亚克隆到表达载体pET30a上，并在大肠杆菌JM109诱导表达，诱导9h后。融合蛋白表达量最大。经SDS-PAGE检测，融合蛋白以可溶形式存在。制备的抗血清，效价为1：4000。     

生物信息学分析软件的开发及在药学领域的应用

针对新药研发需求开发了中文生物信息学分析软件——Wonderful生物信息学系统。本系统能提供生物信息学常规分析工具，包括核酸、蛋白质序列统计分析，开放阅读框(ORF)搜索定位，基因组、蛋白质组信息搜索、分析、同源性比对等工具，并为实验室PCR克隆扩增靶分子基因、进行基因产物改造及修饰等提供简便的设计操作软件，以促进药物新靶点的筛选以及基于药物靶分子的新药设计与开发。     

贵阳地区儿童幽门螺杆菌临床分离菌株毒力基因cagA和vacA的表达情况以及与抗生素耐药之间的关系

目的分析贵阳地区儿童幽门螺杆菌临床分离菌株的毒力基因cagA和vacA的表达情况 ,以及探讨其和幽门螺杆菌耐药之间的关系.方法从有上消化道症状的患儿的的胃窦粘膜中分离培养出幽门螺杆菌31株 ,采用聚合酶链式反应检测cagA和vacA的分布情况.用琼脂稀释法检测幽门螺杆菌对阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星的耐药性.结果本地区儿童幽门螺杆菌的cagA基因的阳性率为83 .87% .vacA基因亚型s1a、s1b、s1c、m1和m2的检出率分别为83 .87% (26/31)、0% (0/31)、19 .35% (6/31)、12 .90% (4/31)和74 .19% (23/31).优势基因为vacAs1am2型.毒力基因与不同的疾病之间无相关性.cagA基因和vacA基因与阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑及左氧氟沙星耐药无相关性(P>0 .05).结论贵阳地区儿童的毒力基因cagA+和vacAs1m2型为主.毒力基因与抗生素的耐药性之间无相关性.     

幽门螺杆菌对胃溃疡患者Ghrelin水平的影响

目的：该项研究旨在通过测定幽门螺杆菌相关与非相关性胃溃疡患者血清中生长素（Ghrelin）在未接受抑酸药物治疗前的含量，探讨Ghrelin在胃溃疡时循环血中的表达与幽门螺杆菌感染之间的关系。方法：快速尿素酶法与血清幽门螺杆菌抗体检测法联合检测26例胃溃疡患者，确定幽门螺杆菌感染组与非感染组，用酶联免疫方法检测血清中Ghrelin的水平。结果：胃溃疡患者血清中Ghrelin的水平幽门螺杆菌感染与非感染组差异无统计学意义（P〉0．05）。结论：胃溃疡患者血清中Ghrelin水平与幽门螺杆菌感染无明显关系，推测幽门螺杆菌对胃溃疡Ghrelin患者水平的变化无明显作用。     

结核分枝杆菌Ag85B真核表达质粒的构建及其表达

目的：构建结核分枝杆菌Ag85B真核表达质粒并表达。方法：从结核分枝杆菌（H37Rv）基因组中扩增出Ag85B编码基因，经限制性内切酶消化后，定向克隆入pcDNA3.1( )中。采用脂质体法将pcDNA/Ag85B转染COS－7细胞，采用RT－PCR、ELISA和斑点印迹法检测其表达。结果：扩增出Ag85B基因，经双向DNA序列测定，与Genbank注泵的序列一致；重组质粒转染COS－7细胞后经检测证实，该基因能在真核细胞中表达。结论：成功地构建了pcDNA/Ag85B质粒，其在真核细胞中表达的蛋白具有良好的抗原性。     

重组保护性幽门螺杆菌抗原的分离

幽门螺杆菌 (Hp)抗原可保护小鼠免受猫螺杆菌 (Hf)感染的事实表明 ,这两种细菌有交叉保护抗原 ,业已证明脲酶 (Ure)是 Hf和 Hp的交叉保护分子。为了进一步确定交叉反应和交叉保护性抗原 ,作者用一临床分离株 (Hp92 1 0 2 3株 )作为 DNA供体在 λZAP表达载体中构建基因文库 ;同时从口服 Hf超声粉碎物 霍乱毒素 (CT)的小鼠制备抗血清筛选基因文库。结果得到 5 0个不同信号强度的阳性克隆。回收纯化阳性克隆 ,经体内切割 ,从 λZAP表达载体中获得含有相应 HpDNA的 p BK- CMV质粒 ,以进一步研究克隆 DNA及其编码蛋白的特征。经十二…     

截短的丙型肝炎病毒核心区基因的克隆和表达

目的  克隆和表达截短的丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）核心区基因,为制备HCV核心区抗体准备抗原。方法  根据软件分析选取带有优势抗原表位的HCV核心区多肽,找出对应DNA序列,逆转录PCR扩增目的基因,并将其克隆到原核表达载体中进行诱导表达。表达的目的蛋白纯化后用间接ELISA法检测免疫活性。结果  获得了序列正确的HCV目的基因片段。表达的目的蛋白为可溶性蛋白,能被很好地纯化。使用该纯化蛋白检测各种样本,结果HCV阴性样本的平均吸光度（A）值为0.081,HCV阳性样本与阴性对照的A值之比均>2.1,乙型肝炎和梅毒阳性样本的A值都在0.101以下。结论 成功地克隆和表达了HCV核心区小片段基因,获得了具有良好抗原性的截短HCV核心区多肽。     

SH2域、SHP2 cDNA的克隆鉴定和在大肠杆菌中的表达及其与CagA的相互作用

目的 研究SH2（Sre同源体2）域和SHP2（含2个SH2域的蛋白酪氨酸磷酸酶）蛋白的基因克隆和表达。方法 根据GeneBank中SH2和SHP2的基因序列设计引物,以PCR法扩增出SH2和SHP2基因,将其插入pQBO质粒中,转化进E．coli感受态细胞中,筛选阳性克隆并研究其表达。结果 所克隆的目的基因片断经PCR法鉴定和序列分析证明正确。结论 已成功地扩增SH2和SHP2基因并克隆到pQE30载体上,转化大肠杆菌菌株有表达,并探讨其与CagA（细胞毒性关联的基因A抗原）的相互作用及导致胃细胞癌变的原因。     

正常与肿瘤组织丁酰胆碱酯酶和乙酰胆碱酯酶的基因扩增：推论它与有机磷中毒

ChE和AChE的编码基因在多种生殖、胚胎和肿瘤细胞中均有短暂的表达，在白血病和血小板疾病中均有扩增现象，并且在卵巢癌组织常出现上述两种基因的协同扩增。ChE和AChE基因的扩增与毒性靶蛋白质编码基因的扩增有相似性。当接触有机磷毒剂时，胆碱酯酶基因扩增可经细胞提供选择有利性。又由于胆碱酯酶在多种细胞的发性过程中起到重要作用，相应基因的扩增和过度表达会影响生育能力，并和肿瘤的发展有关，在生态学和临床上也有其一定意义。     

重组ORF50和ORF73融合抗原检测HHV-8病毒的探讨

目的构建高效表达重组HI-IV-8病毒ORFSO和ORF73融合蛋白原核表达载体,为诊断试剂国产化提供抗原。方法设计并合成扩增ORF50和ORF73基因引物,以HI-IV-8感染血清DNA为模板,扩增出目的基因,连接基因片段,IPTG诱导表达重组融合蛋白。包被ELISA酶标板后对无偿献血人员血清进行检测,以市售HHV-8ELISA试剂盒作对照。结果与市售人疱疹病毒8@（HHV-8）ELISA试剂盒检测结果一致。结论构建的原核表达载体可成功表达重组HHV-8病毒ORF50和ORF73融合抗原,该抗原可作为HHV-8感染检测的诊断抗原。     

小鼠睫状神经营养因子基因的克隆及真核表达载体的构建

目的：分别构建野生型和截短型小鼠睫状神经营养因子（CNTF）基因的真核表达载体。方法：通过逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）扩增小鼠CNTF野生型全长编码序列，体外定点突变获取截短型CNTF的互补DNA（cDNA）编码序列．将上述两序列分别克隆至pGEM—T Easy载体，经限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切后，将野生型和截短型CNTF基因连入pTracer—CMV真核表达载体，DNA测序鉴定。结果：PCR成功扩增了野生型和截短型CNTF基因，DNA序列分析证实两种真核表达载体中的CNTF序列与GeneBank中目的序列一致。结论：野生型和截短型CNTF基因真核表达载体的成功构建为视网膜色素变性（RP）的基因治疗研究奠定了基础。