抗凝剂对定量检测乙型肝炎病毒DNA的影响

目的探讨用实时荧光定量PCR技术检测乙型肝炎病毒DNA拷贝数时，不同抗凝剂对乙型肝炎病毒DNA定量检测的影响。方法采集40例乙型肝炎患者血液，分别置于不含抗凝剂及含肝素钠、枸缘酸钠、EDTA-k2抗凝剂的无茵试管中，分离血清和血浆后于-20℃冰箱保存备用。采用实时荧光定量PCR方法检测血清和血浆中乙型肝炎病毒DNA的拷贝数，用配对t检验对检测结果进行统计处理。结果40例乙型肝炎患者不合抗凝荆组的乙型肝炎病毒DNA拷贝数的对数均数为5．66±2．10，含肝素钠组的对数均数为5．42±2．26，含枸缘酸钠组的对数均数为5．36±2．11，含EDTA-k2组的对数均数为5．58±2．16。三种含抗凝剂的标本分别与不合抗凝剂的血清组标本中的乙型肝炎病毒DNA拷贝数转换为对数经配对t检验统计处理，含肝素钠组和枸缘酸钠组的DNA拷贝数与不含抗凝剂组DNA拷贝数差异有统计学意义（P〈0．05），而含EDTA-K2组的DNA拷贝数与不含抗凝荆组的的DNA拷贝数差异无统计学意义（P〉0.05）。结论实时荧光定量PCR技术检测乙型肝炎病毒DNA拷贝数，应避免使用含肝素钠和枸缘酸钠的血浆标本，使用不合抗凝剂或含EDTA-K2抗凝剂的无菌试管收集标本。     

荧光定量PCR和ELISA法检测HBV标志物的结果分析

外周血中HBV—DNA的定性和定量是检测病毒复制最直接和可信的指标，尤其是荧光定量PCR技术在病毒含量检测，使得临床能更有效的监测患者的病情，如治疗效果、是否有耐药性发生等，并可依据病毒含量的变化合理解释病情转归。为进一步了解HBV—DNA检测的实用价值及临床意义，我们对1034份血清标本，同时用ELISA检测HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb及应用荧光定量PCR技术检测HBV—DNA，其检测结果如下。     

鸭乙型肝炎病毒核酸荧光定量PCR方法的建立及应用

目的：建立鸭乙型肝炎病毒核酸(DHBV DNA)荧光定量的方法。方法：根据DHBV DNAS基因区的序列设计扩增所需3条引物，通过偶联反应用AmpliSensor荧光信号标记半巢式引物，经过前期不对称扩增、半巢式扩增及在线检测建立DHBV DNA阳性标准品QPCR的标准曲线，并将70份鸭血清分别用荧光定量PCR方法和地高辛标记的DHBV DNA探针斑点杂交的方法检测，比较结果的相关性。结果：DHBV DNA阳性标准品经过30次循环后，扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，可以看出有180bp、70bp两个片段，与设计的片段大小相符，扩增产物的浓度与标准品的起始浓度成正比，扩增指数的数值大小与该循环时己合成的扩增产物的量成正比，起始浓度的大小与要合成的一定扩增产物的量所需的循环次数成反比。用荧定量PCR方法和斑点杂交的方法检测血清中DHBV DNA的结果有良好的相关性(r＝0．97，P＜0.01，ν＝58)。结论：荧光定量PCR方法可作为检测DHBV DNA含量的一个重要手段。     

可降解非病毒基因载体PEG-b-(PG-g-PEI)的合成与表征

目的结合重组低分子量PEI 和PEG结构修饰两种手段合成出新型可生物降解的非病毒基因载体聚乙二醇-b-(聚谷氨
酸-g-聚乙烯亚胺)。方法用相对分子质量600 的聚乙烯亚胺氨解嵌段聚合物PEG-b-PBLG,合成非病毒基因载体聚乙二
醇-b-(聚谷氨酸-g-聚乙烯亚胺);利用核磁共振氢谱、凝胶渗透色谱、激光粒度分析仪、zeta电位仪和凝胶电泳对载体及其与DNA
复合物进行了表征,并通过体外细胞实验考察了载体的细胞毒性与转染效率。结果我们成功合成出窄分布的非病毒基因载体
聚乙二醇-b-(聚谷氨酸-g-聚乙烯亚胺);凝胶电泳测定结果表明当N/P比大于5时载体能很好地包裹DNA;载体与DNA形成的
复合物粒径为120 nm,zeta电位25 mV;通过MTT实验和体外质粒转染实验显示出载体在测量范围内具有极低的细胞毒性和
很高的转染效率。结论聚合物聚乙二醇-b-(聚谷氨酸-g-聚乙烯亚胺)有望作为非病毒基因传递载体。
     

双嵌段磷酸胆碱基聚合物作为c-myc AS-ODN基因运输载体研究

目的 探讨双嵌段磷酸胆碱基聚合物MPC30-DEA70 作为反义寡核苷酸（AS-ODN）运输载体的安全性和有效性.方法 将载体MPC30-DEA70（N）与c-myc AS-ODN（P）在不同N/P比值的条件下复合,应用DNA凝胶电泳法、荧光显微镜、流式细胞术和四甲基偶氮唑盐（MTT）法对复合物溶液进行检测,观察复合物在HeLa细胞中的转染情况.结果 c-myc AS-ODN能与载体MPC30-DEA70电性中和,N/P比值越大复合物正电性越强;MPC30-DEA70/AS-ODN复合物能够进入细胞,转染效率随着N/P比值增大而增大;同时随着N/P比值增大复合物对细胞的增殖抑制作用显著增强.结论 MPC30-DEA70可以有效负载和运输c-myc AS-ODN,抑制HeLa细胞增殖,是一种新型的、安全有效的非病毒类转基因载体.     

双靶区反义RNA抗乙型肝炎病毒的实验研究

目的 研究双靶区反义RNA重组载体质粒的转染、表达及抗乙型肝炎病毒的作用。方法 构建表达乙型肝炎病毒X、P双靶区正、反义RNA的重组载体质粒与脂质体混合,经尾静脉注入小鼠体内,用荧光聚合酶链反应定量法检测血清乙型肝炎病毒DNA含量,用Nested—PCR法检测血清乙型肝炎病毒DNA转阴率。结果 与给药前相比,小鼠血清乙型肝炎病毒DNA的复制,在逆转录病毒载体-asX组和逆转录病毒载体-asP组分别于第2、第8周达到抑制高峰,抑制率均为58％;在逆转录病毒载体-asXP组于第1、第8周出现两次抑制高峰,抑制率分别为66％、77%;其余组未出现明显变化。给药后8周,小鼠血清乙型肝炎病毒DNA,在逆转录病毒载体-asX组、逆转录病毒载体-asP和逆转录病毒载体-asXP分别有2只、1只,1只转阴,转阴率分别为25.0％、12．5％、16．7％。结论 乙型肝炎病毒X、P双靶区反义RNA对乙型肝炎病毒转基因鼠乙型肝炎病毒DNA的抑制作用优于单靶区反义RNA,但其对血清乙型肝炎病毒DNA的转阴率与单靶区反义RNA无显著性差异。     

含绿色荧光蛋白报告基因pUC18筛选载体的构建

目的：以绿色荧光蛋白（GFP）基因为报告基因，将GFP基因克隆入pUC18建立大通量的筛选载体。方法：用PCR方法扩增目的DNA片段，碱裂解法小量制备质粒DNA，用限制性内切酶消化质粒DNA，用低熔点琼脂糖凝胶分离和纯化大片段DNA，GFP基因与pUC18连接，用氯化钙法转化感受态细胞，DNA序列测定，琼脂糖凝胶电泳，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果：pUC18-atg-GFP载体意外表达GFP蛋白，新合成的上游引物与原下游引物扩增GFP基因，克隆入pUC18构建pUC18-GFP载体，通过PCR，酶切鉴定和DNA序列分析，GFP基因的读码框架与原设计方案完全一致，该载体自身无GFP表达。结论：筛选载体内的GFP基因与克隆基因的融合基因可表达一种融合蛋白，在琼脂平板上含有该融合基因的克隆在紫外线激发下可发绿色荧光，因此，可表达基因能被挑选出来。     

荧光定量PCR检测HBV DNA与乙型肝炎病毒标志物的关系

目的：探讨乙型肝炎病毒DNA（HBV DNA）的检出情况及与乙型肝炎病毒标志物的关系。方法：采用荧光定量－聚合酶链反应（FQ－PCR）技术检测273例患者血清中HBV DNA含量，同时用ELISA法检测乙型肝炎病毒五项标志物。结果：273例患者血清中，BHV DNA的阳性率与乙型肝炎病毒标志物不同组合之间有差异，HBsAg /HBeAg HBcAb 和HBsAg /HBeAg 组的阳性率明显高于其它组，分别达97．52％（118／121）和100％（9／9）；HBsAg /HBeAb /HBcAb 组的阳性率为61．33％（46／75）；HBsAg /HBcAb 组的阳性率为66．67％（20／30）；其它组也有HBV DNA检出，其中HBsAb 组的阳性率达15．38％（2／13）。结论：用ELISA法检测乙型肝炎病毒五项标志物来判断肝脏中HBV是否复制及有无传染性是浼铁，容易造成漏诊，应同时用荧光定量PCR检测HBV DNA才能更准确地反映体内HBV复制的情况。     

新型纳米非病毒基因输送体系PCL-PEG-chitosan的构建与特性

目的 优化新型纳米非病毒载体聚己内酯（PCL）-聚乙二醇（PEG）-壳聚糖（chitosan）（PCL-PEG-chitosan）在体外与质粒的复合条件,并进行转染活性测定。方法 在体外利用凝胶电泳方法确定非病毒载体与携带绿色荧光蛋白基因的质粒（pEGFP）复合的最小氮磷比。利用动态光散射粒径测量仪确定复合物在不同氮磷比、不同缓冲溶液体系下粒径的变化情况。将pEGFP与PCL-PEG-chitosan进行复合后转染293T细胞,荧光显微镜观察转染效率。结果 凝胶电泳结果显示,非病毒载体PCL-PEG-chitosan与pEGFP复合的最小氮磷比为4∶1,PCL-chitosan与pEGFP复合的最小氮磷比也为4∶1,chitosan与pEGFP复合的最小氮磷比为1∶1。动态光散射实验结果显示：非病毒载体PCL-PEG-chitosan与pEGFP复合而成的复合物的粒径随着氮磷比的增大而减小;在醋酸盐缓冲体系与DMEM缓冲体系中,复合物的粒径基本一致,相对稳定。荧光显微镜观察发现,经过接枝改性的纳米载体PCL-PEG-chitosan的转染效率有所提高。结论 PCL修饰可减弱chitosan对pEGFP的复合能力,提高最低复合氮磷比。经PCL和PEG修饰的纳米载体PCL-PEG-chitosan的细胞转染活性有所提高,但尚需进一步改进。     

聚乙烯亚胺修饰纳米金基因载体制备及体外实验研究

目的 制备聚乙烯亚胺修饰纳米金基因载体并研究其理化性质的表征参数和体外转染效率.方法 通过化学还原法制备聚乙烯亚胺修饰的纳米金基因载体,用绿色荧光蛋白质粒(pAcGFP-N1)做报告基因,纳米基因载体可通过静电吸附的方式结合质粒DNA.用紫外分光光度计检测其吸收光谱,用透射电镜观察其形态特征,激光粒度分析仪测定其粒度分布、表面电位(Zeta电位),1％琼脂糖凝胶电泳检测该基因载体与质粒DNA的结合稳定性,CCK-8实验检测聚乙烯亚胺修饰纳米金基因载体及DNA-纳米金复合物对HEK293细胞的细胞毒性作用,通过荧光显微镜观察聚乙烯亚胺纳米基因载体介导pAcGFP-N1在体外培养的HEK293细胞中的表达,并分析其转染效率.结果 聚乙烯亚胺还原氯金酸可以得到带正电荷的纳米颗粒,呈单分散球形分布,其粒径为(12.3 ±3.3)nm.在pH =7.2时,Zeta电位为+(29.7±5.1)mV.1％琼脂糖凝胶电泳结果表明,当纳米金/质粒DNA≥0.5时,质粒DNA可完全结合到纳米金表面.体外转染实验表明,聚乙烯亚胺修饰纳米金基因载体能介导pAcGFP-N1转染HEK293细胞并在细胞中表达绿色荧光蛋白,其转染效率可达25％.结论 聚乙烯亚胺修饰纳米金是一种新型非病毒基因载体,具有转染效率高、对细胞毒性小等优势.     

HBV携带者血清和白带HBV-DNA FQ-PCR检测分析

目的了解乙型肝炎病毒HBV携带者血清与白带中HBV—DNA含量的关系及其意义。方法选择经血清学检测诊断为女性HBV携带者867例，采用荧光定量聚合酶链反应（FQ—Pen）技术测定其白带中和血清HBV—DVA含量，并对所有检测指标进行相关性分析。结果867例携带HBV女性中，HbsAg、HbeAg、HbcAb三大阳者的血清和白带中HBV—DNA的阳性检出率均为100％；HbsAg、HbeAb、HbcAb三小阳组阳性率分别为85．6％和84．3％；HB．sAg、HBsAb两组的阳性率分别为86．6％和83，7％，白带HBV—DNA含量与血清HBV—DNA含量呈正相关（r=0，896），且白带HBV—DNA含量低于血清含量近10^1。蛄论白带与血清中HBV—DNA含量呈正相关。血清HBV—DVA阳性的育龄女性应作白带HBV—DVA检测，以对其阳性者采取防治措施，降低HBV母婴播率具有重要意义重大。     

基因载体葡聚糖-精胺/DNA复合物的制备及物理性能的研究

目的:研究非病毒基因载体葡聚糖-精胺阳离子聚合物(DSP)的合成及其与DNA所形成复合物的物理性能.方法:葡聚糖氧化后,通过还原胺法与精胺反应制得DSP,与质粒pEGFP在室温孵育后形成复合物;激光粒度仪测定复合物粒径和Zeta电位;透射电镜观察复合物形态;琼脂糖凝胶电泳观察DSP对DNA的阻滞能力.结果:DSP与DNA在质量比大于4:1时,能形成稳定的复合物;复合物平均粒径为173.6nm,平均电位为23.2 mV;所形成的复合物呈圆球状;DSP能阻滞DNA不受电场的影响而迁移.结论:葡聚糖-精胺阳离子聚合物是一种制备工艺简单、有应用前景的非病毒基因载体.     

SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法测定猴免疫缺陷病毒(SIV)前病毒DNA拷贝数方法的建立

目的建立SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量PCR方法，测定猴免疫缺陷病毒（SIV）前病毒DNA。方法巢式RT-PCR扩增SIVmac251病毒RNA gag基因上1360-1837之间的长度为477bp的片段，将该片段克隆到pGEMT载体上，构建pGEM-SIV gag477质粒。该质粒经大量扩增纯化后定量，10倍系列稀释后，做出标准曲线，作为SIV前病毒DNA荧光定量检测的外标准品。结果应用Roche公司FastStart DNA Master SYBR Green Ⅰ Kit，该标准品可精确定量到10copies／μL。结论制备的pGEM-SIV gag477质粒外标准品纯度高，SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量PCR法特异性、敏感性高，稳定性好，可用于定量测定猴免疫缺陷病毒（SIV）前病毒DNA载量。     

对叔丁基杯[4]芳烃酸偶合低相对分子质量聚乙烯亚胺作为非病毒转基因载体的体外研究

目的合成对叔丁基杯[4]芳烃酸偶合低相对分子质量聚乙烯亚胺聚合物作为非病毒转基因载体,并评价其毒性、压缩DNA的能力,携带报告基因转染细胞的能力。方法采用新方法合成对叔丁基杯[4]芳烃酸偶合聚乙烯亚胺聚合物,通过核磁共振方法表征。将合成的新聚合物与DNA混合,得到新聚合物/DNA复合物,用琼脂糖电泳试验测定不同N/P比值形成复合物时对质粒DNA电泳的阻滞情况,评价其压缩DNA能力。透射电镜法检测复合物的大小,MTT法检测其对细胞的毒性作用,使用新聚合物携带报告基因转染细胞,并与PEI25000比较转染率。结果新聚合物压缩质粒DNA的能力随N/P比值增大而增强,在N/P比为6时可以完全阻滞质粒DNA的电泳,在N/P比为60时,复合物粒径约291 nm,复合物的表面电荷约14.6 m V。细胞毒性试验表明新聚合物与PEI25000相比毒性明显下降,携带报告基因转染MCF-7细胞转染效率与PEI25000相近。结论对叔丁基杯[4]芳烃酸聚乙烯亚胺新聚合物具有较强压缩质粒DNA能力,对细胞毒性低,转染效率高,是一种可应用于基因治疗的新型非病毒载体。     

一种新型基因传输载体-磷酸钙纳米颗粒用于肿瘤基因治疗的研究

目的研究新型非病毒栽体磷酸钙纳米颗粒的生物学特性，评估其在肿瘤基因治疗中应用的前景。方法化学方法制备，氯化钙修饰纳米颗粒，用琼脂糖凝胶电泳分析磷酸钙纳米颗粒与DNA的结合效率及对DNA的保护作用，用绿色荧光蛋白基因作报告基因，将磷酸钙纳米颗粒为基因栽体转染鼻咽癌（CNE-2）细胞和在动物体内转染肿瘤细胞；以及将磷酸钙纳米与自杀基因yCDglyTK结合，并在体外对鼻咽癌进行基因治疗。结果电镜观察证实磷酸钙纳米颗粒进入细胞内，磷酸钙纳米颗粒与DNA结合后，能对DNA起保护作用；磷酸钙纳米颗粒作为基因转染的栽体，将绿色荧光蛋白基因导入CNE-2细胞，用荧光显微镜观察到高水平的绿色荧光蛋白表达；体内转染结果显示，纳米介导的基因在肿瘤组织中有很好的表达：以磷酸钙纳米为栽体介导自杀基因yCDglyTK在体外治疗鼻咽癌的实验中显示，在加入5-FC后大量的CNE-2细胞出现死亡。结论磷酸钙纳米颗粒具有优良的生物学特性。是有应用前景的基因转染和基因治疗栽体之一。     

小鼠Th1细胞特异性转录因子T-bet基因腺相关病毒载体的构建

目的：构建小鼠Th1细胞特异性转录因子T-bet基因的腺相关病毒载体。方法：利用RT-PCR方法，从Balb／C小鼠脾细胞的mRNA中扩增T-bet基因全长cDNA，经测序证实后插入Pzac2．1质粒。用磷酸钙沉淀法．与pAddeltaF6及p5E18质粒共转染293细胞，包装成重组的病毒颗粒。并通过抽提病毒DNA进行PCR扩增鉴定重组病毒的形成．设立eGFP基因为对照。结果：1592bp的小鼠T-bet基因被成功克隆。分析表明．与Genbank中发表的序列相比具有99．8％的同源性。重组质粒Pzac2．1-T-bet的PCR及酶切鉴定表明T-bet基因被定向插入，与pAddehaF6及p5E18质粒共转染293细胞包装成病毒后，经荧光显微镜和病毒DNA的PCR检测，证实已完成对重组病毒的包装。结论：成功构建了小鼠T-bet基因的腺相关病毒载体rAAV-T-bet，为免疫紊乱性疾病的T-bet基因干预治疗奠定了基础．     

外周血淋巴细胞中EB病毒载量与鼻咽癌诊断及分期的关系

目的探讨外周血淋巴细胞中EB病毒载量与鼻咽癌诊断、分期及预后的价值。方法采用实时荧光定量基因扩增技术，抽取鼻咽癌患者静脉血2mL，用EDTA—Na2抗凝，用淋巴细胞分离液分离血中淋巴细胞，再用DNA提取液提取淋巴细胞中的EBV—DNA为模板进行扩增检测。结果47例鼻咽癌患者中E—BV-DNA阳性率为63．8％（30／47），对照组61例非鼻咽癌患者中EBV-DNA的阳性率为11．5％（7／61），两者差异有显著性（X^2=32．30，P〈0．01）。早期（Ⅰ、Ⅱ期）14例与晚期（Ⅲ、Ⅳ期）16例鼻咽癌患者EBV—DNA含量比较差异有显著性（t=4．65，P〈0．01），晚期患者淋巴细胞中EBV—DNA含量明显高于早期患者。结论定量检测外周血淋巴细胞中EBV—DNA对鼻咽癌的诊断、分期和预后有极高参考价值，可做为监测病情及判断疗效的一种有效手段。     

前S1蛋白与乙型病毒性肝炎血清标志物的关系

目的探讨前S1蛋白(Pre S1)与乙型病毒性肝炎血清标志物的关系。方法318例乙型肝炎患者，采用酶联免疫法检测Pre S1，荧光定量PCR法检测HBV DNA。结果在HBeAg阳性血清中，Pre S1的阳性率为87．9％，与HBV DNA的阳性检出率(91．2％)差异无统计学意义；在抗-HBe阳性血清中，Pre S1的阳性率为28．4％，也与HBV DNA的阳性率接近。结论Pre S1检测有助于了解乙型肝炎病毒的复制情况。在无条件检测HBV DNA的实验室，开展Pre S1检测具有实用意义。     

分子生物学技术检测儿童病毒性脑炎病原体的研究

目的探讨荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）检测儿童病毒性脑炎脑脊液（CSF）中的病原体的价值。方法应用定性聚合酶链反应（PCR）作筛选，检测最常见的引起病毒性脑炎的6种病毒，对单纯疱疹病毒（HSV），柯萨奇病毒（CV），埃可病毒（EV）阳性者作荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）检测，其中单纯疱疹病毒脑炎（HSVE）分别在3个时点（治疗前、治疗中、出院时）检测DNA拷贝数。结果定性聚合酶链反应阳性标本FQ-PC检测100％阳性，HSV—DNA量在3时点有差异，病毒核酸拷贝数与临床表现一致。结论FQ—PCR可作为儿童病毒性脑炎早期诊断的有效方法之一，动态观察HSV—DNA含量有助于指导治疗，估计疾病的发展和预后     

血清HBVDNA与乙型肝炎病毒血清学标志物的关系

目的探讨荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）技术定量检测HBV DNA与乙型肝炎病毒（HBV）血清学标志物之间的关系。方法采用ELISA检测乙肝病毒血清学标志物，FQ-PCR法检测HBVDNA，比较不同乙肝病毒血清学标志物阳性组合HBVDNA阳性情况。结果HBsAg、HBeAg和HBcAb性组HBVDNA阳性率为100％（155／155）；HBsAg、HBeAb和HBcAb阳性组HBV DNA阳性率为35．2％（50／142）；HBsAg、HBcAb阳性组HBV DNA阳性率为30．2％（38／126），HBsAg阳性组血清HBVDNA阳性率为10．0％（3／30）。结论荧光定量PCR法检测血清中衄VDNA含量可以准确地反映病人体内病毒的感染和复制情况，可准确地为临床提供科学的诊断依据。