同种异体骨髓间充质干细胞移植对大鼠心肌梗死后心电生理异常和左室重构的影响

背景：目前干细胞移植修复梗死心肌及改善心脏功能这一作用已被接受,但移植细胞是否和宿主细胞形成有效的电-机械藕联,是否易形成一个有收缩功能的相对电独立体系,并产生移植后严重的恶性室性心律失常等尚缺乏系统观察。 目的：观察心肌梗死大鼠行同种异体骨髓间充质干细胞移植后,其心电生理异常及左室重构情况。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2005-12/2008-10在广西医科大学实验中心完成。 材料：健康Wistar大鼠120只,随机分为正常对照组、假手术组、盐水对照组、细胞移植组,30只/组。另取1月龄健康Wistar大鼠数只用于抽取骨髓。 方法：取体外培养的第3代大鼠骨髓间充质干细胞,加入诱导剂5-氮胞苷使之转化为心肌样细胞,在移植前2 h行DAPI标记。盐水对照组、细胞移植组大鼠结扎冠状动脉左前降支建立心肌梗死模型,假手术组只穿线不结扎冠状动脉。结扎后7 d,细胞移植组将2×1010 L-1骨髓间充质干细胞分多点注射到心肌梗死的边缘区和中心区,其余3组注射等量生理盐水。 主要观察指标：体表ECG及心电生理检测,UCG检测左室功能,左室病理检查测定梗死面积,荧光显微镜下观察DAPI标记的供体细胞迁移、分布情况。 结果：骨髓间充质干细胞体外诱导可分化为自发搏动的心肌样细胞,表达心肌特异性肌钙蛋白T,并形成肌丝结构。细胞移植后4,8,12周与盐水对照组比较,细胞移植组PR间期、QRS时限和心室有效不应期缩短,而室颤阈值增加(P < 0.05);左室收缩末期内径减小,左室射血分数、左室短轴缩短率均显著增加(P < 0.05);移植后8,12周心肌梗死面积明显缩小 (P < 0.05)。移植后4周,在荧光显微镜下梗死区可见DAPI标记带蓝色荧光的移植骨髓间充质干细胞细胞核,至12周仍然存在,但随移植时间延长荧光强度逐渐减弱。 结论：骨髓间充质干细胞具有分化为心肌样细胞的可塑性,同种异体骨髓间充质干细胞移植可有效改善心肌梗死后的心电生理异常和左室重构。     

经5-氮胞苷诱导后的骨髓间充质干细胞心肌移植后对心功能的影响

背景：骨髓间充质干细胞具有多分化潜能,但其在体外经5-氮胞苷诱导后移植于急性心肌梗死大鼠中,能否改善近期及远期的心功能,目前尚不明确。 目的：观察兔骨髓间充质干细胞移植入急性心肌梗死组织后对心功能的影响。 方法：分离培养兔骨髓间充质干细胞,5-氮胞苷诱导4周后,体外DAPI标记。新西兰兔随机均分3组,假手术组：打开胸腔1 h后缝合胸腔;骨髓间充质干细胞组：于冠状动脉结扎建立急性心肌梗死模型后1 h在梗死周边区用微量注射器分4点注射诱导后的自体骨髓间充质干细胞;急性心肌梗死组：造模后于相同部位注射等量生理盐水。移植后3 d,4周超声心动图检测各组大鼠左室舒张末期容积,左室收缩末期容积及射血分数变化。 结果与结论：荧光显微镜观察发现,骨髓间充质干细胞组移植后3 d,4周心脏标本中均发现有DAPI标记的阳性细胞,呈散在分布于瘢痕周边区并沿心肌纤维排列方向走行。移植后3 d,骨髓间充质干细胞组与急性心肌梗死组相比,左室舒张末期容积、左室收缩末期容积及射血分数无明显差异,心功能没有明显的改善;移植4周后,骨髓间充质干细胞组与急性心肌梗死组相比,射血分数明显提高,左室舒张末期容积、左室收缩末期容积明显降低。     

人脐血单个核细胞多次静脉移植家兔急性心肌梗死后的胶原重构

背景：以往干细胞移植治疗心肌梗死的研究,均为单次经静脉或冠脉注射移植。 目的：进一步验证人脐血单个核细胞多次静脉移植对家兔急性心肌梗死胶原重构及心功能影响。 方法：取家兔45只结扎冠脉左前降支制备急性心肌梗死模型,随机分为3组,①多次移植组：造模后7,9,11,13 d经耳缘静脉注入BrdU标记人脐血单个核细胞生理盐水。②单次移植组：造模后7 d注入BrdU标记人脐血单个核细胞生理盐水,9,11,13 d注入生理盐水。③心梗对照组：仅注入生理盐水。另取家兔5只为假手术组。 结果与结论：与对照组相比,两移植组心功能左室短轴缩短率、左室射血分数明显升高(P < 0.05);且多次移植组改善效果优于单次移植组(P < 0.05);免疫组织化学显示两移植组造模后2,4周心梗周边区均存在BrdU阳性细胞,但多次移植组BrdU阳性细胞计数多于单次移植组;改良Masson’s染色显示与假手术组比较,对照组梗死区及非梗死区胶原密度显著增加,梗死区域胶原纤维部分融合,排列较紊乱,心肌基本组织结构破坏;与对照组比较,两移植组造模后2,4周梗死周边区域心肌细胞间胶原含量、胶原纤维明显减少,胶原纤维排列较为有序;与单次细胞移植组比较,多次细胞移植组进一步改善。提示多次静脉移植脐血单个核细胞改善急性心肌梗死心功能、阻抑心肌胶原纤维重构疗效优于单次静脉移植。     

同种异体骨髓间充质干细胞穴位移植对梗死心肌及周围区细胞凋亡及相关蛋白的影响

背景：骨髓间充质干细胞移植途径主要包括外周静脉注射移植、冠状动脉移植以及心肌内注射移植，但存在迁移缺少靶向性，价格高昂等局限性。 目的：观察兔骨髓间充质干细胞穴位注射对梗死区心肌细胞凋亡及凋亡调控蛋白Fas,FasL,Bcl-2表达的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2007-06/08在辽宁中医药大学针灸系电生理实验室完成。 材料：抽取健康日本大耳白兔骨髓，分离培养骨髓间充质干细胞并传代；结扎日本大耳白兔左室支建立急性心肌梗死模型。 干预：将造模成功的日本大耳白兔30只随机分为3组，模型对照组不干预；穴位注射干细胞组于急性心肌梗死形成后1周，取心俞（双侧）、至阳、膻中4穴，穴位注射干细胞混悬液，1×l06细胞/穴；穴位注射生理盐水组在相同部位穴位注射等量生理盐水。以10只未造模兔为正常对照组。 主要观察指标：干预后第5周取心脏，TUNEL染色观察梗死区心肌细胞凋亡；免疫组化观察心肌Fas，FasL及Bcl-2蛋白的表达。 结果：模型对照组和穴位注射生理盐水组梗死区心肌细胞凋亡高于正常对照组和穴位注射干细胞组（P < 0.001，0.05）。穴位注射干细胞组Fas和FasL蛋白的表达明显低于模型对照组（P < 0.001），模型对照组则高于正常对照组（P < 0.05，0.001）。穴位注射干细胞组及正常对照组Bcl-2蛋白表达明显高于模型对照组和穴位注射生理盐水组（P < 0.001）。 结论：穴位移植骨髓间充质干细胞可使梗死及周围区心肌细胞凋亡数减少，其机制可能是通过Fas、FasL蛋白的减少、Bcl-2蛋白的增多来调节的。     

同种异体骨髓间充质干细胞移植对大鼠急性心肌梗死后Cx43、Cx45mRNA表达的影响

背景：细胞移植可以修复受损的心肌组织,但移植细胞是否和宿主细胞形成有效的电-机械偶联,并引起移植后细胞缝隙连接蛋白重构及心律失常等尚缺乏系统观察。目前只有少数研究发现心肌梗死后缝隙连接蛋白45表达上调,而对于骨髓间充质干细胞移植后缺血区缝隙连接蛋白45的表达尚无报道。 目的：课题组假设通过改变缝隙连接蛋白水平、干预异常的GJ通道,来尝试治疗心肌梗死后心律失常,为此探讨同种异体骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死大鼠缝隙连接蛋白43及缝隙连接蛋白45 mRNA表达的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2008-01/2009-05在广西医科大学实验中心完成。 材料：健康Wistar大鼠180只,随机分为正常对照组、假手术组、心肌梗死组、细胞移植组,45只/组。各组按干预后4,8,12周又分为3个亚组,15只/亚组。另取1月龄健康雄性Wistar大鼠20只,用于分离培养骨髓间充质干细胞。 方法：取传至第3代的大鼠骨髓间充质干细胞,加入10 μmol/L 5-氮胞苷进行诱导,4周后用于移植,在移植前2 h行DAPI标记。心肌梗死组、细胞移植组大鼠建立急性心肌梗死模型,假手术组只穿线不结扎冠状动脉。造模后7 d,细胞移植组将2×1010 L-1骨髓间充质干细胞悬液分多点注射到心肌梗死的边缘区和中心区,心肌梗死组、正常对照组、假手术组均注射等量生理盐水。 主要观察指标：荧光定量PCR法检测缝隙连接蛋白43及缝隙连接蛋白45 mRNA的表达。 结果：①干预后4,8,12周,各组正常区缝隙连接蛋白43、缝隙连接蛋白45 mRNA表达基本相似。②与正常区比较,心肌梗死组、细胞移植组缺血区的缝隙连接蛋白43 mRNA表达均显著减少(P < 0.01),缝隙连接蛋白45 mRNA表达均显著增加(P < 0.01)。③同一时间点与心肌梗死组比较,细胞移植组缺血区缝隙连接蛋白43 mRNA表达显著增高(P < 0.01),缝隙连接蛋白45 mRNA表达显著减少(P < 0.01)。 结论：课题创新性证实急性心肌梗死导致心肌缝隙连接蛋白43 mRNA水平下降,缝隙连接蛋白45 mRNA水平升高。5-氮胞苷诱导的同种异体骨髓间充质干细胞移植后,能上调梗死边缘区缝隙连接蛋白43 mRNA的表达,并下调边缘区缝隙连接蛋白45 mRNA的表达。     

5-氮胞苷诱导和未诱导骨髓间充质干细胞移植入梗死心肌后心功能变化的比较*☆

背景：已证实在体外经5-氮胞苷诱导后,骨髓间充质干细胞可向类心肌细胞转化,但移植这种经诱导的髓间充质干细胞是否更有利于急性心肌梗死后心功能改善,尚有争议。 目的：对比观察经5-氮胞苷诱导和未经诱导的骨髓间充质干细胞移植入急性心肌梗死组织后心功能的变化。 方法：开胸结扎左冠状动脉前降支建立新西兰兔急性心肌梗死模型,分别在心肌梗死组织周边区注射PBS,经5-氮胞苷诱导或未诱导的兔骨髓间充质干细胞。移植后3 d、4周超声心动图测定左室舒张末期容积,左室收缩末期容积及射血分数以评价心功能变化。 结果与结论：兔前降支结扎后,心功能明显下降;移植3 d后,各组动物左室舒张末期容积、左室收缩末期容积及射血分数均无显著差异,说明无论是否在体外经5-氮胞苷诱导过,骨髓间充质干细胞移植短期对兔心功能无明显改善;移植4周后,与注射PBS的动物比较,移植骨髓间充质干细胞可降低心肌梗死兔的左室舒张末期容积、左室收缩末期容积,提高射血分数,但骨髓间充质干细胞在体外是否经5-氮胞苷诱导对心功能改善程度无影响。     

骨髓间充质干细胞移植对家兔急性肺损伤的保护作用

背景：急性呼吸窘迫综合征重要病理改变是肺泡-毛细血管膜屏障的损伤,以及所导致肺泡渗出液中富含蛋白质的肺水肿。骨髓间充质干细胞能够继续分化和不断自我更新,并最终分化为多种类型细胞,这有可能为治疗肺损伤提供一个新的途径。 目的：探讨骨髓间充质干细胞移植对内毒素诱发急性肺损伤模型兔的保护作用。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2007-10/2008-01在唐都医院中心实验室完成。 材料：家兔20只,2只用于制备骨髓间充质干细胞,剩余18只随机分为3组：盐水对照组、肺损伤模型组、细胞移植组,6只/组。内毒素为Sigma公司产品。 方法：Ficoll法分离培养兔骨髓间充质干细胞,传至第3代备用。肺损伤模型组、细胞移植组兔通过向气管内滴注内毒素建立急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征模型,造模成功30 min后,细胞移植组经右侧颈静脉注入骨髓间充质干细胞悬浮液2 mL(细胞数1×105),盐水对照组、肺损伤模型组同法给予等量生理盐水。 主要观察指标：支气管肺泡灌洗液中性粒细胞数目、肺组织湿干比及蛋白含量,肺组织病理变化。 结果：湿干比值升高提示肺水肿的存在,中性粒细胞数量增加提示较重的炎性反应存在,蛋白含量升高提示肺泡-毛细血管内膜屏障受损。移植48 h后与盐水对照组比较,肺损伤模型组支气管肺泡灌洗液中性粒细胞数目、蛋白含量均明显降低(P < 0.01),湿干比明显升高(P < 0.01);与肺损伤模型组比较,细胞移植组支气管肺泡灌洗液中性粒细胞数目、蛋白含量均明显升高(P < 0.01),湿干比明显降低(P < 0.01)。苏木精-伊红染色结果显示,盐水对照组肺泡组织结构正常,肺损伤模型组肺组织出现典型的急性肺损伤改变,细胞移植组肺组织病理变化较轻。 结论：利用骨髓间充质干细胞移植可显著减轻内毒素诱导的急性肺损伤。     

同种异体骨髓间充质干细胞穴位移植：急性心肌梗死后血管新生及相关细胞因子的变化*☆

背景：骨髓间充质干细胞移植途径主要包括外周静脉注射移植、冠状动脉移植以及心肌内注射移植,但存在迁移缺少靶向性,价格高昂等局限性。 目的：观察同种异体骨髓间充质干细胞穴位移植兔急性心肌梗死后梗死区血管新生及相关细胞因子的变化。 方法：提取兔骨髓进行骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化、扩增、鉴定,并标记。将55只兔随机分为正常组与手术组。手术组急性心肌梗死后1周,再随机分为3组：穴位注射干细胞组、模型对照组、穴位注射生理盐水组。5周后,取心肌组织进行免疫组织化学BrdU染色、心肌特异性肌钙蛋白T免疫组织化学染色检测;免疫组织化学法检测梗死心肌组织血小板内皮细胞黏附因子1水平;免疫组织化学法、夹心酶联免疫法、RT-PCR法、Western-Blot法检测血管内皮细胞生长因子及免疫组织化学法检测碱性成纤维细胞生长因子。 结果与结论：穴位注射的骨髓间充质干细胞可迁移至梗死区,并可以在梗死区分化为心肌样细胞。与模型对照组及穴位注射生理盐水组比较,穴位注射骨髓间充质干细胞可使梗死区及周围组织血小板内皮细胞黏附因子1表达上调,诱导梗死区及周围组织血管新生,其机制是刺激心肌组织中碱性成纤维细胞生长因子表达上调。穴位注射骨髓间充质干细胞组梗死心肌组织中和血清中血管内皮细胞生长因子表达均无上调趋势,因此推测,血管新生由碱性成纤维细胞生长因子及未知因素诱导。     

接受骨髓间充质干细胞移植的心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠心肌组织 基质金属蛋白酶及抑制剂的变化

背景：Ⅰ型及Ⅲ型胶原含量与比例的变化是促使心脏几何形态改变、心肌收缩和舒展功能的重要因素，基质金属蛋白酶2及抑制剂是胶原代谢的主要调节物质。心肌梗死后心力衰竭大鼠接受骨髓干细胞移植后，心肌组织中这些指标会发生哪些变化？ 目的：观察接受骨髓干细胞移植治疗的心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠，心肌组织中胶原含量与比例、基质金属蛋白酶2及抑制剂的变化。 设计：随机对照实验。 单位：解放军总医院老年心血管病科和北京医科大学生物化学系。 材料：实验于2004-07/2005-12在北京医科大学生物化学系周春燕实验室完成。实验动物由北京医科大学动物实验中心提供，选取4周龄清洁级雄性SD大鼠用于骨髓间充质干细胞的制备，200~250 g清洁级雌性SD大鼠14只用于心肌梗死后心力衰竭模型的制备，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。 方法：采用梯度离心法与贴壁培养法分离纯化、扩增骨髓间充质干细胞。结扎雌性SD大鼠左冠状动脉制作急性心肌梗死后心力衰竭模型。造模成功4周后将14只大鼠随机分为2组：移植组大鼠梗死后心肌瘢痕区接受雄性SD大鼠来源的5×106骨髓间充质干细胞。对照组大鼠梗死后心肌瘢痕区接受等体积磷酸盐缓冲液。每组7只。 主要观察指标：移植治疗后21 d：①以苏木精-伊红染色和Masson染色评价左心室形态。②以免疫组织化学分析心肌基质金属蛋白酶2及抑制剂与瘢痕区Ⅰ型及Ⅲ型胶原的变化。③以Western杂交检测基质金属蛋白酶2及抑制剂蛋白的变化。 结果：14只大鼠均进入结果分析，无脱失值。与对照组大鼠比较，骨髓间充质干细胞移植大鼠心肌梗死瘢痕区Ⅰ型胶原增加，Ⅲ型胶原降低，心肌组织基质金属蛋白酶抑制剂表达增加，基质金属蛋白酶2表达降低，心室壁增厚，心室腔缩小，心功能增强。 结论：骨髓间充质干细胞移植心力衰竭大鼠后，基质金属蛋白酶2及抑制剂发生了动态变化，进而影响瘢痕区胶原比例重建，逆转心力衰竭心脏异常的胶原平衡。     

骨髓间充质干细胞在心肌梗死犬心肌内分化及对心肌细胞凋亡的影响

背景：体内移植骨髓间充质干细胞对实验动物的心肌梗死和心力衰竭有较好的改善作用，但具体机制尚不清楚。 目的：观察骨髓间充质干细胞在心肌梗死犬梗死区的分化以及对心肌细胞凋亡的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005-03/2007-12在美国Texas Heart Institute干细胞研究室进行骨髓间充质干细胞移植，在第三军医大学完成免疫组织化学染色。 材料：成年杂种犬，平均体质量25~35 kg。 方法：采用密度梯度离心法提取犬骨髓间充质干细胞，移植前以BrdU标记骨髓间充质干细胞。采用外科手术于近端冠状动脉左前降支植入布洛芬缩肌装置并结扎相连分支的方法制作犬心肌梗死模型。造模后分为实验组与对照组，实验组于损伤缺血部位注射同种异体骨髓间充质干细胞。对照组注射等量生理盐水。 主要观察指标：对移植BrdU标记的骨髓间充质干细胞的心肌梗死犬心肌梗死区组织细胞进行免疫组织化学染色，同时采用DeadEndTM Colorimetric TUNEL System对心梗标本进行凋亡细胞的染色观察。 结果： 注射骨髓间充质干细胞的心脏组织切片BrdU免疫组织化学染色可见大量细胞核呈现深褐色或黑色的阳性反应，在心脏组织的不同区域表现出不同的形态特征，其中大多数植入心肌细胞间的骨髓间充质干细胞，形态上与心肌细胞无异，而其他区域的骨髓间充质干细胞则与间质细胞较相似，无特定的形状。骨髓间充质干细胞移植组心肌梗死区凋亡的心肌细胞数少于未移植组。 结论：骨髓间充质干细胞心肌内移植后可在心肌梗死区分化成心肌细胞，并减轻犬心肌梗死后的细胞凋亡。