转化生长因子β1对长波紫外线照射皮肤成纤维细胞胰岛素样生长因子1、角质形成细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子表达的影响*☆

背景：研究认为衰老和光老化状态下生长因子的表达不一定一致,生长因子与皮肤老化的关系越来越受到重视。 目的：验证转化生长因子β1对长波紫外线照射体外培养的皮肤成纤维细胞胰岛素样生长因子1、角质细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子表达的影响 。 设计、时间及地点：以体外培养细胞为观察对象,随机重复实验,于2006-07/2008-03在解放军第四军医大学全军整形外科研究所进行。 材料：成纤维细胞来自解放军第四军医大学整形外科门诊患者包皮,采用组织块法培养获得。 方法：通过酶联免疫法(ELISA)使用不同剂量长波紫外线 (0,5 ,10,20 J/ cm2)照射体外培养的皮肤成纤维细胞,测定上清液中胰岛素样生长因子1、角质形成细胞生长因子、 血管内皮细胞生长因子的质量浓度;以长波紫外线15 J/ cm2为照射剂量,选择不同剂量转化生长因子β1即小剂量组(0.1 μg/L)、中剂量组(1 μg/L)、大剂量组(10 μg/L)对培养的皮肤成纤维细胞进行干预。 主要观察指标：不同剂量长波紫外线照射、以及转化生长因子β1处理后皮肤成纤维细胞胰岛素样生长因子1、血管内皮细胞生长因子、角质形成细胞生长因子的表达。 结果：长波紫外线照射体外培养的皮肤成纤维细胞导致胰岛素样生长因子1、角质形成细胞生长因子分泌水平下降,血管内皮细胞生长因子分泌升高;转化生长因子β1处理后,转化生长因子β1剂量依赖性地提高长波紫外线照射体外培养的皮肤成纤维细胞分泌的3种细胞因子的水平。转化生长因子β1大剂量组胰岛素样生长因子1、角质形成细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子含量明显高于长波紫外线照射组(P < 0.01)。 结论：长波紫外线照射抑制体外培养成纤维细胞中胰岛素样生长因子1、角质形成细胞生长因子表达, 促进血管内皮细胞生长因子表达。转化生长因子β1可提高长波紫外线照射体外培养的皮肤成纤维细胞分泌胰岛素样生长因子1、角质形成细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子3种细胞因子的水平,有利于真皮内结构的恢复和重建。     

转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1与髓核细胞诱导脂肪间充质干细胞向髓核样软骨细胞分化的比较

背景：以往研究脂肪间充质干细胞培养方式多为单层培养，诱导方式主要集中于细胞因子的方法，而椎间盘体内微环境，除细胞因子对细胞影响外，在其三维环境中细胞间的相互作用还值得进一步研究。 目的：在体外分别通过髓核细胞和转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1两种条件诱导，观察脂肪间充质干细胞向髓核细胞分化的差异。 方法：分别单层培养兔的脂肪间充质干细胞与髓核细胞细胞，脂肪间充质干细胞培养至3代经鉴定后，按5×106个细胞制成微球，置于Transwell培养板中培养，分别通过髓核细胞微球及转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1诱导；于诱导前、诱导7，14 d，观察细胞形态变化，并通过RT-PCR对Ⅱ型胶原、蛋白多糖水平进行测定。 结果与结论：在体外诱导7，14 d，两组脂肪间充质干细胞微团体积、形态无明显区别。RT-PCR检测结果显示7 d两组与髓核诱导组均有Ⅱ型胶原及蛋白多糖mRNA表达，但转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1组表达更强；诱导14 d髓核诱导组Ⅱ型胶原及蛋白多糖mRNA表达明显增高，优于转化生长因子 β1/胰岛素样生长因子1组。结果表明，在体外髓核细胞和转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1对脂肪间充质干细胞进行诱导均有促进其向髓核细胞分化作用,而转化生长因子β1、胰岛素样生长因子1为正常髓核细胞分泌重要因子，说明髓核细胞对脂肪间充质干细胞的诱导之间除细胞因子作用外，尚存在相互促进增殖分化作用。     

小鼠成骨细胞Wnt信号通路相关因子表达与胰岛素样生长因子1的影响

背景：胰岛素样生长因子1可促进细胞增殖、分化,但其具体作用机制尚不清楚。 目的：观察胰岛素样生长因子1对小鼠成骨细胞增殖﹑分化的影响,及Wnt信号通路相关因子mRNA的表达。 方法：向体外培养的小鼠成骨细胞中加入25 μg/L的胰岛素样生长因子1,分别于培养的第1,2,3,4,5天用CCK-8比色法检测细胞增殖率;于培养的第3,6,9天应用酶联免疫法检测细胞内碱性磷酸酶活性;细胞培养第3天提取总RNA,采用Real-time RT-PCR检测Wnt-3a,低密度脂蛋白受体相关蛋白5,β-catenin mRNA的表达。 结果与结论：25 μg/L胰岛素样生长因子1能够促进成骨细胞增殖,提高碱性磷酸酶活性,而且明显增加成骨细胞中Wnt-3a、低密度脂蛋白受体相关蛋白5、β-catenin mRNA的表达(P < 0.05)。说明胰岛素样生长因子1能够促进成骨细胞的增殖和分化,Wnt信号通路参与了该调控过程。     

胰岛素样生长因子1和成纤维细胞生长因子7与毛乳头细胞的生长*

背景：毛乳头细胞凝集性生长与其诱导毛发生长有关。毛乳头细胞分泌的多种生长因子如胰岛素样生长因子1、成纤维细胞生长因子7可能对毛乳头细胞生长具有重要的影响。 目的：观察正常人毛乳头细胞的增长与生长方式与胰岛素样生长因子1、成纤维细胞生长因子7的相关性。 方法：采用二步酶消化法分离培养毛乳头细胞,免疫组化法和流式细胞仪分别检测两种生长因子在凝集性与非凝集性生长的毛乳头细胞中的表达,MTT法检测2.5~100 μg/L质量浓度胰岛素样生长因子1对人毛乳头细胞增殖的影响。 结果与结论：胰岛素样生长因子1与成纤维细胞生长因子7均表达于细胞胞浆,但表达量随时间减弱,其中第3代明显比第9代毛乳头细胞中成纤维细胞生长因子7的表达强烈(P < 0.05)。与对照组相比,不同质量浓度胰岛素样生长因子1均有明显促进毛乳头细胞增殖的作用(P < 0.05),其中以2.5 μg/L最为显著。提示毛乳头细胞的凝集性生长状态的改变可能与胰岛素样生长因子1、成纤维细胞生长因子7表达下降有关,胰岛素样生长因子1可明显刺激毛乳头细胞增殖。     

胰岛素样生长因子-1神经保护作用的研究进展

胰岛素样生长因子－1（Insulin-like growth factor-1，IGF-1）是一种与机体组织分化、增殖和成熟有关的重要细胞因子。IGF-1与其受体结合具有促进细胞分化增殖、抑制凋亡和类胰岛素的代谢作用，并还可能与其他神经营养因子协同发挥神经保护作用。其中，IGF-1保护缺血性脑损伤的可能机制有：甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸（glycine-proline-glutamate，GPE）对神经细胞的保护作用、抗凋亡作用、阻止L型钙通道的开放、对一氧化氮合酶（NOS）的双重作用以及对抗兴奋性氨基酸的毒性等。随着临床实验的开展，IGF-1有可能作为脑保护剂用于缺血性脑损伤的治疗。     

胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子、转化生长因子β1对

背景：生长因子可调整椎间盘细胞的增殖、分化及基质代谢,用于椎间盘退变的生物学治疗,既往的研究偏重于成骨性生长因子对髓核细胞的作用,对纤维环细胞的研究相对较少。 目的：观察体外培养条件下胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子、转化生长因子β1对人退变纤维环细胞生物学活性的影响。 设计、时间及地点：对照观察实验,于2007-11/2008-12在解放军南京军区福州总医院完成。 材料：腰椎间盘手术患者的纤维环组织。 方法：结合酶消化法和组织块培养法,体外单层培养人退变纤维环原代细胞。传代后通过免疫组织化学染色鉴定细胞。对传3代细胞分别采用不同生长因子干预,分为 100 μg/L胰岛素样生长因子1组、10 μg/L 血小板源性生长因子组、10 μg/L 转化生长因子β1组、100 μg/L 胰岛素样生长因子 1+ 10 μg/L 血小板源性生长因子组、100 μg/L 胰岛素样生长因子1+ 10 μg/L 转化生长因子β1组、10 μg/L 血小板源性生长因子+10 μg/L 转化生长因子β1组、100 μg/L 胰岛素样生长因子1+10 μg/L血小板源性生长因子+10 μg/L 转化生长因子β1组,以不加生长因子为对照组。 主要观察指标：免疫组织化学染色观察传3代细胞。干预3,6 d后,采用MTT法测定传3代细胞增殖,ELISA法测定细胞培养上清液中Ⅰ、Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖质量浓度。 结果：传3代细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性。胰岛素样生长因子1促进人退变纤维环细胞增殖,轻度抑制细胞合成Ⅰ型胶原,促进合成Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖,促Ⅱ型胶原合成作用轻度强于转化生长因子β1。血小板源性生长因子促进细胞增殖,作用强于胰岛素样生长因子1,其抑制细胞合成Ⅰ型胶原,轻度促进合成Ⅱ型胶原,无促合成聚集蛋白聚糖作用。转化生长因子β1抑制细胞增殖,促进合成Ⅰ、Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖,促聚集蛋白聚糖合成作用强于胰岛素样生长因子1。多种因子联合作用较单种未见明显优势,未能呈现协同效应。 结论：胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子、转化生长因子β1明显改变人退变纤维环细胞的生物学活性,可应用于对人类椎间盘退变的生物学治疗。     

胰岛素样生长因子1对糖尿病大鼠脑缺血再灌注后神经细胞凋亡的影响

背景：胰岛素样生长因子1是近年来发现的一种神经营养因子。 目的：验证胰岛素样生长因子1对局灶性脑缺血糖尿病大鼠的神经功能、神经细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2006-10/2008-03在齐齐哈尔医学院实验中心完成。 材料：Wistar大鼠40只,体质量200~250 g,雌雄不限,鼠龄2.0~3.0月。 方法：线栓法制作糖尿病大鼠大脑中动脉栓塞模型,随机分成胰岛素样生长因子1组和对照组,每组12只。胰岛素样生长因子1组连续皮下注射胰岛素样生长因子1,10 µg/(kg•d),对照组注射等量的生理盐水,两组分别注射7,14 d,每时间点取6只。 主要观察指标：对两组大鼠进行神经功能缺损评分,采用TUNEL染色计数脑缺血周边区神经细胞凋亡数,免疫组织化学方法观察Bcl-2、Bax蛋白的表达。 结果：胰岛素样生长因子1组神经功能缺损评分明显低于对照组(P < 0.01); 胰岛素样生长因子1组缺血周边区的TUNEL阳性细胞数均明显少于对照组(P < 0.01); Bcl-2蛋白免疫阳性细胞明显多于对照组(P < 0.01),Bax蛋白免疫阳性细胞明显少于手术对照组(P < 0.01)。 结论：胰岛素样生长因子1可增加糖尿病脑缺血之后缺血周边区Bcl-2蛋白的表达,减少Bax蛋白的表达,拮抗神经细胞凋亡,改善神经功能。     

胰岛素样生长因子1在糖尿病骨折大鼠骨痂组织中对成骨细胞增殖和骨钙素表达的影响☆

背景：有研究表明,糖尿病患者骨折愈合过程中局部骨痂组织胰岛素样生长因子1明显降低,成骨细胞增殖能力下降。 目的：观察以胰岛素样生长因子1治疗糖尿病大鼠骨折愈合过程中骨痂组织成骨细胞增殖和骨钙素表达,分析胰岛素样生长因子1在糖尿病大鼠骨折愈合过程中的作用。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2008-09/12在昆明医学院动物实验中心完成。 材料：40只SD雄性大鼠,30只腹腔内注射链脲佐菌素破坏胰岛细胞诱导为糖尿病大鼠后,随机分为胰岛素样生长因子1组、胰岛素组、模型对照组,10只为正常对照大鼠,腹腔内注射等容量生理盐水。 方法：4组大鼠右胫骨上段骨折后,胰岛素样生长因子1组用胰岛素样生长因子1治疗,30 μg/kg ,胰岛素组用胰岛素治疗,6~8 U,模型对照组及正常对照组未进行治疗。 主要观察指标：伤后第1,2,4,6周X射线片观察骨折愈合情况,光镜下观察骨痂内成骨细胞数量,免疫组织化学测定血清骨钙素表达。 结果：胰岛素样生长因子1组、胰岛素组X射线片显示骨痂生成量多,骨折愈合程度明显优于模型对照组(P < 0.05),胰岛素样生长因子1组、胰岛素组差异无显著性意义。光镜观察显示,胰岛素样生长因子1组、胰岛素组成骨细胞数量明显多于模型对照组,但低于正常对照组。各组血清骨钙素均呈上升趋势,在第2周达到峰值,第4周下降,至第6周进一步下降。模型对照组骨钙素升高幅度明显低于正常对照组(P < 0.01),并且低于胰岛素样生长因子1组、胰岛素组。胰岛素样生长因子1组、胰岛素组、正常对照组的骨钙素差异无显著性意义。 结论：糖尿病大鼠骨折愈合过程中,用胰岛素样生长因子1治疗可提高骨钙素水平,促进成骨细胞增殖,与胰岛素治疗效果相当。     

胰岛素样生长因子1基因转染骨髓基质干细胞治疗裸鼠骨缺损☆

背景：众多的研究已证实胰岛素样生长因子1在成骨细胞的增殖、分化、基质合成中发挥重要的调控作用，并参与调节骨改建及修复的一系列过程。 目的：观察人胰岛素样生长因子1基因修饰的骨髓基质干细胞对骨损伤修复的促进作用及能否构建出具有良好生物学活性的组织工程人工骨，提高骨缺损修复质量。 设计、时间及地点：对比观察，实验于2004-03/2005-05在苏州大学实验动物中心完成。 材料：体外将胰岛素样生长因子1基因通过反转录病毒转入骨组织工程种子细胞骨髓基质干细胞，并与具有良好生物学活性的脱钙骨基质材料复合。 方法：BalB/C裸鼠15只制备颅骨8 mm缺损模型，随机数字表法分为3组，每组5只。胰岛素样生长因子1转染细胞组和空载体细胞组将两种不同植入物脱钙骨基质/胰岛素样生长因子1转染细胞和脱钙骨基质/空载体细胞分别植入颅骨缺损部位，空白对照组仅造模，不进行任何干预。造模后4周处死动物，取出颅骨进行组织学观察。 主要观察指标：①反转录-聚合酶链反应检测转染细胞胰岛素样生长因子1 mRNA的表达。同时收集转染后细胞上清，用蛋白免疫印迹检测重组胰岛素样生长因子1的表达。②扫描电镜观察细胞/基质材料复合物共培养3，6 d后的生长情况。③颅骨缺损模型大体观察。④苏木精-伊红染色观察造模后4周各组颅骨缺损的修复情况。 结果：①经反转录-聚合酶链反应及蛋白免疫印迹检测，胰岛素样生长因子1 基因修饰的骨髓基质干细胞中有胰岛素样生长因子1 mRNA及蛋白的表达。②扫描电镜观察转染细胞与脱钙骨基质共培养3 d时胰岛素样生长因子1转染细胞组脱钙骨基质材料表面已有大量细胞黏附并向深部空隙长入；6 d时脱钙骨基质表面黏附的细胞处已分泌出大量胶原纤维；而空载体细胞组各时间点黏附细胞数和胶原纤维产生量则均较少。③造模后4周各组植入物周围均无明显炎症反应，胰岛素样生长因子1转染细胞组植入物与颅骨缺损结合紧密；而空载体细胞组植入物可推动；空白对照组骨缺损处无新骨形成。④苏木精-伊红染色可见胰岛素样生长因子1转染细胞组植入物与颅骨缺损结合紧密，骨折缺损区有新骨及血管形成；空载体细胞组骨缺损区新骨形成较少；空白对照组缺损未见修复。 结论：胰岛素样生长因子1转染的骨髓基质干细胞/脱钙骨基质复合物具有较好的骨缺损修复功能。     

模拟失重状态下成骨细胞胰岛素样生长因子1基因表达与降钙素的干预

背景：航天飞行、长期卧床等低重力负荷状态会引起骨吸收和骨形成的代谢紊乱,导致骨质疏松。有研究显示降钙素有直接促进成骨细胞增殖的作用,并可增加成骨细胞胰岛素样生长因子1 mRNA的表达。 目的：观察降钙素和体外模拟失重状态对成骨细胞功能及胰岛素样生长因子1基因表达的影响。 方法：采用二次酶消化法提取新生SD大鼠颅骨的成骨细胞,凝胶化形成成骨细胞海藻酸钠微包囊后进行实验。实验分为正常重力组、模拟失重组、模拟失重+降钙素(10,40,80 IU/L)组。将细胞置于模拟失重三维回转培养器中培养72 h后,检测成骨细胞的增殖、凋亡及碱性磷酸酶活性;采用RT-PCR 方法检测胰岛素样生长因子1、碱性磷酸酶、骨钙素mRNA的表达。 结果与结论：与正常重力组比较,模拟失重组细胞增殖率及培养基中碱性磷酸酶活性均明显降低(P < 0.01),胰岛素样生长因子1、骨钙素、碱性磷酸酶mRNA表达减少,凋亡增多;与模拟失重组比较,模拟失重+降钙素组细胞增殖率,胰岛素样生长因子1、骨钙素、碱性磷酸酶mRNA表达均有所增加,但无剂量依赖关系。说明降钙素可通过上调胰岛素样生长因子1 mRNA表达改善模拟失重条件下成骨细胞的增殖与分泌功能。     

脑损伤并股骨骨折愈合患者骨痂中骨形态发生蛋白2和胰岛素样生长因子1的表达

背景：临床观察及基础研究发现,合并颅脑损伤可加速骨折愈合,但具体机制尚不明确。 目的：观察脑损伤后SD大鼠股骨骨折愈合过程中骨痂骨形态发生蛋白2和胰岛素样生长因子1的表达,探讨脑损伤对大鼠股骨骨折愈合的影响及其作用机制。 设计、时间及地点：随机对照,基因水平动物实验,于2007-05/2008-03在华北煤炭医学院骨科实验室完成。 材料：SPF级10周龄雄性SD大鼠48只。 方法：48只SD大鼠随机分成2组,每组24只。参考文献建立大鼠单纯股骨骨折模型和脑损伤合并股骨骨折模型。于术后7,14,28 d分批处死动物,行X射线摄片后,取股骨骨痂,分别用于提取总RNA进行实时荧光定量聚合酶链反应。 主要观察指标：以X射线摄片观察骨折愈合情况;以苏木精-伊红染色、免疫组织化学染色观察骨痂组织骨形态发生蛋白2和胰岛素样生长因子1的表达。 结果：X射线摄片示,与单纯骨折组相比,骨折合并脑损伤组骨痂出现早,同一时间骨痂更大。免疫组织化学显示,造模7,14 d脑损伤合并股骨骨折组骨形态发生蛋白2、胰岛素样生长因子1的平均阳性细胞百分率高于单纯骨折组。实时荧光定量聚合酶链反应结果发现,脑损伤合并股骨骨折组7,14 d骨形态发生蛋白2基因mRNA表达高于单纯骨折组,7,14,21 d胰岛素样生长因子1基因mRNA表达高于单纯骨折组。　 结论：与单纯骨折组相比,骨折合并脑损伤组大鼠骨折愈合加速,骨痂中骨形态发生蛋白2和胰岛素样生长因子1的表达显著性升高,提示脑损伤促进了骨折愈合的机制可能与此有关。     

重组人胰岛素样生长因子1工程菌的高密度发酵

背景：胰岛素样生长因子1是人体内重要的细胞调控因子，已用于治疗糖尿病等多种疾病，工程菌发酵生产工艺研究是胰岛素样生长因子1实现产业化从而扩大临床应用的关键因素。 目的：探讨表达重组人胰岛素样生长因子1工程菌的高密度发酵与表达条件。 设计、时间及地点：酶基因工程实验，于2007-05/2008-05在浙江树人大学生物技术实验室完成。 材料：重组人胰岛素样生长因子1大肠杆菌表达菌株E. coli BL21(DE3)/pET22a-IGF-1由浙江树人大学生物技术实验室保存。高密度发酵补料培养基为：葡萄糖 300 g/L，蛋白胨 40 g/L，酵母粉 10 g/L，Na2HPO4 280 mmol/L，NaH2PO4•2H2O 120 mmol/L，MgSO4 10 mmol/L，氨苄青霉素100 mg/L。 方法：菌株活化后，进行摇瓶发酵试验，分别改变培养基种类、诱导剂异丙基硫代半乳糖苷浓度、诱导时间等参数，优化摇瓶发酵条件。依据摇瓶发酵优化条件，采用自控5 L发酵罐进行分批补料发酵试验。培养分分批培养和分批补料2个阶段。采用pH反馈流加的方式补料，在对数生长中后期开始诱导，加入异丙基硫代半乳糖苷至设计终浓度，培养4~6 h。 主要观察指标：重组人胰岛素样生长因子1工程菌的发酵与产物表达情况。菌体浓度与菌体干重测定，目的蛋白表达量的测定，发酵液葡萄糖浓度的测定。 结果：以2×YT＋5 g/L葡萄糖为发酵培养基，经0.8 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷诱导5 h，通过控制溶解氧以及pH反馈补料方式，实现工程菌高密度发酵与目的蛋白高效表达，每升发酵液收获干菌体50.1 g/L ，重组人胰岛素样生长因子1含量达 5.25 g/L。 结论：实验成功建立了重组人胰岛素样生长因子1工程菌优化的高密度发酵工艺，为重组人胰岛素样生长因子1的下游纯化和工业化生产奠定了基础。     

转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ及其协同作用对人皮肤成纤维细胞增殖的影响

背景：皮肤成纤维细胞注射移植为颜面部皱纹及微小凹陷等治疗提供了一种全新的方法,然而成纤维细胞的获取及体外快速扩增往往需要较长时间,以至于不能满足临床需要。 目的：观察转化生长因子β1、胰岛素样生长因子Ⅰ及两者协同作用对体外培养人皮肤成纤维细胞增殖的影响。 方法：人皮肤成纤维细胞原代培养,取第3代细胞种入96孔板,加入不同质量浓度的转化生长因子β1或胰岛素样生长因子Ⅰ作用于细胞,分别作用3,6,9 d采用MTT法检测细胞增殖情况。同法设4个组,分别为：阴性对照组、转化生长因子β1最佳效应浓度组、胰岛素样生长因子Ⅰ最佳效应浓度组、两者最佳效应浓度联用组,作用3,6,9 d采用MTT法检测增殖情况。 结果与结论：作用6 d和9 d,10.0 μg/L转化生长因子β1、50.0 μg/L胰岛素样生长因子Ⅰ组与对照组相比均有促细胞增殖效应(P < 0.05),此即为各生长因子最佳效应浓度。作用6 d和9 d,转化生长因子β1与胰岛素样生长因子Ⅰ各浓度实验组与相应对照组相比,差异均有显著性意义(P < 0.05)。10.0 μg/L转化生长因子β1与50.0 μg/L胰岛素样生长因子Ⅰ联合作用9 d可显著促进细胞增殖,与其他组相比,差异有显著性意义(P < 0.05)。提示转化生长因子β1、胰岛素样生长因子Ⅰ均可体外促进人皮肤成纤维细胞增殖,最佳效应浓度联用促增殖效果优于各自单独使用。     

胰岛素样生长因子1对人脂肪来源的间充质干细胞向软骨细胞定向诱导分化的作用☆

背景：近年研究者发现胰岛素样生长因子1还可以诱导骨髓来源间充质干细胞向软骨细胞方向分化,但目前尚未见胰岛素样生长因子1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞方向分化及在此过程中与转化生长因子β1相互作用的报道。 目的：观察胰岛素样生长因子1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞定向分化的可能性及在诱导分化中和转化生长因子β1的相互作用。 方法：获取脂肪来源间充质干细胞,以2×105 cells/cm2的密度接种于培养瓶,使用含胰岛素样生长因子1或(和)转化生长因子β1的无胰岛素软骨诱导剂诱导脂肪来源间充质干细胞。2周后获取细胞,制备细胞爬片,进行甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,观察细胞内高硫酸化的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原着色情况。RT-PCR检测Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan及Sox9 mRNA的表达。 结果与结论：加入诱导剂后,甲苯胺蓝染色显示3个诱导组细胞呈多角形,胞浆及胞膜呈蓝色异染。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色显示3个诱导组细胞胞浆及胞膜呈棕黄色着色。RT-PCR检测显示胰岛素样生长因子+转化生长因子组Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan、Sox9 mRNA的表达均显著强于胰岛素样生长因子组和转化生长因子组,胰岛素样生长因子组和转化生长因子组显著强于对照组,而胰岛素样生长因子组与转化生长因子组差异无显著性意义。提示胰岛素样生长因子1可以单独诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞分化,表达软骨细胞特异性细胞表型,胰岛素样生长因子1与转化生长因子β1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞分化有协同作用。     

胰岛素样生长因子1对小鼠成骨细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响

背景：胰岛素样生长因子1是骨形成的调节因子,具有促进有丝分裂、促进成骨等作用。由骨细胞所产生的胰岛素样生长因子1在调节成骨细胞和破骨细胞介导的骨骼重建中起着重要的作用。 目的：观察胰岛素样生长因子1作用后,小鼠成骨细胞的增殖和碱性磷酸酶的表达。 方法：在体外培养的小鼠成骨细胞中分别加入25,50,100及200 μg/L的胰岛素样生长因子1,于培养的第1,2,3,4,5天用Cell Counting Kit-8比色法检测细胞增殖率;用流式细胞仪检测细胞的增殖周期和凋亡率;于培养的第3,6,9天应用酶联免疫法检测细胞内碱性磷酸酶活性。 结果与结论：胰岛素样生长因子1质量浓度在25~200 μg/L时,对小鼠成骨细胞的增殖率有明显的促进作用(P < 0.05),且呈明显的浓度依赖效应。当胰岛素样生长因子1质量浓度在200 μg/L时,能明显提高细胞S期所占的比例。说明胰岛素样生长因子1可加速细胞的增殖活动,以保证参与骨改建的成骨细胞数量而促进骨组织再生。同时,胰岛素样生长因子1在25~200 μg/L时,能显著提高细胞内碱性磷酸酶活性(P < 0.05),促进成骨细胞分化。     

单核细胞向淋巴管内皮细胞诱导分化的潜能*

背景：有研究报道,在包括血管内皮生长因子在内的多种因子诱导下,单核细胞能够转化成血管内皮细胞;而在体外条件下,单核细胞能否转化成淋巴管内皮细胞,至今未见报道。 目的：观察单核细胞在炎症环境中转分化成淋巴管内皮细胞的可能性。 方法：采用Ficoll密度梯度离心法分离成人新鲜外周血单核细胞,用细胞培养基培养,然后分别用纤维连接蛋白、肿瘤坏死因子α诱导24 h。用RT-PCR和免疫细胞化学方法检测单核细胞对淋巴管内皮特异性标志物LYVE-1、Podoplanin、Prox1、血管内皮生长因子受体3以及内皮细胞抗原vWF、内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子受体2的基因和蛋白表达。 结果与结论：单核细胞在诱导之前,对LYVE-1表达阳性,对Podoplanin、Prox1、血管内皮生长因子受体3、vWF、内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子受体2表达均为阴性;经上述因子刺激后,单核细胞对Podoplanin、Prox-1、血管内皮生长因子受体3表达阳性,vWF、内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子受体2表达仍呈阴性。提示纤维连接蛋白、肿瘤坏死因子α均能有效刺激单核细胞表达淋巴管内皮标志物。     

胰岛素样生长因子1基因转染成肌细胞促小鼠胫骨骨折愈合的作用

背景：随着基因治疗的研究发展,将转有胰岛素样生长因子1基因的细胞移植入损伤区,达到该基因在体内的持续表达已可行,并有可能解决骨折患者骨不连及骨延迟愈合等难题。 目的：观察携带人胰岛素样生长因子1基因的成肌细胞体内局部多点注射对C57BL/6J小鼠胫骨骨折愈合的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2007-01/2008-04在汕头大学医学院完成。 材料：8周龄雄性C57BL/6J小鼠42只,体质量22~25 g,建立左胫骨骨折的动物模型。 方法：42只小鼠随机数字表法分为2组,每组21只。实验组于骨折处周围肌肉中多点注射0.3 mL转人胰岛素样生长因子1基因成肌细胞悬液;对照组注射0.3 mL生理盐水。分别在造模后2,3,4周每组各随机取7只小鼠处死,取材,行苏木精-伊红染色。 主要观察指标：各组动物骨折部位形成骨痂面积的大小和组成成分的变化;外源性细胞在体内存活及表达人胰岛素样生长因子1情况;各组动物骨密度及骨痂细胞生长情况。 结果：①实验组转基因成肌细胞BrdU及人胰岛素样生长因子1免疫组织化学染色均阳性,4周实验组平均灰度值虽稍高于2周实验组,但差异无显著性意义(P > 0.05)。②携人胰岛素样生长因子1基因的成肌细胞移植入C57BL/6J小鼠胫骨骨折处周围肌肉中可存活4周以上,并能稳定地分泌人胰岛素样生长因子1。③实验组造模后各时间点外骨痂中小梁骨占骨痂总面积的百分比均高于对照组,其中第3,4周经F检验差异有显著性意义(P < 0.05);4周实验组骨痂骨密度高于对照组(P < 0.05)。④电镜观察可见实验组骨生成细胞的数量、活跃程度和胶原纤维的数量、分布均优于对照组。 结论：局部注射转人胰岛素样生长因子1基因的成肌细胞可以促进C57BL/6J小鼠胫骨骨折的愈合。     

结缔组织生长因子及其胶原在硬皮病组织中的表达

背景：近年来，大量文献报道结缔组织生长因子作为转化生长因子β的下游效应因子，是最重要的致纤维化生长因子，在多种纤维化疾病中高表达。 目的：观察结缔组织生长因子在硬皮病组织中的表达情况及与其上、下游效应基因表达的关系，探讨结缔组织生长因子在硬皮病组织中的促纤维化机制。 设计、时间及地点：对照观察实验，于2008-05/11在解放军广州军区广州总医院医学实验科完成。 材料：组织标本均来源于解放军广州军区广州总医院整形外科患者，正常皮肤来自整形手术中切除的多余皮肤。 方法：收集硬皮病皮肤组织、增生性瘢痕组织及正常皮肤组织标本，免疫组化检测结缔组织生长因子的表达，反转录-聚合酶链式反应方法检测结缔组织生长因子、转化生长因子β1、Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原mRNA表达，Western blotting检测结缔组织生长因子蛋白的表达。 主要观察指标：①结缔组织生长因子蛋白在硬皮病皮肤组织中的表达和定位情况。②结缔组织生长因子、转化生长因子β1、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA的相对表达量。③比较增生性瘢痕、硬皮病和正常皮肤组织中结缔组织生长因子蛋白表达量的情况。 结果：免疫组织化学染色发现，结缔组织生长因子在基底细胞和角质形成细胞中有强阳性表达，在真皮成纤维细胞中亦有阳性表达。硬皮病皮肤组织及增生性瘢痕组织中结缔组织生长因子、转化生长因子β1、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的mRNA过表达，而正常皮肤组织无或仅有极弱表达。Western blotting结果显示硬皮病皮肤组织有明显的结缔组织生长因子蛋白表达带。 结论：在硬皮病纤维化过程中，结缔组织生长因子可能是重要的调控因子之一，结缔组织生长因子可能与转化生长因子β1协同作用促进细胞外基质合成。     

胰岛素样生长因子1与转化生长因子β2促进组织工程软骨构建的体外实验

背景：软骨组织的再生能力差,软骨组织工程能利用较少的细胞、支架材料和细胞因子对缺损进行修复。 目的：观察胰岛素样生长因子1与转化生长因子β2联合应用对组织工程软骨形成的影响。 方法：用酶消化法获取人软骨细胞,将培养的细胞以4×109 L-1的细胞浓度接种在藻酸钙凝珠支架上,分别加入200 μg/L胰岛素样生长因子1和(或)1 μg/L转化生长因子β2进行立体培养。于培养的第3,5,7,9,11,13天,进行细胞计数,观察软骨细胞的增殖情况。培养2周后,进行大体形态观察和阿尔新蓝-过碘酸雪夫氏染色 (AB-PAS)及抗Ⅱ型胶原免疫组织化学染色。 结果与结论：细胞计数及免疫组织化学染色显示,胰岛素样生长因子1和转化生长因子β2均能促进软骨细胞增殖和软骨相关基质黏多糖及Ⅱ型胶原的分泌,其中胰岛素样生长因子1的作用主要体现在促细胞增殖方面,而转化生长因子β2的作用主要体现在促进软骨相关基质形成方面,二者联合应用具有促进组织工程软骨形成的协同作用。     

重组pEGFP-N1-IGF-1质粒体内转染骨质疏松大鼠的可行性

背景：胰岛素样生长因子1水平的下降与骨质疏松密切相关,目前应用基因技术是骨质疏松等骨代谢疾病治疗的发展方向,但病毒载体可能引起严重免疫反应,质粒重组体pEGFP-N1-IGF-1活体转染骨质疏松大鼠可能成为一种有效的治疗手段。 目的：观察质粒重组体pEGFP-N1-IGF-1转染骨质疏松大鼠中胰岛素样生长因子1的表达。 方法：雌性SD大鼠随机分为假手术组、pEGFP-N1组和pEGFP-N1-IGF-1组。后2组予双侧卵巢切除。术后12周,3组依次给予生理盐水、pEGFP-N1载体和质粒重组体pEGFP-N1-IGF-1分别复合脂质体转染。转染后48 h荧光活体成像及肝脏切片观察,定期测定血清胰岛素样生长因子1质量浓度。 结果与结论：转染后pEGFP-N1组和pEGFP-N1-IGF-1组大鼠均可见全身大部出现明显荧光表达,以肝脏及尾部为著,肝脏切片镜下观察可见明显荧光表达。去卵巢大鼠血清胰岛素样生长因子1质量浓度显著降低(P < 0.05);pEGFP-N1-IGF-1转染使去卵巢大鼠血清胰岛素样生长因子1质量浓度明显升高(P < 0.05),而后随时间延长而逐渐降低(P < 0.05)。结果证明质粒重组体pEGFP-N1-IGF-1能够在骨质疏松大鼠体内成功转染并表达胰岛素样生长因子1蛋白,为应用胰岛素样生长因子1基因治疗骨质疏松症提供了理论基础。