转基因CTL的构建及其生物学特性的研究

目的 :构建TNF α基因转染的CTL ,并对其生物学特性进行研究。方法 :用重组逆转录病毒载体介导将TNF α基因导入CTL ,构建转基因CTL。检测其增殖能力 ,TNF α分泌量、细胞表型 ,观察其对BEL74 0 4的体内、外抗肿瘤活性。结果 :转基因CTL的形态、增殖活性及细胞表型与CTL相似。但具有高效表达TNF α的能力 ,72h表达量为 4 10pg mL。转基因CTL对BEL74 0 4具有较高的体外杀伤作用 ,其杀伤活性与作用时间及效靶细胞比正向相关。转基因CTL对荷瘤裸鼠过继免疫后 ,移植瘤的生成延迟、生长减慢 ,成瘤率降低。结论 :转基因CTL的构建为肿瘤过继免疫治疗提供新型的效应细胞 ,具有进一步研究的价值     

人TNFα基因转染的人肝癌细胞稳定高表达克隆SMMC7721-TNF体外抗瘤活性及其可能机制的初步研究

应用逆转录病毒载体介导人TNFα基因感染人肝癌细胞株SMMC7721，经G418筛选获得一稳定高表达SMMC7721-TNF，观察SMMC7721-TNF细胞及其培养液上清对SMMC7721和BEL7404肝癌细胞的抗瘤效应，结果表明SMMC7721-TNFα细胞本身对两种细胞均无明显的杀伤作用，但其培养液上清对这两种细胞均具有明显的抑制作用，     

携带mda7/IL24的三调控增殖腺病毒治疗肝癌的体外实验

目的：构建缺失E1A区24bp，由端粒酶反转录酶基因启动子和缺氧基因启动子调控的增殖腺病毒SG600-IL24，研究人白细胞介素24（interleukin 24，IL24）在肝癌细胞内的表达水平和SG600-IL24的增殖情况及其对肝癌细胞的杀伤作用。方法：利用DNA克隆和重组技术，构建SG600-IL24。ELISA检测IL24在肝癌细胞SMMC-7721、BEL4404和正常成纤维细胞BJ内的表达。半数组织培养感染剂量（50％ tissue culture infectious dose，TCID50）法检测SG600-IL24在3种细胞内48和96h的增殖情况。MTT法和细胞病理效应（cytopathic effect，CPE）染色法检测SG600-IL24在不同MOI值对3种细胞的杀伤作用。结果：IL24在SMMC-7721和BEL-7404细胞内高表达而在BJ细胞内低表达。感染48和96h后，SG600-IL24在SMMC-7721、BEL-7404和BJ细胞内分别增殖794和7940倍、622和7810倍、20和200倍。MTT结果显示，杀伤50％和90％的SMMC-7721、BEL-7404和BJ细胞所需SG600-IL24的MOI值分别为0．3和5，3和20，50和150。CPE染色显示，SG600-IL24对肝癌细胞SMMC-7721和BEL-7404有明显杀伤作用，而对BJ细胞无明显影响，并且该病毒的杀伤能力比增殖腺病毒ZD55-IL24和非增殖腺病毒Ad-IL24强。结论：SG600-IL24高效感染肝癌细胞SMMC-7721和BEL-7404后，病毒增殖活跃，IL24的表达量显著升高。SG600-IL24对此2种肝癌细胞有良好的特异性杀伤作用，而对正常细胞没有明显影响，为应用该病毒治疗肝癌的体内研究建立了基础。     

肺癌肿瘤全溶物脉冲自体树突状细胞体外诱生T细胞抗肿瘤反应的研究

目的　探讨非小细胞肺癌 (NSCLC)患者全瘤溶解物 (WTL)冲击的自体树突状细胞 (DCs)瘤苗体外诱生T细胞介导的抗肿瘤反应。方法　在含重组人粒细胞 巨噬细胞 集落刺激因子 (rhGM CSF)和重组人白细胞介素 4 (rhIL 4 )的培养条件下 ,以 10例患者的贴壁外周血单核细胞 (PBMCs)衍生不成熟的树突状细胞 (imDCs) ,分别添加肿瘤坏死因子 (TNFα)、自体WTL或WTL TNFα诱导成熟 ,即分别为DCs/TNF、DCs/WTL和 DCs/WTL ,用流式细胞仪和混合淋巴细胞反应 (MLR) ,检测细胞表面分子的表达变化及其刺激异基因或同基因的T细胞增殖能力。将 DCs/WTL和自体T细胞共培养1～ 2周 ,以诱导细胞毒性T淋巴细胞 (CTL) ,用计数γ 干扰素 (IFN γ)释放的酶联免疫斑点 (ELISPOT)试验和乳酸脱氢酶 (LDH)释放的细胞毒试验 ,分别检测该CTL中识别自体肿瘤细胞释放特异性IFN γ的T细胞数和溶瘤活性。结果　以 30 μg/ml蛋白的WTL体外冲击自体 10 6imDCs,可导致上调DC表型 ,包括CD1a、CD83和CD86以及HLA DR的分子表达 ,与常规TNFα诱导成熟的DCs表型相似。虽然两者均能显著刺激异基因T细胞的增殖 ,但其刺激自体T淋巴细胞的增殖能力 ,DCs/WTL却显著高于DCs/TNF(P <0 .0 5 )。将体外与 DCs/WTL共培养的自体T细胞作为反应或效应细胞 ,再次     

多烯紫杉醇联合TNF-α对人前列腺癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用

目的：探讨多烯紫杉醇联合TNF-α抑制前列腺癌的作用，并进一步了解其作用机理。方法：建立人前列腺癌细胞的裸鼠皮下移植瘤模型，在多烯紫杉醇和TNF—α的联合作用下观察其对皮下移植瘤生长的抑制作用，并通过RT—PCR、免疫组化方法检测Bax、Bcl-2基因mRNA表达及p53蛋白表达。结果：与多烯紫杉醇组、TNF—α组及对照组相比，多烯紫杉醇和TNF—α联合治疗组可抑制前列腺癌皮下移植瘤生长速度，且肿瘤体积明显减少（P〈0．01）。BaxmRNA表达上调，而Bcl-2mRNA表达水平下降，免疫组化结果表明p53蛋白的表达水平下降。结论：多烯紫杉醇联合TNF—α对前列腺癌有一定的抑制作用，作用机理可能是通过引起促凋亡基因Bax表达增高，从而导致肿瘤细胞加速凋亡而实现的。     

多烯紫杉醇联合TNF—α对人前列腺癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用

目的：探讨多烯紫杉醇联合TNF-α抑制前列腺癌的作用，并进一步了解其作用机理。方法：建立人前列腺癌细胞的裸鼠皮下移植瘤模型，在多烯紫杉醇和TNF—α的联合作用下观察其对皮下移植瘤生长的抑制作用，并通过RT—PCR、免疫组化方法检测Bax、Bcl-2基因mRNA表达及p53蛋白表达。结果：与多烯紫杉醇组、TNF—α组及对照组相比，多烯紫杉醇和TNF—α联合治疗组可抑制前列腺癌皮下移植瘤生长速度，且肿瘤体积明显减少（P〈0．01）。BaxmRNA表达上调，而Bcl-2mRNA表达水平下降，免疫组化结果表明p53蛋白的表达水平下降。结论：多烯紫杉醇联合TNF—α对前列腺癌有一定的抑制作用，作用机理可能是通过引起促凋亡基因Bax表达增高，从而导致肿瘤细胞加速凋亡而实现的。     

WHV＼myc转基因小鼠肝癌发生过程中c—myc基因表达的双相性

目的：WHV／myc转基因小鼠其肝脏肿瘤的自然发生率很高，本研究旨在细胞水平探测WHV／myc转基因小鼠肝癌发生过程中。c-myc转染基因的表达方式和肝细胞的增殖活性。方法：用核酸分子原位杂交的方法，检测了WHV／myc转基因小鼠肝肿瘤形成的不同阶段肝组织中c-myc基因的表达，同时检测了细胞增殖标志-组蛋白H3-2mRNA的表达。结果：10天龄小鼠肝脏中c-myc转染基因呈中等程度的表达，伴随30％的肝细胞增殖。随后，该基因表达水平迅速降低，在2月龄、4月龄和9月龄小鼠的肝脏中均不能够检测出。此期间肝细胞的增殖活性亦处于低水平。c-myc转染基因的表达重新出现于肿瘤形成期，肝腺瘤和肝癌的表达方式和强度相仿。肝细胞的增殖活性在此期约为14％左右。结论：c-myc转染基因在小鼠出生后早期和肿瘤形成期的异常表达对肝肿瘤的发生和瘤细胞转化表型的维持可能具有重要意义。     

芦荟提取物C诱生小鼠肿瘤坏死因子的研究

目的：研究芦荟提取物C(aloe extract C，AE—C)在BALB／C鼠体内诱导产生肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)。方法：连续5d给小鼠注射AE—C，第6天取血分离血清，应用结晶紫染色法测其TNF活性，观察经AE—C诱生的鼠血清对多种瘤细胞的杀伤作用，杀伤作用的持续时间和对温度的敏感性及血清不同稀释度的杀伤效果。结果：AE—C能诱导小鼠产生TNF-α，与对照组比较作用明显(P＜0．01)；并且对多种靶细胞有显著的杀伤作用；TNF活性24h达高峰，第4天。下降明显，5—d接近正常水平；血清标本稀释至200倍时，仍具有较强的杀伤活性；诱生后的TNF有一定的温度敏感性。结论：芦荟提取物C有诱生BALB／C鼠产生肿瘤坏死因子的作用。     

脐血、健康人及慢粒患者外周血来源的DC介导的抗白血病免疫效应研究

目的：观察脐血、健康人及慢性柱细胞性白血病(CML)患者外周血3种不同来源的树突状细胞(DC)及其抗白血病效应。方法：分离3种来源的单个核细胞(MNC)并在细胞因子(GM-CSF IL-4 TNF-α)作用下诱导培养DC。观察DC形态，流式细胞技术检测DC免疫表型(CD1α、CD80、CD83、HLA-DR)；将所得DC经CML细胞可溶性抗原负载后和其同源T细胞混合诱导抗原特异性CTL，MTT法检测其杀伤活性。结果：3种来源MNC在细胞因子作用下均可获得形态典型的DC，且高表达CD1α、CD80、CD83、HLA-DR，经抗原负载后的DC诱导的CTL对CML靶细胞的杀伤活性也较强。结论：脐血、健康人及CML患者外周血均为理想的DC来源；有较好的诱导CTL杀伤白血病细胞效应；应用DC瘤苗免疫治疗白血病必将成为一种崭新的肿瘤免疫治疗方法，有十分诱人的发展前景。     

肿瘤生物治疗新方法的研究

本文简述“九五”攻关项目间“肿瘤生物治疗新方法”且经协作攻关主要完成的研究工作有：重组人TNF、IL－2及B7重组腺病毒表达载体的构建及其包装体系的建立：腺病毒介导的人TNF－α基因转染对人肝癌细胞凋亡和MHC－Ⅰ类分子表达的影响;瘤体内／瘤周注射TNF－α重组腺病毒和（或）IL－2T重组腺病毒对肝癌小鼠的治疗作用及其免疫机理研究。粘附LAK细胞的制备、体外扩增、冻存及复苏;转染B7、IL－2、TNF－α基因重组腺病毒的肿瘤细胞及A－LAK的生物学特性研究;人肝癌组织中MAG基因的表达及MAGE基因修饰树突状细胞体外抗肿瘤作用;转基因瘤苗临床应用安全性的初步性的初步检测,这些研究工作的完成为肿瘤基因治疗的临床应用打下基础。     

瘤体内/瘤周注射TNF重组腺病毒和/或IL-2重组腺病毒对肝癌小鼠的治疗作用研究

选择两种具有协同免疫调节作用的细胞因子进行联合基因治疗是提高肿瘤细胞因子基因治疗的有效途径之一.目前对IL-2/TNF-α联合基因方案,特别是瘤体内注射途径的抗肿瘤研究尚未见报道.IL-2与TNF-α具有协同作用.因此我们分别将携带TNF-α基因和IL-2基因的腺病毒(Ad-TNF,Ad-IL-2)联合或直接注射于BALB/c小鼠肝癌内,观察其抗瘤效果,并探讨其抗肿瘤免疫机制.结果表明:1.TNF治疗组脾细胞NK、LAK、CTL活性及Mφ杀伤活性明显高于对照组,诱生的细胞因子包括IL-2、GM-CSF、IFN-γ、TNF和IL-     

FasL和B7-1联合基因修饰的肺癌细胞诱导抗肺癌主动免疫

目的:探讨FasL和B7-1联合基因转移是否具有协同的抗肿瘤效应.方法:采用重组腺病毒载体将FasL和B7-1基因导入人肺癌细胞A-549,G418阳性克隆筛选,流式细胞分析,RT-PCR显示FasL和B7-1的表达,并且通过Hoechst33342染色和DNA片段分析检测肺癌细胞的凋亡;将携带FasL和B7-1基因的肺癌细胞(命名为A-549/FB-11)接种于C57BL/6小鼠背部皮下,观测其致瘤性能;A-549/FB-11致敏的小鼠对野生型瘤细胞是否具有免疫保护作用;用A-549和A-549/FB-11细胞分别经腹腔免疫小鼠,得到腹腔浸润淋巴细胞及致敏脾细胞,MTT法检测其体外杀伤实验.结果:FasL和B7-1基因在肺癌细胞中获得高表达并可诱导肺癌细胞的凋亡,双基因转染的肺癌细胞的致瘤性明显下降; A-549/FB-11 诱导的CTL (cytotoxic T lymphocyte)对A-549的杀伤活性显著高于野生型A-549诱导的CTL对相同靶细胞的杀伤活性,P<0.05;A-549 /FB- 11诱导的CTL对A-549/FB-11的杀伤率显著高于对野生型A-549的杀伤率,P<0.05.结论:FasL促进肺癌细胞凋亡,B7-1促进抗肺癌CTL的增殖、活化,在效应阶段两基因发挥着重要的协同作用.     

外源性TNF基因对人肝癌细胞生长的影响

采用比利时Gent大学的质粒PATHNF(内含人TNF-α-cDNA),以及英国伦敦大学的重组逆转录病毒载体pRUFneo.将人TNF基因克隆到重组逆转录病毒载体pRUFneo,构建了含人TNFL-a基因重组逆转录病毒载体RUF-TNF.将RUF-TNF转染包装细胞FlyA13,经G41筛选获得稳定分泌含人TNF基因重组逆转录病毒的细胞株FlyRUFN14.FlyRUFN14产生的病毒上清液能直接转染靶细胞Saos-2.采用这一基因转移系统,将TNF基因转染到两株人肝癌细胞株SMMG-7721及BEL-7404,获得转基因肝癌细胞SMMC-7721 TNF及BEL-7404TNF.TNF基因对人肝癌细胞生长的影响采用细胞学实验及裸鼠实验两种方法进行研究.①细胞学实验:将转基因肝癌细胞SMMC-7721TNF及BEL-7404TNF作为实验组,原来的未转基因肝癌细胞株SMMC-7721及BEL-7404作为对照组,用MTT法研究两组的生长速度.结果:转基因肝癌细胞SMMG-7721TNF及BEL-7404TNF的生长速度明显慢于未转基因肝癌细胞,差别有显著意义(P<0.01).②裸鼠实验:     

人外周血Vα24 NKT细胞抗肿瘤免疫机制的初步研究

目的：进一步认识Vα24NKT细胞在抗肿瘤免疫中的作用。方法：从正常人外周血中扩增并纯化得到Vα24NKT细胞，通过流式细胞术检测其表型、活化后的细胞因子、细胞坏死相关因子的表达情况，采用DIOC18染色及流式细胞术测定Vα24NKT细胞对肿瘤细胞的杀伤率，并利用不同的阻断剂进行阻断实验。结果：Vα24NKT细胞分泌高水平的IFN-γ和IL-4，并表达TNF-α、穿孔素（perforin）、FasL、TRAIL等细胞坏死相关因子。Vα24NKT细胞对表面表达CD1d分子的肿瘤细胞株的杀伤率高于不表达CD1d分子的肿瘤细胞株，同时在α—GalCer存在时，Vα24NKT细胞的杀伤活性增强。对Perforin、FasL、TNF-α、TRAIL进行阻断后，ConA对Vα24NKT细胞的杀伤作用的阻断效果最为明显。结论：Va24NKT对肿瘤的杀伤作用是CD1d分子限制性和抗原特异性的。Vα24NKT通过穿孔素途径和TNF家族成员发挥其细胞毒作用，而穿孔素途径是其肿瘤杀伤的最主要途径。     

卵巢癌可溶性抗原和抗CD3单抗体外共同诱导产生细胞毒T细胞

目的 为提高肿瘤生物治疗效果提供其实验基础。方法 用卵巢癌细胞提取可溶性成分作为肿瘤可溶性抗原(TSA),和抗CD_3,单抗(CD_3—McAb)体外共同诱导正常人外周血单个核细胞(PBMC),在含IL—2的培养基中培养,产生杀瘤性效应细胞。结果 经细胞表型分析,CD_8 T细胞为94.62％。这种细胞毒T细胞(CTL)对TSA来源的卵巢癌细胞具有选择性杀伤作用:对其它卵巢癌细胞的杀伤无选择性。结论 CTL对TSA来源的肿瘤细胞具有选择性杀伤作用,对其它细胞的杀伤无选择性。     

IL-2基因修饰的细胞毒 T淋巴细胞抗肿瘤效应的研究

目的：了解IL－2基因修饰的细胞毒T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes,CTL)的增殖和杀伤活性,探索细胞因子基因疗法及被动免疫治疗脑胶质瘤的新途径。方法：用昆明种小鼠的脾细胞体外诱导CTL,用腺病毒载体转染IL－2基因,观察其体外增殖活性和样伤活性,再用G422小鼠胶质母细胞瘤细胞建立肺转移瘤模型,36h后经过继回输,2周后计数肺的肿瘤结节,观察IL－2基因转染的CTL对实验性肺转移瘤的治疗作用。结果：重组腺病毒载体在MOI（multipliciy of infection)为100时,转染率达96．8％,IL－2基因修饰CTL增殖活性、IL－2的分泌（248u)和体外杀伤活性（36．4％）明显增强,对实验性肺转移瘤的治疗作用都显著增强,肺转移结节数（28）显著减少（P＜0．01）。结论：IL－2基因转染的CTL过继回输,可直接杀伤和诱导激活机体抗肿瘤免疫反应,使体内抗肿瘤效果显著增强,有效抑制实验性肺转移瘤的生长,为胶质瘤的过继免疫治疗提供了新的思路和实验依据。     

4-1BBL修饰小鼠结肠癌疫苗体外诱导抗肿瘤免疫反应的研究

背景与目的:研究4-1BBL(4-1BB Ligand,即CD137配体)转基因小鼠结肠癌细胞瘤苗体外诱导细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTL)特异性杀伤活性及刺激淋巴细胞产生细胞因子的作用.材料与方法:采用脂质体介导法将真核表达质粒pMKITneo/4-1BBL导入小鼠结肠癌colon26细胞,经G418筛选后获得4-1BBL高表达克隆,用丝裂霉素C(MMC)处理后,制成肿瘤细胞瘤苗,与经体外诱导的同系小鼠CTL共同培养,测定对CTL特异性杀伤活性及对脾细胞产生细胞因子(IL-2、IL.-4和IFN-γ)的影响.结果:转染4-1BBL的colon26细胞高表达4-1BBL蛋白,将该细胞经MMC处理后制成的瘤苗,与野生型colon26细胞相比,对CTL特异性杀伤亲本肿瘤细胞的作用明显增强(P＜0.01),但CTL对非亲本肿瘤细胞的杀伤作用无明显影响(P＞0.05);该瘤苗在体外能显著增强脾细胞分泌细胞因子(IL-2、IL-4和IFN-γ)的能力(P＜0.01).结论:4-1BBL转基因小鼠结肠癌细胞瘤苗能有效诱导抗结肠癌免疫反应.     

AFP基因转染的树突状细胞的生物学特性及靶向性CTL细胞毒作用

目的:观察基因转染的树突状细胞生物学特性及靶向性CTL对肿瘤细胞的杀伤作用。方法:用重组IL-4和GM-CSF诱导扩增小鼠骨髓来源的单个核细胞,将表达AFP基因的重组腺病毒转染DC(dendriticcells,DC),构建基因转染的DC瘤苗,并免疫C57BL/6小鼠。用流式细胞术(FCS)检测转染前后DC细胞表面分子MHCI、MHCII、LFA、ICAM、B7.1、和B7.2等的变化。取免疫小鼠脾细胞诱导细胞毒性CTL,LDH非放射性细胞毒性试验检测其对不同肿瘤细胞的杀伤作用。用ELISA法检测CTL诱导过程中TNF-α和IFN-γ分泌变化规律。结果:AFP基因转染后的DC分子表面高表达MHCI、MHCII、LFA、ICAM、B7.1、和B7.2等分子,尤其是MHCII、ICAM和LFA分子,与转染前比较具有显著性差异(P<0.05)。与对照组比较,AFP抗原诱导的靶向性CTL对AFP分泌性肿瘤细胞具有更强的杀瘤活性,且在CTL诱导过程中TNF-α和IFN-γ分泌水平较对照组也有显著性差异。结论:AFP基因重组腺病毒修饰的DC能表达高水平的MHCI、MHCII、LFA、ICAM、B7.1、和B7.2等分子,为CTL进一步活化提供了共刺激信号;用该瘤苗免疫C57BL/6J小鼠,能诱导出针对AFP抗原的靶向性CTL,从而实现对AFP分泌性肿瘤细胞的特异性杀伤作用。     

肝癌树突状细胞瘤苗诱导抗肿瘤作用的研究

目的：研究负载肝癌抗原的肝癌树突状细胞（dendritic cell,DC）瘤苗诱导的抗肿瘤作用。方法：于体外用rhGM-CSF和rhIL-4从肝癌患者外周血诱导DC,并用肝癌细胞抗原冲击致敏,制成负载肝癌抗原的肝癌DC瘤苗。肝癌DC瘤苗活化自体T淋巴细胞分化为细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic of T-lymphocytes,CTL）,采用流式细胞术检测CTL分型;乳酸脱氢酸（LDH）4 h释放法检测CTL对肝癌细胞的特异性杀伤作用。MTT法检测肝癌DC瘤苗及其活化CTL培养上清对肿瘤细胞的抑制作用;ELISA法检测肝癌DC瘤苗活化的CTL培养上清中IL-12、IFN-γ和TNF-α水平。结果：经肝癌DC瘤苗活化后的T淋巴细胞群中,CD56^＋细胞数量显著减少,CD4^＋T和CD8^＋T细胞数量增加,其中以CD8^＋T细胞增加较明显;细胞毒实验显示,该CTL对自体肝癌细胞具有较强的杀伤作用,而对与致敏DC的肝癌抗原无关的CT26结肠腺癌细胞无明显杀伤作用;单纯肝癌DC瘤苗或其激活的CTL培养上清也表现出较强的抑瘤作用,而且这种抑瘤作用具有广谱性,可抑制多种肿瘤细胞的生长;在CTL培养上清中可检测到IL-12、TNF-α和IFN-γ的含量。结论：肝癌DC瘤苗不仅诱导了对肝癌细胞的特异性CTL杀伤作用,而且可激活CD4^＋T和CD8^＋T细胞分泌IL-12、TNF-α和IFN-γ等细胞因子,以非杀伤方式直接或间接地抑制肿瘤细胞生长,发挥非特异性的抗肿瘤作用。     

红细胞肿瘤疫苗的制备及对肿瘤复发转移作用的观察

目的：制备一种新型肿瘤疫苗，观察其对肿瘤复发的转移的作用。方法：用PEG将血红细胞（RBC）与小鼠于宫颈癌（U14）细胞融合，制图瘤苗。MTT法检测新型瘤苗诱发的CTL活性。用复发瘤抑制率及肿瘤转移凶制率来评价瘤苗的疗效。结果：融合细胞携带了RBC的血型抗原。在小鼠体内瘤苗可激发特异的CTL活性，对U14细胞的杀伤率为37．8％；而对照小鼠前胃癌（MFC）细胞的杀伤率为22．0％。瘤苗治疗组复发瘤抑制率为39．9％，肺转移的抑制率为69．9％。结论：RBC与肿瘤细胞融合制备的细胞可作为瘤苗。该瘤苗可有效抑制肿瘤复发和转移。