PDTC对高糖培养大鼠肾成纤维细胞中MCP-1表达的影响

目的:探讨核因子-κB(NF-κB)抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)对高糖培养大鼠肾成纤维细胞(NRK)中单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达的影响。方法:将NRK分4组进行体外培养:(1)正常组:5.6mmol/L的葡萄糖;(2)高糖组:30mmol/L葡萄糖;(3)高糖+PDTC1组:30mmo/L葡萄糖+5μmol/LPDTC;(4)高糖+PDTC2组:30mmo/L葡萄糖+10μmol/LPDTC,分别于培养24h、48h取各组NRK采用RT-PCR检测其MCP-1mRNA表达水平,采用WesternBlot检测MCP-1蛋白表达水平。结果:与正常组相比,高糖组MCP-1mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05),不同浓度PDTC干预后,MCP-1mRNA和蛋白表达水平显著下降(P<0.05),且随PDTC浓度增大,下降更明显。结论:高糖可使NRK中MCP-1表达增高,PDTC能抑制NRK中MCP-1表达。     

霉酚酸酯对高糖培养下人肾小球系膜细胞MCP-1和FN表达的影响

目的:探讨高糖以及霉酚酸酯(MMF)对人肾小球系膜细胞(HMCs)单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和纤维连接蛋白(FN)表达的影响。方法:将培养的HMCs分为正常对照组(5 mmol/L葡萄糖);高糖组(30 mmol/L葡萄糖);甘露醇渗透压对照组(5 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L甘露醇);高糖+MMF-10组(30 mmol/L葡萄糖+10μg/mL MMF);高糖+MMF-100组(30 mmol/L葡萄糖+100μg/mL MMF),采用RT-PCR检测每组不同时间点(24、48、72 h)MCP-1 mRNA的表达,ELISA法检测培养上清液MCP-1及FN蛋白的表达。结果:高糖组HMCs MCP-1 mRNA、蛋白的表达及FN的分泌较正常对照组显著增加(P<0.01),且48 h表达最高;不同浓度的MMF均能下调MCP-1 mRNA、蛋白及FN的表达(P<0.01);不同浓度的MMF对MCP-1 mRNA、蛋白的表达及FN分泌的抑制程度不同,呈时间剂量依赖性(P<0.05)。结论:MMF可以阻抑MCP-1的表达及FN的分泌,可能对延缓肾小球硬化及间质纤维化有一定作用。     

缺氧和高糖对大鼠肾成纤维细胞ICAM-1mRNA表达的影响

目的:探讨缺氧和高糖对肾成纤维细胞(NRK)细胞间粘附分子-1(ICAM-1)mRNA表达的影响。方法:将大鼠NRK分6组进行体外培养:(1)正常浓度葡萄糖组(常糖组):5.6mmol/L葡萄糖;(2)常糖+缺氧组:5.6mmol/L的葡萄糖+100μmol/L的CoCl2;(3)高糖A组:15mmol/L葡萄糖;(4)高糖+缺氧A组:15mmol/L葡萄糖+100μmol/L的CoCl2;(5)高糖B组:30mmol/L葡萄糖;(6)高糖+缺氧B组:30mmol/L葡萄糖+100μmol/L的CoCl2。分别于24h、48h取各组NRK采用RT-PCR检测ICAM-1mRNA表达水平。结果:与常糖组相比,高糖A组,高糖B组ICAM-1mRNA表达量逐渐升高(P<0.01),常糖+缺氧组、高糖+缺氧A、B组ICAM-1mRNA表达量也升高(P<0.01);高糖+缺氧A、B组ICAM-1mRNA表达量分别比高糖A、B组明显升高(P<0.01);高糖A、B组和常糖+缺氧组、高糖+缺氧A、B组48hICAM-1mRNA表达量均高于24h表达量(P<0.01)。结论:高糖和缺氧均可导致ICAM-1mRNA高表达,缺氧可能进一步增加高糖上调ICAM-1的表达。     

红景天苷上调HIF-1α减轻高糖诱导的大鼠肾小球内皮细胞损伤

目的:观察体外不同浓度葡萄糖对大鼠肾小球内皮细胞(rRGECs)表达低氧诱导因子1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子A(VEGFA)及血管内皮钙黏素(VE-cadherin)的影响,探讨红景天苷减轻高糖诱导rRGECs损伤的作用及可能相关机制。方法:体外培养rRGECs,分为正常糖组、高糖(20、30和50 mmol/L)组、高渗组及红景天苷+高糖组。采用MTT法检测rRGECs的活力;RT-qPCR法检测rRGECs内HIF-1α、VEGFA及VE-cadherin的mRNA表达;Western blot法检测rRGECs内HIF-1α蛋白的表达。结果:与正常糖组相比,培养24 h后,高糖(20mmol/L)组rRGECs HIF-1α的mRNA及蛋白表达均上调(P 0.05);培养120 h后,高糖组HIF-1αmRNA表达下调(P 0.05)。与正常糖组相比,培养24 h和120 h后,高糖组rRGECs内VE-cadherin的mRNA表达下调(P 0.05)。与正常糖组相比,培养24 h后,高糖组rRGECs内VEGFA的mRNA表达上调(P 0.05);培养120 h后,高糖组rRGECs内VEGFA的mRNA表达下调(P 0.05)。与正常糖组相比,培养24 h和120 h后,高渗组rRGECs内HIF-1α、VE-cadherin及VEGFA的mRNA表达无变化。与高糖组相比,培养24 h后,红景天苷(50μmol/L)组rRGECs的活力增加(P 0.01),且细胞内HIF-1α和VE-cadherin的mRNA及HIF-1α蛋白表达均上调(P 0.05)。结论:体外高糖培养能影响rRGECs表达HIF-1α,可能与细胞活力、葡萄糖的浓度、作用时间及HIF/VEGF通路有关。红景天苷能减轻高糖诱导的rRGECs损伤,其机制可能与增加rRGECs内HIF-1α的表达有关。     

1-磷酸鞘氨醇受体2在LPS介导的内皮细胞高通透性中的作用

目的观察1-磷酸鞘氨醇受体2（S1PR2）在脂多糖（LPS）刺激后表达的变化,探讨其在LPS介导的内皮细胞高通透性中的作用。方法用不同浓度和时间的LPS刺激培养的ECV304细胞,采用RT-PCR方法检测S1PR2mRNA的变化,Western blot方法检测S1PR2蛋白的变化,TRITC荧光标记白蛋白漏出法测定单层内皮细胞的通透系数Pa值。结果与对照组相比,S1PR2mRNA和S1PR2蛋白在LPS（500ng/ml）刺激24h后以及在LPS（1000ng/ml）刺激12h显著增加（P〈0.01）;S1PR2拮抗剂JTE-013能显著降低LPS引起的内皮细胞通透性增高（P〈0.05）。结论 S1PR2在LPS引起的内皮细胞通透性增高中起着重要的作用。     

氯沙坦通过ERK1/2 MAPK途径抑制高糖诱导小鼠系膜细胞CTGF表达

目的: 研究高糖环境下, 氯沙坦对CTGF的影响以及其作用机制.方法: 体外培养小鼠系膜细胞株(MMCs), 用高糖(25 mmol/L葡萄糖)刺激细胞分别作用24 h、 48 h、 72 h, 用Western blot方法检测磷酸化ERK1/2的表达.再将细胞分为低糖组(5.6 mmol/L葡萄糖), 山梨醇组(5.6 mmol/L葡萄糖+19.4 mmol/L山梨醇), 高糖组(25 mmol/L葡萄糖), 氯沙坦组(25 mmol/L葡萄糖+10-5 mol/L氯沙坦)以及 ERK抑制剂组(25 mmol/L葡萄糖+ 25 μmol/L PD98059), 48 h后采用Western blot方法检测磷酸化ERK1/2的表达, 72 h后采用Real-time PCR方法及Western blot分别检测 CTGF mRNA表达量以及蛋白的表达.结果: 高糖刺激小鼠系膜细胞后, ERK1/2磷酸化的蛋白表达逐渐增高, 呈现一定时间依赖性.与低糖组相比, 高糖组磷酸化ERK1/2、 CTGF的蛋白表达明显增加(P<0.01), 而与高糖组相比, 氯沙坦组以及ERK抑制剂组磷酸化ERK1/2的蛋白表达以及CTGF的蛋白均明显下降有统计学意义(P<0.05).与低糖组相比, 高糖组CTGF mRNA表达量明显增加(P<0.01), 而与高糖组相比, 氯沙坦组以及ERK抑制剂组CTGF mRNA表达量明显下降, 且有统计学意义(P<0.01).结论: 氯沙坦可抑制高糖对CTGF的诱导作用, 其机制可能与抑制ERK1/2 MAPK途径有关.     

L-carnosine对NIT-1胰岛细胞的影响及机制

目的: 研究肌肽(L-carnosine)对高糖培养的NIT-1细胞胰岛素分泌、增殖和凋亡的影响及机制。方法:(1)正常和高糖培养细胞72 h,放射免疫法测定葡萄糖刺激的胰岛素分泌,然后分别换不同浓度葡萄糖和L-carnosine培养,测定胰岛素分泌;(2)细胞分为C组(11.1 mmol/L glucose)、H组 (33.3 mmol/L glucose)、H+A组(33.3 mmol/L glucose +1 mmol/L L-carnosine)和H+B(33.3 mmol/L glucose+ 20 mmol/L L-carnosine)组培养72 h,BrdU检测细胞增殖,流式细胞术检测凋亡,RT-PCR测定bcl-2和caspase-3 mRNA的表达,荧光法检测caspase-3活性。结果:(1)高糖组细胞胰岛素分泌减少; 20 mmol/L L-carnosine显著增加正常和高糖组胰岛素分泌(P<0.01),且呈正相关(P<0.01);(2)高糖组细胞增殖和凋亡均增加(均P<0.01),但总体数目减少;1 mmol/L L-carnosine使增殖增加,凋亡减少(P<0.01);(3) 高糖组caspase-3 mRNA表达明显增加,bcl-2 mRNA明显减少(P<0.05);1 mmol/L L-carnosine使前者明显减少(P<0.05),后者明显增加(P<0.01);不同浓度L-carnosine均明显降低caspase-3活性。结论: 高浓度L-carnosine可单独刺激细胞分泌胰岛素,低浓度的L-carnosine可增加NIT-1细胞增殖并减少高浓度葡萄糖所导致的凋亡。Caspase-3和Bcl-2可能参与了L-carnosine保护NIT-1细胞的过程。     

核转录因子κB抑制剂PDTC对高糖培养大鼠肾成纤维细胞VEGF和PEDF表达的影响

目的:探讨核转录因子κB(NF-κB)抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)对高糖培养大鼠肾成纤维细胞(NRK)血管内皮生长因子(VEGF)及色素上皮衍生因子(PEDF)表达的影响。方法:NRK按培养条件分为常糖组:5.6mmol/L葡萄糖;高糖A组:15mmol/L葡萄糖;高糖B组:30mmol/L葡萄糖;PDTC对照组:5.6mmol/L葡萄糖+5.0μmol/LPDTC;PDTCA组:15mmol/L葡萄糖+10μmol/LPDTC;PDTCB组:30mmol/L葡萄糖+20μmmol/LPT-DC。采用半定量RT-PCR方法及ELISA测定各组培养24h、48h后NRK的VEGF及PEDFmRNA及蛋白的表达。结果:与常糖组相比,高糖各组NRK的VEGF蛋白含量及mRNA表达明显升高(P<0.01,P<0.05);与高糖B组相比,PDTC干预各组NRK的VEGF蛋白含量及mRNA表达呈下降趋势(P<0.01,P<0.05)。与常糖组相比,高糖各组NRK的PEDF蛋白含量及mRNA表达明显下降(P<0.01,P<0.05);与高糖B组相比,PDTCB组NRK的PEDF蛋白含量及mRNA表达明显升高(P<0.01)。结论:PDTC能明显抑制高糖培养大鼠NRK的VEGF表达并明显上调PEDF的表达,间接提示NF-κB可能通过参与VEGF和PEDF的表达失衡导致糖尿病肾病(DN)的发生。     

干扰素调节因子-1和CD74的表达变化与自发性高血压大鼠源大血管平滑肌细胞增殖相关

目的:借助体外模型验证IRF-1、 CD74、 CD36、 GAP43、 CYP2E1和TCA4基因表达变化是否与糖尿病大血管病变相关. 方法:取自发性高血压大鼠胸主动脉平滑肌细胞,并将其分别培养于含不同浓度葡萄糖(5.5、 15、 25、 30mmol/L和35mmol/L)、波动糖中(25mmol/L和5.5mmol/L葡萄糖交替,每一浓度持续12h)以及持续高糖(25mmol/L)中,48h后运用半定量RT-PCR检测IRF-1、 CD74、 CD36、 CYP2E1和TCA4的表达变化,SPSS分析基因变化与平滑肌增殖的相关性. 结果:葡萄糖浓度低于30mmol/L时,平滑肌细胞的增殖随糖浓度的增加而加速.持续高糖中培养平滑肌细胞自第6h起增殖明显.统计分析显示,CD74、 IRF-1和GAP43的表达变化与平滑肌细胞的增殖存在相关性. 结论:IRF-1和CD74参与调节糖尿病大血管病变中平滑肌细胞的增殖.     

二十碳五烯酸抑制早期糖尿病肾病单核细胞趋化蛋白-1的表达

目的:观察二十碳五烯酸(EPA)对早期阶段的糖尿病肾病单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达的影响。方法:体内实验中,KKAy/Ta小鼠随机分为2组:治疗组予以EPA1g·kg-1.d-1腹腔内注射共8周,对照组同步予以生理盐水注射,应用免疫组化和实时RT-PCR检测肾脏中MCP-1表达及巨噬细胞浸润的变化。应用ELISA方法检测高糖和EPA刺激后的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)上清MCP-1的表达。结果:EPA治疗后KKAy/Ta小鼠肾脏MCP-1的蛋白表达及巨噬细胞浸润明显减弱。实时RT-PCR结果显示EPA治疗组小鼠肾皮质MCP-1mRNA的表达明显低于对照组。25mmol/LD-葡萄糖作用72h可引起HUVECs分泌MCP-1明显增加,30μmol/L和50μmol/LEPA均可显著地抑制高糖诱导的MCP-1表达。结论:EPA降低了KKAy/Ta小鼠肾脏及高糖诱导的内皮细胞MCP-1的表达,提示EPA可能抑制早期糖尿病肾病的炎症反应。     

原代分离的大鼠胰岛细胞对葡萄糖刺激胰岛素分泌的反应性研究

目的:研究原代分离的大鼠胰岛对葡萄糖刺激的胰岛素分泌反应性。方法:胶原酶原位灌注法分离大鼠胰岛,在含0.5%BSA、5.5或11.1mmol/L葡萄糖的培养基中培养不同时间后,用含0.2%BSA、3.3mmol/L葡萄糖的KRB缓冲液预培养胰岛30min,分别换入含不同浓度葡萄糖KRB缓冲液,培养1h,收集上清,RIA法测定胰岛素浓度。结果:大鼠胰岛过夜培养后,在基础(3.3mmol/L)和高浓度(16.7mmol/L)葡萄糖条件下胰岛素分泌量分别为(12.4±3.2)和(45.2±4.2)μU/ml/10islets/h;5.5mmol/L和11.1mmol/L葡萄糖浓度下培养12h和20h后,胰岛对葡萄糖的反应性均明显高于16.7mmol/L和22.5mmol/L葡萄糖组(P<0.05);体外培养5d后,对高糖的反应性为(4.28±0.67)倍。结论:原代分离的大鼠胰岛可在(1～5)d内保持对葡萄糖的反应性。     

高钙离子诱导人肾小管上皮细胞表达MCP-1和HMGB1

 目的: 观察体外培养的人肾小管上皮细胞在高钙离子环境下细胞损伤及炎性因子MCP-1和HMGB1的表达。方法: 体外培养人肾小管上皮细胞(HK-2细胞),使用CaCl₂配制成不同钙离子浓度的溶液作为刺激剂,实验分为正常对照组(正常培养液)、Ca I组(5 mmol/L Ca²⁺液)、Ca Ⅱ组(10 mmol/L Ca²⁺液)和Ca Ⅲ组(15 mmol/L Ca²⁺液)。各组细胞分别培养至3 h、6 h、9 h时,采用MTT法检测细胞活力。培养6 h时,采用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行细胞凋亡染色,观察各组细胞凋亡情况;同时收集细胞培养上清液,采用ELISA法分别检测各组细胞上清液过氧化氢(H₂O₂)和8-异前列烷(8-IP)浓度,微量酶标仪法检测各组细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)活性。此外,培养6 h时收集各组细胞,采用real-time PCR法检测细胞MCP-1和HMGB1的mRNA表达情况;并收集各组细胞上清液,采用ELISA法检测其MCP-1和HMGB1的含量。结果: 随着细胞培养液中钙离子浓度的增加,细胞活力抑制率和细胞凋亡明显增加。LDH活性、细胞上清液H₂O₂的浓度和8-IP的含量在Ca I组、Ca Ⅱ组和Ca Ⅲ组均较正常对照组高(P<0.05)。real-time PCR的结果显示,与对照组比较,3个钙离子诱导组细胞MCP-1和HMGB1的mRNA表达水平升高,差异有统计学显著性(P<0.05)。此外,3个钙离子诱导组细胞上清液MCP-1和HMGB1含量均较正常组高(P<0.05)。结论: 本研究结果提示,高钙离子可诱导人肾小管上皮细胞出现氧化应激损伤,同时细胞高表达MCP-1和HMGB1。由MCP-1和HMGB1引发的炎症反应可能是高钙尿参与结石形成的重要机制。     

Snail1 siRNA 对高糖诱导肾小管上皮细胞表型转变的影响

目的： 观察Snail1 siRNA对高糖诱导的肾小管上皮细胞向间充质细胞转变（TEMT）的影响。方法: 原代培养肾小管上皮细胞分为5组：（1）对照组（含糖5.5 mmol/L）;（2）高糖组（含糖25 mmol/L）;（3）Snail1 siRNA处理组,转染Snail1 siRNA,6 h后更换为高糖（含糖25 mmol/L）培养;（4）control siRNA处理组,转染control siRNA作为siRNA阴性对照,6 h后换为高糖（含糖25 mmol/L）培养;（5）高渗组（含D-manntio19.5 mmol/L）;72 h后收集细胞,用Western blotting和半定量RT-PCR检测Snail1、TGF-β1、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、vimentin和E-cadherin蛋白和mRNA表达。结果: 与高糖组比较,肾小管上皮细胞转染Snail1 siRNA后,Snail1 mRNA和蛋白表达水平分别下降62%和68%（P<0.01）。同时,Snail1 siRNA处理组α-SMA和vimentin蛋白和mRNA表达显著下调（P<0.01）,而E-cadherin蛋白和mRNA表达显著上调（P<0.01）。结论: Snail1参与了高糖诱导TEMT的调节。     

葡萄糖对人脐静脉内皮细胞蛋白C受体表达的影响及吡格列酮的干预作用

目的:研究葡萄糖对人脐静脉内皮细胞蛋白C受体(EPCR)mRNA 表达的影响,以及吡格列酮的干预作用。方法:体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),分别以流式细胞术和RT-PCR技术确认HUVECs膜上EPCR的表达水平和 mRNA 水平的表达。再分别以含不同浓度D-葡萄糖(5、10、30、50 mmol/L)的培养基以及含吡格列酮(5、10、20 μmol/L)或不含吡格列酮的高糖(50 mmol/L)培养基孵育HUVECs 24 h,行剂量和时间依赖性实验,并采用实时定量PCR技术测定HUVECs细胞 EPCR mRNA 的表达。结果:随着培养基D-葡萄糖浓度的增加,HUVECs培养24 h后其EPCR mRNA 的表达逐渐下调。在采用吡格列酮干预后, 50 mmol/L高糖处理的HUVECs EPCR mRNA 表达的下调得到明显改善。结论:(1)EPCR 在HUVECs上高表达,高糖可通过下调EPCR mRNA 的表达而损伤内皮细胞功能。(2)吡格列酮可阻止高糖诱导的HUVECs EPCR mRNA表达的下调,从而保护内皮细胞功能。     

持续性和波动性高糖培养对人视网膜色素上皮细胞炎性因子表达的影响

目的:观察波动性和持续性高糖对人视网膜色素上皮细胞(HRPE)炎性因子表达的影响。方法:取常规培养对数期HRPE(2×10~5/ml)接种于24孔板,无血清DMEM培养至细胞同步于G_0/G_1期,加入条件培养液继续培养,并据此分组:(1)低浓度葡萄糖(5.5mmol/L)培养对照组(N组);(2)不同渗透压对照培养组(P组),包括25mmol/L渗透压对照组(P_1组,即用5.5mmol/L葡萄糖和19.5mmol/L甘露醇培养)和33mmol/L渗透压对照组(P_2组,即用5.5mmol/L葡萄糖和27.5mmol/L甘露醇培养);(3)持续性高浓度葡萄糖培养组(H组),包括25mmol/L持续高糖培养(H_1组)和33mmol/L持续高糖培养(H_2组)。(4)波动性高浓度葡萄糖培养(F组),包括25/5.5mmol/L葡萄糖交替培养(F_1组,即高糖3h,低糖2h,轮替交换,日间交换3次,25mmol/L葡萄糖过夜)和33/5.5mmol/L葡萄糖交替培养(F_2组,即高糖3h,低糖2h,轮替交换,日间交换3次,33mmol/L葡萄糖过夜)。各组均培养72h,并于培养24h、48h、72h检测分析HRPE培养上清液中细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量变化。结果:组内比较,同组HRPE条件培养24h、48h、72h,其上清液ICAM-1、TNF-α表达量差异无统计学意义(均P0.05)。组间比较,P组ICAM-1和TNF-α水平与N组无明显差异(P0.05),H组和F组均高于N组(P0.01),F组较H组升高更显著(P0.01),P_1和P_2、H_1和H_2、F_1和F_2各两亚组间差异均无统计学意义(P0.05)。结论:波动性高浓度葡萄糖刺激对HRPE的炎性损伤较持续性高糖更为明显,对糖尿病视网膜危害更大。     

高糖对腹膜巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶的作用

目的：探讨在体外葡萄糖对SD大鼠腹膜巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA的表达及蛋白的合成。方法:取雄性SD大鼠腹腔巨噬细胞培养，培养的巨噬细胞分为5组：(1)正常对照组；(2)30 mmol/L甘露醇组；(3)90 mmol/L甘露醇组；(4)30 mmol/L葡萄糖组；(5)90 mmol/L葡萄糖组。每组6个培养孔，24 h后提取细胞RNA及蛋白，分别做RT-PCR及Western blotting以检测腹膜巨噬细胞iNOS mRNA的表达及蛋白的合成。结果:30 mmol/L及90 mmol/L甘露醇刺激腹膜巨噬细胞iNOS mRNA的表达及蛋白的合成均不明显， 30 mmol/L及90 mmol/L葡萄糖能明显刺激腹膜巨噬细胞iNOS mRNA的表达及蛋白的合成，90 mmol/L葡萄糖与30 mmol/L的葡萄糖相比更能刺激巨噬细胞iNOS mRNA的表达及蛋白的合成。结果:葡萄糖能明显刺激SD大鼠腹膜巨噬细胞iNOS mRNA的表达及蛋白的合成。     

醛固酮对肾小球系膜细胞上血管紧张素Ⅱ受体表达的影响

目的：研究醛固酮(ALD)对高糖状态下大鼠肾小球系膜细胞（RMCs）上血管紧张素Ⅱ1a、1b 和 2 型受体(AT-1aR、 AT-1bR 和 AT-2R)表达的影响及意义。方法:以不同浓度的 ALD (10-8-10-6 mol/L)或 10-7 mol/L 螺内酯(醛固酮受体拮抗剂,SPI)或 10-7 mol/L 氯沙坦（血管紧张素Ⅱ 1 型受体拮抗剂,Los）或10-9 mol/L PD123319(血管紧张素Ⅱ 2 型受体拮抗剂,PD)刺激高糖(30 mmol)状态下培养的 RMCs, MTT 法检测 RMCs 的增殖,半定量 RT-PCR 法检测细胞上 AT-1aR、AT-1bR 和 AT-2R mRNA 的表达,ELISA法检测单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的表达。结果: ALD(10-8-10-6 mol/ L)刺激高糖状态下 RMCs 12 h 后, AT-1aR、AT-1bR 和 AT-2R mRNA 表达显著上调,分别为高糖对照组的 1.62-1.77倍、9.61-9.89倍、7.26-7.35倍（P<0.01）。 ALD 受体拮抗剂 SPI 能拮抗 ALD 上调 AT-1aR、 AT-1bR 表达的作用;而 AT-2R mRNA 表达轻度增加（P<0.05）。ALD 刺激高糖状态下 RMCs 12 h 后 AT-1aR/AT-1bR 显著下降（P<0.01）,SPI 能拮抗 ALD的这种作用。ALD 刺激高糖状态下RMCs 12 h 后,MCP-1表达增加（P<0.01）,SPI/Los/PD 能拮抗 ALD 的作用。结论: ALD 能通过上调高糖状态下 RMCs 上 AT-1aR、 AT-1bR 和 AT-2R 基因表达, 改变 AT-1R 亚型的比例,诱导 MCP-1 过度表达,参与炎症反应。     

消渴颗粒剂对大鼠系膜细胞TGF-β1表达的影响

目的 :观察高糖和消渴颗粒剂含药血清对大鼠系膜细胞增殖及TGF - β1表达的影响 ,探讨消渴颗粒剂治疗糖尿病肾病的机制。方法 :采用系列筛网法分离肾小球 ,经胶原酶消化后 ,分装至塑料培养瓶中 ,在 5 %CO2 ,37℃恒温恒湿培养箱内孵育培养。 2 - 3周后进行转种。经相差显微镜、扫描电镜观察 (scaningelectronmicroscope,SEM) ,免疫细胞化学染色actin和desmin染色均为阳性 ,证实为系膜细胞后 ,进行以下实验。用 2 0mmol/L葡萄糖刺激系膜细胞 12h、2 4h、4 8h、72h和 96h ,以 5mmol/L葡萄糖为正常对照 ,MTT比色法观察系膜细胞的增殖情况…     

缬沙坦抑制高糖刺激下系膜细胞血管紧张素Ⅱ-Notch通路

目的探讨血管紧张素Ⅱ-Notch通路对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞(RMC)基质分泌的影响以及缬沙坦的保护作用。方法将传代培养的RMC同步化后分为正常糖对照组(含5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(含30.0 mmol/L葡萄糖)、高渗对照组(含5.5 mmol/L葡萄糖联合24.5 mmol/L甘露醇)、正常糖联合1μmol/L N-N-(3,5-氟苯乙酰基)-L-丙氨酰-2-苯基甘氨酸叔丁酯(DAPT)组、正常糖联合(1、5、10)μmol/L缬沙坦组、高糖联合1μmol/L DAPT组、高糖联合(1、5、10)μmol/L缬沙坦组。培养12、24、48 h后,收集细胞及上清液,Western blot法检测Notch1蛋白表达情况,ELISA检测上清液转化生长因子β(TGF-β)、纤维连接蛋白(FN)的水平。结果与正常糖组相比,高糖刺激RMC 12 h,可检测到Notch1表达升高,峰值出现在24 h;与正常糖组相比,高糖状态下RMC上清液中TGF-β、FN含量随时间明显升高;高糖状态下缬沙坦或DAPT预处理组与未处理组相比,培养24 h左右,Notch1表达明显减少;与未处理组相比,随缬沙坦浓度增加,Notch1表达逐渐降低。高糖状态下,与未处理组相比,缬沙坦或DAPT预处理组TGF-β、FN水平均明显下降。结论高糖可活化培养的RMC中Notch通路,TGF-β以及FN分泌增加;缬沙坦可通过浓度依赖性的方式抑制血管紧张素Ⅱ-Notch通路,减少下游FN的分泌。     

α-硫辛酸对高糖状态下内皮祖细胞的影响

目的:应用高浓度葡萄糖孵育大鼠骨髓内皮祖细胞(EPCs),测定培养上清的丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)水平,同时观察EPCs GPx-1、eNOS的表达,然后应用抗氧化剂ALA进行干预,来探讨葡萄糖引发EPCs损伤的机制及治疗措施。方法:清洁级健康雄性Wistar大鼠(体质量180～200g)15只,分离培养EPCs,用2.5 g/L胰酶/0.2 g/LEDTA消化培养4 d的EPCs,分组贴壁24 h后分别给予葡萄糖5 mmol/L作为正常对照组(NC)、30 mmol/L葡萄糖作为高糖组(HS)以及葡萄糖(30 mmol/L)+α硫辛酸(40μg/L)作为ALA组,孵育EPCs 48 h,实时荧光定量PCR技术及Western blot法测定EPCs GPx-1及eNOS的mRNA及蛋白表达,测定培养液上清的一氧化氮(NO)及MDA水平。结果:(1)不同干预措施对EPCs分泌MDA的影响:高浓度葡萄糖干预48 h后培养上清MDA水平高于正常对照组(P<0.05);应用ALA干预后与高糖组比较MDA水平下降(P<0.05)。(2)不同干预措施对EPCs GPx-1表达的影响:高糖干预48 h后EPCs GPx-1表达显著低于对照组,而ALA干预后EPCs GPx-1表达较高糖组显著增加(P<0.05)。(3)不同干预措施对EPCs eNOS表达及分泌NO的影响:高糖干预48 h后EPCs eNOS表达显著低于对照组,培养上清NO水平低正常对照组(P<0.05),而ALA干预后EPCs eNOS表达较高糖组显著增加(P<0.05),培养上清NO水平升高(P<0.05)。结论:高浓度葡萄糖可以诱发EPCs产生氧化应激,减弱EPCs的抗氧化能力及eNOS表达,使EPCs分泌NO减少,α硫辛酸能够改善高糖导致的EPCs抗氧化能力减弱及NO的分泌。