金黄仓鼠病毒抗体ELISA检测方法建立及其应用

用酶标兔抗仓鼠ＩｇＧ,建立了检测金黄仓鼠淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、仙台毒、呼肠孤病毒３型和小鼠肺炎病毒感染的ＥＬＩＳＡ方法。本法与酶标ＳＰＡ－ＥＬＩＳＡ法比较,金黄仓鼠抗体阳性检出率高一倍且特异性高。结果表明此法是一种敏感性和特异性均理想的方法。e     

蝙蝠血清IgG的纯化及兔抗蝙蝠IgG酶标抗体的制备

目的纯化蝙蝠血清IgG,制备兔抗蝙蝠IgG酶标抗体。方法采用亲和层析纯化法纯化蝙蝠血清IgG,SDS-PAGE电泳鉴定蝙蝠IgG纯度。免疫大白兔制备兔抗蝙蝠IgG抗血清,免疫双扩散法测定抗血清效价,亲和层析纯化法纯化抗血清IgG。用改良过碘酸钠标记法制备兔抗蝙蝠IgG酶标抗体,直接ELISA和Western blot法对兔抗蝙蝠IgG酶标抗体进行工作浓度测定。结果纯化的蝙蝠血清IgG,其SDS-PAGE测定纯度大于95%;免疫大白兔所制备的抗血清免疫双扩散效价为1∶64;用改良过碘酸钠标记法制备兔抗蝙蝠IgG酶标抗体,其直接ELISA和Western blot工作浓度分别为1∶12800和大于1∶2000。结论制备了蝙蝠血清IgG的抗血清和酶标抗体,为蝙蝠的血清学检测体系提供了技术和资源储备。     

MLCK定量检测的双抗体夹心ELISA方法建立

目的:建立定量检测人肌球蛋白轻链激酶(MLCK)的双抗夹心ELISA法.方法:用抗MLCK兔多克隆抗体包被酶标板,1％小牛血清白蛋白(1％BSA)作为封闭液,抗MLCK羊多克隆抗体和HRP-兔抗羊抗体分别为包被抗体和检测抗体,建立双抗体夹心ELISA法,并进行了实验条件的优化;同时对新建立方法的灵敏度、精密度进行了评价...     

兔抗金黄地鼠酶标抗体的制备及应用

目的纯化金黄地鼠血清IgG,制备兔抗金黄地鼠酶标抗体(IgG-HRP),开展金黄地鼠仙台病毒的初步检测。方法采用亲和层析纯化法纯化金黄地鼠IgG, 用SDS- PAGE电泳测定IgG纯度并制备兔抗金黄地鼠IgG抗体(second antibody,Ab₂)；用免疫双扩散法检测抗血清效价后,再用亲和层析纯化抗血清IgG(Ab₂)；采用改良过碘酸钠标记法制备兔抗金黄地鼠酶标抗体(rabbit anti-hamster IgG-HRP)；用直接ELISA 和 Western-blot法对兔抗金黄地鼠IgG酶标抗体进行工作浓度测定；应用金黄地鼠酶标抗体对金黄地鼠仙台病毒进行酶免检测(IEA)。结果金黄地鼠血清IgG纯度达95%；兔抗金黄地鼠IgG抗体(Ab₂)免疫双扩散效价为1:64；兔抗金黄地鼠IgG-HRP经直接ELISA 和 Western-Blot测定工作浓度分别为1∶5000和1∶2000；酶免(IEA)效价为1∶2000。 结论高效快速纯化了金黄地鼠IgG,制备了金黄地鼠IgG-HRP,为金黄地鼠病原微生物的血清学检测提供了条件。     

ELISA一步法检测轮状病毒抗原

用牛轮状病毒(NCDV株,A组)抗原免疫家兔,制备兔抗牛NCDV多克隆抗体。用该抗体与辣根过氧化物酶联结,建立了检测轮状病毒(RV)的ELISA一步法。该法实验过程为: 40孔酶标板用兔抗RV包被,4℃过夜后加入50μl处理过的待测标本和50μl HRP-     

人血清中青霉素抗体的酶联免疫吸附测定

目的: 建立检测青霉素抗体的ELISA法,并探讨其临床意义。方法: 以氨苄西林用SPDP法与兔血清白蛋白交联,用此交联物为包被抗原,HRP-抗人IgG为酶标抗体,建立检测青霉素抗体的ELISA法,并对部分临床标本进行青霉素抗体检测。结果: 建立的方法其批内、批间变异系数分别为6.8%、8.4%。氨苄西林-兔白蛋白交联物免疫家兔获得兔抗氨苄西林的抗体,以此抗体作阻断试验,抑制HRP-抗人IgG的显色。临床标本检测结果表明,不同疾病患者青霉素抗体的阳性率不同。结论: ELISA可用于临床对青霉素抗体的检测,具有较好的特异性、敏感性和重复性。     

双抗夹心ELISA法检测骨唾液酸蛋白的初步建立

目的 建立快速检测骨唾液酸蛋白的酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法,为试剂盒的研制奠定基础。方法 用鼠抗人骨唾液酸蛋白（BSP）单克隆抗体包被酶标板,兔抗人BSP检测,辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠二抗与兔抗人BSP相结合,初步建立BSP的双抗夹心ELISA检测方法。结果 自建双抗夹心ELISA法检测骨唾液酸蛋白的灵敏度为1.5ng/ml,标准曲线的线性范围为2-100ng/ml,回归方程y=0.2548x+0.0775 (r=0.992);批内批间变异系数分别为4.6％-5.4％和5.2％-7.1％,对人血清做50、25和10ng/ml三个加标浓度的回收率实验,回收率在47.2％-101％之间;4℃有效期至少360天。结论：成功建立双抗夹心ELISA检测BSP的方法。     

斑点酶联免疫吸附试验的建立和应用

建立了一种快速检测轮状病毒抗原的新技术——斑点酶联免疫吸附试验.用兔抗人轮状病毒IgG包被硝酸纤维素膜,然后直接浸入粪标本中反应,随后与酶标兔抗人轮状病毒IgG作用,再用底物显色,根据斑点颜色深浅,肉眼即可判断阳性或阴性结果,不需要任何特殊仪器设备.将该法与常规ELISA及聚丙烯酰胺凝胶电泳进行了比较,结果表明,与常规ELISA结果的符合率为98.11%,与聚丙烯酰胺凝胶电泳的符合率为90.57%,而且更为快速、敏感、经济、简便,易于在基层推广和现场应用.     

兔抗麻雀IgY酶标抗体的制备

目的制备辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗麻雀IgY抗体,为禽类血清学检测体系的建立提供技术储备。方法硫酸铵盐析法粗提麻雀血清IgY,进一步在SDS-PAGE上分离后,切下带有目的条带的凝胶作为免疫原,免疫实验兔制备抗血清,Protein-A柱亲和纯化兔抗IgY血清IgG,,使用改良过碘酸钠法制备酶结合物。ELISA检测酶标抗体的工作浓度,western blotting检测酶标抗体的特异性。结果硫酸铵盐析法粗提IgY,可去除部分杂蛋白,SDS-PAGE上分离后切下带有目的条带的凝胶,可以得到足够纯度的抗原,将带有IgY的凝胶作为抗原免疫后获得的抗血清经Protein-A纯化后,二抗在SDS-PAGE上鉴定,纯度达到99%以上。改良的过碘酸钠法标记获得的抗体浓度为1.008 mg/mL,ELISA检测酶标抗体效价为1∶1000。Western blotting鉴定抗体具有特异性。结论获得了优质可靠的兔抗麻雀IgY酶标抗体。     

酶联免疫吸附试验检测狂犬病病毒抗原研究及其应用

采用两株亲和力强、特异性高的狂犬病病毒抗体建立狂犬病病毒抗原酶联免疫吸附试验（EnzymelinkedimmunosorbentassayELISA）双抗体夹心法，经方阵试验选择出最佳包被抗体浓度为3mg／ml．酶标抗体为1：300.用本法测定432份送检犬唾液标本，检出阳性率为21％，该检测结果与用法国巴斯德试剂盒检测结果一致．表明用ELISA双抗夹心法除了同样具有高特异性和高重复性外，而且还不需要昂贵的荧光显微镜，甚至在无酶标议的情况下也可肉眼判断结果。方便、快速，适用于狂犬病的常规诊断和现场大样本的流行病学调查，有较高的推广、普及价值。     

仓鼠肝谷胱甘肽过氧化酶的提纯及免疫组化的应用

从仓鼠肝中提取到电泳均一的谷胱甘肽过氧化酶,用微量纯化酶免疫新西兰兔,得到效价为1∶64的抗血清。用该抗血清对仓鼠各组织进行PAP法酶标定位,发现谷胱甘肽过氧化酶广泛存在于肝、肾曲管上皮、心肌、骨骼肌细胞胞浆内。在肝脏、汇管区阳性反应明显多于小叶中央区。     

十七种哺乳动物二级抗体的制备和辣根过氧化物酶标记

目的制备兔抗17种哺乳动物的二级抗体,并进行辣根过氧化物酶标记,为哺乳血清学检测系统的建立提供工具。方法利用饱和硫酸铵沉淀法粗纯抗体后,再利用protein A或protein G亲和层析的方法进一步纯化哺乳动物的IgG,免疫大耳白兔制备抗血清,利用免疫双扩散来检测抗血清的效价,并用Protein A亲和层析的方法来纯化兔抗哺乳动物的二级抗体,采用简易过碘酸钠法对纯化的兔抗哺乳动物的二级抗体进行辣根过氧化物酶标记,通过ELISA方法测定标记抗体的效价,并利用Western blot方法考察标记抗体的特异性。结果纯化了恒河猴、东北虎、布氏田鼠、黑线姬鼠、斑羚、原驼、果子狸、食蟹猴、梅花鹿、长爪沙鼠、马鹿、骆驼、大仓鼠、豚鹿、熊猴、大耳羊和雪貂等17种哺乳动物的血清IgG,分别免疫大耳白兔制备了这17种哺乳动物的兔抗血清,免疫双扩散法测定兔抗这17种哺乳动物的抗血清效价均达到1∶32,并对纯化的兔抗恒河猴IgG、兔抗东北虎IgG、兔抗布氏田鼠IgG、兔抗黑线姬鼠IgG、兔抗斑羚IgG、兔抗原驼IgG、兔抗果子狸IgG、兔抗食蟹猴IgG、兔抗梅花鹿IgG、兔抗长爪沙鼠IgG、兔抗马鹿IgG、兔抗骆驼IgG、兔抗大仓鼠IgG、兔抗豚鹿IgG、兔抗熊猴IgG、兔抗大耳羊IgG和兔抗雪貂IgG等17种哺乳动物的二级抗体进行了辣根过氧化物酶标记,ELISA测定标记抗体的效价达到1∶(2000～60000)左右,Western blots显示标记抗体具有很好的特异性。结论成功制备了HRP标记的兔抗17种哺乳动物的二级抗体,为哺乳动物血清学检测体系的建立提供了工具。     

清洁级长爪沙鼠病毒抗体ELISA检测法建立

经纯化长爪沙鼠IgG免疫家兔后获得的血清用辛酸法纯化抗体，电泳可见只有一条蛋白带，制备得酶标二抗工作浓度为1：25600。用间接ELISA对开放系统和屏障系统中长爪沙鼠进行淋巴细照脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)，鼠肝炎病毒(MHV)和仙台病毒抗体的检测，发现其血清病毒抗体阳性率开放系统为6．0%(4/67)，22.4%(15／67)和14．9%(10／67)，屏障系统为1．3%(1／79)，1．3%(1／79)和7．6%(6／79)，如用酶标蛋白A取代酶标抗长爪涉鼠IgG抗体进行检测，则无一份血清阳性，结果表明长爪沙鼠可以自然感染LCMV、MHV和仙台病毒或其抗原相关的病毒，酶标蛋白A不宣作为酶标二抗用手长爪沙鼠抗体的检测。     

间接ELISA法测定转基因小鼠血清中核糖核酸酶抑制因子的表达

[目的]建立间接ELISA法测定血清中核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)含量的方法,并测定在转RI基因小鼠血清中RI的表达情况。[方法]用血清样品包被酶标板,兔抗人RI抗体为一抗,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为二抗,建立血清RI定量检测的间接ELISA法;取转染了RI基因的小鼠的血清,用上述建立的间接ELISA法测定不同时相小鼠血清中RI的表达水平。[结果]定量检测血清RI的间接ELISA法最适反应条件为一抗最佳稀释度为1∶4000,二抗的最佳稀释浓度为1∶2000。转基因小鼠第2、3周血清中RI含量较低(0.556±0.080),1个月左右达到最高值(0.836±0.113),3个月时明显下降(0.640±0.100)。[结论]间接ELISA法可以用于测定血清中的RI抗原含量。     

抗树鼩、灰仓鼠和长爪沙鼠IgG抗体的制备及标记

目的 制备抗树鼩、长爪沙鼠和灰仓鼠IgG抗体,并分别用异硫氰酸荧光素和辣根过氧化物酶进行标记.方法 采用Protein G分别提纯树鼩、长爪沙鼠和灰仓鼠血清中的IgG,纯化后免疫家兔,制备兔抗三种动物IgG抗体;采用亲和层析纯化兔抗三种动物IgG抗体,并分别进行FITC和HRP标记.结果 分别获得抗灰仓鼠、树鼩和长爪沙鼠IgG抗体,浓度分别为:2.2 mg/ml、2.3 mg/ml和2.3 mg/ml; FITC标记的兔抗灰仓鼠、树鼩和长爪沙鼠IgG含量分别为:1.19 mg/ml,1.36 mg/ml和1.55 mg/ml; HRP标记的兔抗灰仓鼠、树鼩和长爪沙鼠IgG含量分别为:0.84 mg/ml、1.09 mg/ml和1.31 mg/ml.结论 得到了适合检测用的FITC和HRP标记二抗,为建立这三种动物致病微生物和寄生虫检测方法提供了试剂.     

SPF仓鼠种群的建立及规模化生产

目的为提高我国乙型脑炎减毒活疫苗的质量,推动乙型脑炎减毒活疫苗进入国际市场,对普通级金黄仓鼠进行生物学净化.方法采用剖宫产手术,SPF金黄仓鼠母鼠代乳,建立SPF金黄仓鼠种群.结果去年年底建立了有200多对SPF金黄仓鼠组成的核心种群,经送中检所实验动物标准化实验室和英国Q-one公司检测,微生物学和寄生虫学检测结果达到国家SPF金黄仓鼠质量标准,尤其是英国Q-one公司检测的10种病毒全部阴性,符合WHO乙型脑炎活疫苗生产和鉴定规程中对金黄仓鼠的质量要求.结论通过剖宫产手术,成功建立起SPF金黄仓鼠种群,并在屏障系统进行了大规模生产.     

McAb-ELISA间接夹心法检测家鼠型HFRS疫区人和动物血清中特异性抗体

用McAb-ELISA间接夹心注和IFAT或酶标SPA染色法平行检测山西地区(家鼠型HFRS疫区)的人及动物血清中HFRS病毒特异性IgM和/或IgG抗体。结果ELISA检测174份HFRS患者血清的阳性率及抗体滴度均明显高于IFAT。检测295份无明确HFRS病史的健康人血清,ELISA的阳性率也高于IFAT。检测215份鼠类血清、102份兔血清及108份猪血清,ELISA的阳性检出率与IFAT或酶标SPA染色法基本相同。用阻断试验等证明本ELISA检出的抗体确为HFRS病毒特异性抗体。     

胱抑素C的IgG-和IgY-ELISA检测体系的建立与评价

目的建立适用于检测人胱抑素C（Cystatin C）的IgG与IgY双抗体夹心ELISA检测体系。方法以人Cystatin C作为抗原免疫产蛋的罗曼鸡和新西兰兔,纯化抗Cystatin C的鸡抗体IgY和兔抗体IgG,并分别建立三种ELISA夹心检测体系,I：捕捉抗体IgG＋检测抗体IgY＋抗鸡IgY酶标抗体;Ⅱ：捕捉抗体IgG＋检测抗体IgY＋兔F（ab＇）2抗鸡酶标抗体;Ⅲ：捕捉抗体IgY＋检测抗体IgG＋抗兔IgG酶标抗体。通过比较Cystatin C的最低检测浓度和阴性对照的OD值评价三种夹心法的灵敏度和特异性。结果体系I的Cystatin C最低检测浓度为7.5ng/mL（阴性对照OD值为0.737）,体系Ⅱ的Cystatin C最低检测浓度为13ng/mL（阴性对照OD值为0.313）,体系Ⅲ的Cystatin C最低检测浓度为10ng/mL（阴性对照OD值为0.31）。结论成功建立了Cystatin C的双抗体夹心ELISA检测体系,体系I的灵敏度最高但其特异性差,体系Ⅱ和Ⅲ的检测灵敏度和特异性均较好,可以用于Cystatin C的检测。     

兔抗狨猴IgG-HRP标记抗体的制备及初步鉴定

目的狨猴血清中纯化IgG抗体,制备兔抗狨猴抗血清,并纯化抗血清中IgG,HRP(辣根过氧化物酶)标记兔抗狨猴IgG。方法 Hi TrapTMProtein G亲和层析纯化狨猴和兔抗狨猴血清IgG,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行纯度鉴定,免疫琼脂双扩散法(double immunodiffusion assay)测定制备的兔抗狨猴抗血清效价,改良"简易过碘酸钠标记法"制备兔抗狨猴IgG-HRP标记抗体,酶联免疫吸附测定法(ELISA)及蛋白免疫印迹法(Western blotting)对兔抗狨猴IgG-HRP标记抗体进行工作浓度测定及特异性鉴定。结果狨猴和兔抗狨猴血清纯化IgG纯度分别大于95%、97%;兔抗狨猴IgG抗血清的效价为1∶64。ELISA和Western blotting鉴定了兔抗狨猴IgG-HRP酶标抗体参考工作浓度为1∶256 000、1∶15 000,特异性明显。结论制备狨猴IgG-HRP标记抗体并初步鉴定,包括ELISA及Western blotting的特异性及使用浓度,为狨猴病原体免疫学检测体系及分子免疫学检测体系储备了资源。     

免疫磁性捕获ELISA法检测甘草中甘草蛋白的研究

目的 制备甘草蛋白免疫磁性微球，并建立快速、精确的免疫磁性捕获ELISA法检测甘草蛋白。方法 采用种子聚合法合成聚苯乙烯磁性微球，并以兔抗甘草蛋白IgG抗体致敏，制备特异性捕获甘草特征蛋白的免疫磁性微球。以生物素标记抗体为示踪抗体，结合辣根过氧化物酶标亲和素建立ELISA检测系统，用于甘草药材和含甘草中成药中甘草蛋白的分析。结果 利用该方法对甘草药材和中成药中甘草蛋白抗原检测，检测灵敏度达到10ng／mL。结论 免疫磁性捕获ELISA检测技术方便、快速、准确，为生药的品种鉴定及中成药的质量控制提供一种新方法。