兔视网膜Mller细胞的原代培养

目的探索体外培养兔视网膜Mller细胞的有效方法。方法采用酶消化法从乳兔视网膜获取Mller细胞,通过振荡和反复洗涤使之纯化。采用免疫组织化学技术和透射电镜对传代Mller细胞进行鉴定。结果培养24h后即有部分细胞贴壁生长,72h后贴壁细胞进一步增多。通过振荡吹打可使附着于Mller细胞上的神经元脱落。20～25d后细胞接近融合,呈三角形或不规则形。传代后细胞经1周达到融合。培养细胞GFAP阳性率在95%以上。电镜观察显示:细胞内含有线粒体、粗面内质网、核糖体及8～10nm的中间丝。结论利用酶消化法可成功分离兔视网膜Mller细胞,通过振荡和吹打洗涤,可使之纯化。     

兔视网膜Müller细胞的原代培养

目的 探索体外培养兔视网膜Müller细胞的有效方法.方法 采用酶消化法从乳兔视网膜获取Müller细胞,通过振荡和反复洗涤使之纯化.采用免疫组织化学技术和透射电镜对传代Müller细胞进行鉴定.结果 培养24 h后即有部分细胞贴壁生长,72 h后贴壁细胞进一步增多.通过振荡吹打可使附着于Müller细胞上的神经元脱落.20～25 d后细胞接近融合,呈三角形或不规则形.传代后细胞经1周达到融合.培养细胞GFAP阳性率在95%以上.电镜观察显示细胞内含有线粒体、粗面内质网、核糖体及8～10 nm的中间丝.结论 利用酶消化法可成功分离兔视网膜Müller细胞,通过振荡和吹打洗涤,可使之纯化.     

人视网膜Mūller细胞培养及超微结构免疫组织化学观察

用酶消化法培养人视网腆Mūller细胞井传代，用电镜及免疫组织化学(免疫组化)技术对细胞进行鉴定。结果显示Mūller细胞贴壁生长，原代细胞胞体狭长，胞质丰富，细胞内含丰富的8~10nm直径的微丝及细胞连接结构。免疫组化显示细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白、波形蛋白阳性，证实为Mūller细胞。提示酶消化法培养是一种可靠的、大量获取人视网膜Mūller细胞的方法． （中华眼底病杂志，1995，11：178-180）     

新生大鼠视网膜Müller细胞原代培养纯化及鉴定

目的 探讨新生SD大鼠视网膜Müller 细胞原代培养的方法.方法 用酶消化法分离制备视网膜细胞悬液,采用分次贴壁和反复吹打法分离并纯化Müller 细胞,进行形态学观察及免疫组织化学染色.结果 光镜下培养细胞体较大,呈扁平不规则形状;免疫组织化学染色显示95%以上的原代细胞神经胶质纤维酸性蛋白染色阳性;电镜下细胞内可见丰富的线粒体、高尔基体和大量直径8～10 nm的微丝结构.结论 分次贴壁和反复吹打法是一种简单可靠的视网膜Müller 细胞原代培养的方法.     

羊膜对体外培养的兔视网膜Müller细胞表皮生长因子受体表达的影响

目的研究羊膜对兔视网膜Müller细胞表皮生长因子受体（EGFR）表达的影响及其机制。方法取出生15d新西兰白兔视网膜Müller细胞进行原代培养及传代,采用神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和S-100进行细胞鉴定。0.25%胰蛋白酶、0.05%EDTA酶消化取第3代Müller细胞,实验组加0.5mL羊膜匀浆上清液继续培养12h,采用免疫组织化学法检测羊膜诱导和非诱导条件下兔视网膜Müller细胞EGFR表达的变化并进行分析。结果培养的兔视网膜Müller细胞GFAP和S-100表达阳性,透射电镜检查细胞质内可见8～10nm的中间丝。未经羊膜诱导的视网膜Müller细胞EGFR有少量表达,经羊膜诱导12h后,EGFR表达明显增多,2组灰度值分别为571588.80±67862.68和1000352.00±98386.22,差异有统计学意义（t=4.035,P〈0.01）。结论经羊膜诱导后可促进培养的兔视网膜Müller细胞EGFR的表达。     

改良的人视网膜Müller细胞的原代培养方法与鉴定

背景 视网膜Müller细胞是视网膜重要的胶质细胞,也是视网膜干细胞的来源之一,研究Müller细胞的生物学行为对研究视网膜的各种生理病理过程和视网膜干细胞治疗研究具有重要意义,而建立稳定的视网膜Müller细胞培养体系是相关研究的基础. 目的 优化分离培养和纯化人视网膜Müller细胞的方法,为相关的实验研究提供良好优质的Müller细胞来源. 方法 分离人供体眼视网膜组织,然后将剪碎的视网膜组织置入质量分数0.25％胰蛋白酶+100 U透明质酸酶混合溶液中进行消化,添加含体积分数10％胎牛血清的DMEM/F12培养液1～2 ml终止消化,然后加入含体积分数20％胎牛血清的RPMI1640培养液培养72 h,行半量换液,再以含10％胎牛血清的培养液进行传代.光学显微镜下根据细胞的形态特征进行细胞鉴定,并分别采用免疫荧光技术和免疫组织化学法检测胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和Müller细胞特异性标志物谷氨酰胺合成酶(GS)的表达,对培养的细胞进行鉴定.结果 应用0.25％胰蛋白酶+100 U(商品单位)透明质酸酶的混合酶消化法可成功获取人视网膜Müller细胞,原代培养后24 h细胞贴壁,培养后9～1Od细胞融合.培养的细胞胞体呈长圆形,细胞质丰富,部分细胞体两端锥状长突起,末端膨隆,细胞核大.传代后的细胞胞体大,呈扁平多角形,符合Müller细胞的形态.细胞免疫组织化学和免疫荧光技术检测显示95％以上的细胞中GFAP呈阳性表达,90％以上的细胞中GS呈强阳性表达. 结论 应用透明质酸酶和胰蛋白酶混合液消化法可以成功分离人视网膜Müller细胞,分别用含20％胎牛血清和含10％胎牛血清的RPMI1640培养液培养和传代的人视网膜Müller细胞产量高且纯度好.     

SD大鼠Müller细胞的原代培养

目的:原代分离培养SD大鼠Müller细胞,在实验室建立Muller细胞株.方法:采用改良的酶消化法培养新生大鼠的视网膜Müller细胞,免疫组化法进行鉴定.结果:原代培养的Muller细胞胞体狭长,胞浆丰富,经过3～5次传代后逐渐变得胞体宽大,出现微丝和突起.免疫组化显示,95%以上的细胞谷氨酰胺合成酶染色阳性.结论:改良的酶消化法是培养视网膜MUller细胞的简单有效的方法.     

SD大鼠Mller细胞的原代培养

目的：原代分离培养SD大鼠Müller细胞,在实验室建立Müller细胞株。方法：采用改良的酶消化法培养新生大鼠的视网膜Müller细胞,免疫组化法进行鉴定。结果：原代培养的Müller细胞胞体狭长,胞浆丰富,经过3～5次传代后逐渐变得胞体宽大,出现微丝和突起。免疫组化显示,95%以上的细胞谷氨酰胺合成酶染色阳性。结论：改良的酶消化法是培养视网膜Müller细胞的简单有效的方法。     

SD大鼠Müller细胞的原代培养

目的:原代分离培养SD大鼠Mller细胞,在实验室建立Mller细胞株。方法:采用改良的酶消化法培养新生大鼠的视网膜Mller细胞,免疫组化法进行鉴定。结果:原代培养的Mller细胞胞体狭长,胞浆丰富,经过3~5次传代后逐渐变得胞体宽大,出现微丝和突起。免疫组化显示,95%以上的细胞谷氨酰胺合成酶染色阳性。结论:改良的酶消化法是培养视网膜Mller细胞的简单有效的方法。     

视网膜Muller细胞的培养

Ｍｕｌｌｅｒ细胞参与视网膜的多种生理病理过程，近年来发展起来的Ｍｕｌｌｅｒ细胞培养技术为揭示其机制提供了一条有效途径，本介绍了Ｍｕｌｌｅｒ细胞的分离培养，纯化鉴定技术。组织块贴壁培养法及酶消化培养法是目前普遍使用的培养方法。在细胞纯化方面，有毛吸管吸取，机械震荡吹打，速率沉淀，梯度离心等多种方法，而以机械震荡吹打法应用最广，Ｍｕｌｌｅｒ细胞的鉴定以形态学鉴定及免疫组化鉴定为主。     

酶-机械分离-酶消化法分离培养兔眼虹膜色素上皮细胞

目的　建立兔眼虹膜色素上皮细胞体外培养体系。方法　采用酶 机械分离 酶消化法分离兔眼IPE细胞 ,台盼蓝染色法测定细胞活力 ,在体外对其进行原代及传代培养扩增 ,倒置相差显微镜观察IPE细胞的生长情况。取第 2次传代的IPE细胞行AE1/AE3及S 10 0抗体细胞免疫组化染色对其进行鉴定。结果　酶 机械分离 酶消化法分离得到IPE细胞的活力为 70 %～ 85 % .原代细胞 16～ 4 8h贴壁 ,72h后开始生长 ,细胞大多呈多角形或方形 ,少数为梭形 ,12～ 16d生长融合为单层细胞。第 1次传代的IPE细胞 6～ 12h贴壁 ,5～ 7d生长融合为细胞单层。IPE细胞在体外培养可传 5～ 6代。免疫组化染色显示 ,几乎所有细胞胞浆呈现棕黄色阳性反应 ,对照组胞浆不染色。结论　酶 机械分离 酶消化法分离培养兔眼IPE细胞易于操作 ,联合应用细胞角蛋白、S 10 0蛋白单克隆抗体的免疫组化技术可用来鉴定IPE细胞。     

高糖对视网膜Müller细胞VEGF,EPO和EPOR mRNA表达的影响

目的:观察高糖条件下VEGF mRNA,EPO mRNA和EPORmRNA在体外培养的Mller细胞中的表达情况。方法:胰蛋白酶将新生小鼠视网膜组织吹打消化后,制成单细胞悬液,体外培养Mller细胞,RT-PCR测定高糖条件下视网膜Mller细胞VEGF,EPO和EPOR基因的表达。结果:成功获得视网膜Mller细胞,传代后90%以上的细胞呈兔抗鼠谷氨酰胺合酶(GS)染色阳性。Mller细胞VEGF mRNA,EPO mRNA和EPOR mRNA在高糖条件下表达升高,且呈浓度依赖性(P<0.05),但糖浓度50mmol/L组较40mmol/L组差异无统计学意义,无明显时间依赖性。结论:Mller细胞在高糖条件下VEGF,EPO,EPOR的表达增加。     

大鼠视网膜微血管周细胞的选择性培养

背景视网膜微血管周细胞（RMPs）在糖尿病视网膜病变（DR）等视网膜新生血管性疾病中的作用日益受到重视,并被视为潜在的治疗靶点。然而因组织材料来源受限及细胞分离纯化不易,RMPs体外研究工作的开展受到了限制。目的建立简便的大鼠RMPs分离、培养和纯化方法。方法摘取清洁级健康雄性SD大鼠的眼球,置于体积分数75％乙醇中浸泡1min,用眼科显微手术器械分离获取视网膜并将其剪成碎片,依次用2．5g／L胰蛋白酶和2g／LⅠ型胶原酶各消化15min,消化后分别过直径100μm和55μm滤网,收集视网膜消化后的微血管片段,用含有体积分数20％胎牛血清的低糖型DMEM接种于6孔板,至培养14～16d细胞达到80％～90％融合时进行消化传代,培养和传代期间通过换液法及差异消化法去除杂质细胞。用倒置相差显微镜观察细胞的形态和生长状态,用免疫荧光法检测细胞中α-平滑肌肌动蛋白（α—SMA）、血小板源性生长因子受体-β（PDGFR—β）、von Willebrand因子（vWF）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达,以鉴定RMPs。结果RMPs在接种后24—48h自微血管片段中迁移出,7d后形成中等大的细胞集落,14～16d后达到80％-90％融合状态。RMPs传代后生长速度加快,至12—14d达到融合。形态学鉴定显示,培养的细胞呈宽大、扁平、不规则形并伴多个突起的典型周细胞形态特征,且传代至第9代形态特征无明显变化。免疫荧光法检测显示,所培养的细胞均不表达内皮细胞特异性标志物vWF,约96％的细胞对周细胞标志物α—SMA或PDGFR—β抗体呈阳性反应,极少量细胞对胶质细胞特异性标志物GFAP抗体呈阳性表达。结论本实验成功建立了一种简单、经济的大鼠RMPs分离、纯化、培养方法,可以获得理想的高纯度RMPs。     

新生大鼠视网膜Müller细胞原代培养方法的改良

背景 目前,视网膜Müller细胞的干细胞特性日益受到关注,优化Müller细胞的培养方法对视网膜干细胞治疗的进一步研究具有重要意义. 目的 对视网膜Müller细胞的原代培养方法加以改良,建立一种简单、有效的实验室分离纯化Müller细胞的方法.方法 取新生SPF级SD大鼠眼球,培养基浸泡后室温条件下避光过夜,显微镜下分离视网膜,直接吹打成微小组织悬液后接种于培养瓶中,8～10d后行第1次换液,之后2～3d换液1次,至细胞完全融合后进行传代.细胞形态一致后于光学显微镜下观察细胞的形态特征,免疫荧光法检测Müller细胞标志物谷氨酰胺合成酶(GS)和波形蛋白(Vimentin)的表达,进行细胞鉴定;采用流式细胞术对所得细胞进行纯度检测. 结果 原代培养的Müller细胞胞体狭长,细胞质丰富.传至3代的细胞95％以上对GS和Vimentin反应阳性,阳性染色主要位于细胞质和细胞核.Vimentin阳性染色主要位于细胞质.流式细胞仪检测显示传3代后99.7％的细胞GS表达阳性. 结论 采用Müller细胞改良法-流式细胞术对所得细胞进行纯度检测,简单可行,收获的细胞数量多、纯度高.     

免疫磁珠法原代分离培养大鼠视网膜微血管周细胞

目的建立免疫磁珠法原代分离纯化大鼠视网膜微血管周细胞，并确定其免疫组化特征。方法免疫磁珠法结合传统的胶原酶消化及筛网过滤法分离出大鼠视网膜微血管周细胞，采用含有20％胎牛血清的DMEM培养。通过周细胞的形态和生长方式初步鉴别，再进行细胞α—SMA，vWF，GFAP抗体免疫组织化学特征鉴定，及激光共聚焦显微镜行用细胞PDGFR-β和desmin抗体荧光双标观察。周细胞生长曲线通过MTT法测定。结果本法获得的周细胞纯度可达98％，并能连续传代。原代周细胞约2～3周融合，传代后生长和融合速度加快，细胞形态不规则，胞内可见丝状结构，无接触性抑制。免疫组化证实周细胞胞浆内α-SMA蛋白表达阳性，内皮细胞特异性vWF因子表达阴性，胶质细胞特异性GFAP表达阴性。激光共聚焦显示周细胞PDGFR-β和desmin抗原表达均为阳性。结论本研究首次报道应用免疫磁珠法分离培养大鼠视网膜微血管周细胞。获得高度纯化的周细胞具有明确的免疫组化特征，可用于相关视网膜血管性疾病的进一步研究。     

缺氧对视网膜Müller细胞促红细胞生成素mRNA和蛋白表达的影响

目的 探讨缺氧条件下促红细胞生成素（EPO）mRNA及蛋白在体外培养的Müller细胞的表达情况。 方法 胰酶消化新生大鼠视网膜组织制成单细胞悬液，机械震荡、吹打法分离纯化视网膜Müller细胞，反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫细胞化学方法对缺氧条件下视网膜Müller细胞EPO基因和蛋白的表达进行测定。 结果 成功获得视网膜Müller细胞，传代后95%以上的细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色阳性。EPO蛋白的阳性染色位于视网膜Müller细胞的细胞浆及突起上。在正常的视网膜Müller细胞中仅见微弱的EPO mRNA和蛋白表达，而缺氧后表达明显上调，且呈时间依赖性。 结论 Müller细胞在缺氧条件下EPO mRNA和蛋白表达增强，EPO表达水平的升高可能是缺氧性视网膜病变的神经保护因素之一。 (中华眼底病杂志, 2006, 22: 196-199)     

豚鼠近视眼视网膜Müller细胞的原代培养

目的研究豚鼠近视眼视网膜Müller细胞原代培养的方法。方法用半透明眼罩遮盖法建立豚鼠的近视眼模型。采用酶消化法培养豚鼠近视眼视网膜Müller细胞,用倒置相差显微镜观察Müller细胞的生长状况,以GFAP、Vimentin免疫组化染色进行细胞鉴定。结果半透明眼罩遮盖豚鼠右眼2周后,遮盖眼眼轴延长,近视形成。原代培养的视网膜Müller细胞贴壁生长,胞体较大、扁平,GFAP、Vimentin免疫组化染色呈阳性。结论酶消化法是培养豚鼠近视眼视网膜Müller细胞的一种有效方法。     

胎儿角膜上皮细胞分离方法的研究

目的:为了利用流产儿角膜组织体外培养获取角膜上皮细胞,做为构建组织工程化角膜上皮的种子细胞。方法:收集30例(60个角膜)人流产胎儿,分别采用酶消化法、酶消化法结合组织块法和组织块法3种方法分离并培养人胎儿角膜上皮细胞。结果:用Dispase和胰蛋白酶冷消化角膜上皮后,在获取细胞总数、细胞活力和原代培养成功率上没有明显差异,但用Dispase消化后原代细胞容易成活,传代可得到纯化的上皮细胞;酶消化法结合组织块法培养时加入角膜缘组织块可以缩短细胞形成单层的时间,增加传代后细胞的活力;组织块法培养时,在胎儿全角膜组织培养时可得到角膜上皮细胞,角膜组织切割后培养不能获得纯化的角膜上皮细胞。结论:体外构建组织工程化角膜上皮时,种子细胞的获取可以采用流产儿角膜组织为材料分离并培养角膜上皮细胞。     

改进的酶消化法培养新生大鼠Müller细胞

目的通过改进的酶消化法,简化Muller细胞的培养和纯化过程。方法采用将眼球培养前处理和机械吹打、贴壁后反复胰蛋白酶消化的方法培养新生大鼠Muller细胞,进行免疫组织化学染色和光电镜观察。结果培养的Muller细胞光镜下胞体较大,胞浆丰富,电镜下细胞器丰富,可见糖原和直径为10nm的微丝,免疫组织化学示95%以上细胞谷氨酰胺合成酶阳性,神经胶质纤维酸性蛋白阴性。结论改进的酶消化法是一种简单可行的Muller细胞培养方法。     

脂质体介导增强型绿色荧光蛋白基因在鼠视网膜Müller细胞中的表达

目的研究脂质体介导增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因对体外培养的鼠视网膜Müller细胞转染的有效性及安全性。方法采用视网膜组织块法培养鼠视网膜Müller细胞,振荡法分离纯化细胞,并对其进行免疫细胞化学鉴定。用阳离子脂质体Lipofectamine 2000负载pEGFP-N1质粒转染Müller细胞,荧光显微镜检测转染后12、24、48、72h的转染效率。台盼蓝排斥实验检测转染和未转染细胞的活力,明确脂质体Lipofectamine 2000对Müller细胞的毒性作用。结果成功培养视网膜Müller细胞,传代后90%以上的细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色阳性。Lipofectamine 2000介导质粒pEGFP-N1转染Müller细胞后12、24、48、72h的转染效率分别为（9.7±1.9）%、（18.1±16）%、（17.2±2.5）%、（16.9±1.7）%。台盼蓝排斥实验显示Lipofectamine 2000转染前后活细胞率分别为（98.2±5.6）%、（96.1±6.2）%。结论脂质体Lipofectamine 2000可安全有效地介导Müller细胞的转染,为进一步明确Müller细胞的病理、生理功能及靶向Müller细胞的基因治疗提供了新的手段。