准分子激光原位角膜磨镶术后角膜细胞凋亡的研究

目的 了解准分子激光原位角膜磨镶术（laser in situ keratomileusis,LASIK）后早期角膜基质细胞凋亡的特点并探索LASIK术后角膜愈合反应程度与角膜刀的机械损伤、激光能量的相关性。方法 20只新西兰白兔,其中10只兔左眼为LASIK-4.0D组、右眼为LASIK-8.0D组、另10只兔左眼为单纯角膜瓣组、右眼作为空白对照组,在术后4小时处死兔取角膜制作病理切片,行透射电镜检查,用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标法（terminal-deoxynucleotidyl transferase medi-ated dUTP nick end labeling,TUNEL）原位显示凋亡细胞,激光扫描共聚焦显微镜观察凋亡细胞形态,定量统计比较凋亡水平差别。结果 三个手术组中角膜基质中均出现凋亡细胞,主要分布于角膜瓣和基质床交接面两侧50μm范围内的基质层中;瓣缘的凋亡水平高于中央部。而空白对照组中,凋亡细胞仅出现在表层上皮,角膜基质细胞未见凋亡。三个手术组的TUNEL阳性细胞计数进行方差分析,三组之间差异无显著意义（F=1.008,P〉0.05）;每组不同个体的TUNEL阳性细胞计数存在明显的差异。结论 正常角膜基质细胞不发生凋亡。角膜基质细胞凋亡与角膜损伤有关。LASIK术后早期即可出现角膜基质细胞的凋亡表达,该表达与角膜瓣的制作有关,与激光切削的深度、能量无明显的相关性。     

细胞凋亡与角膜损伤修复

角膜基质细胞凋亡影响着包括屈光知识性角膜手术在内的损伤修复过程。本就角膜损伤修复过程中细胞凋亡的概况,相关基因以及影响细胞凋亡发生的局部微环境,细胞凋亡的意义进行了综述。     

20%乙醇处理兔角膜后上皮增生和细胞凋亡的研究

目的探讨准分子激光角膜上皮瓣下磨镶术(LASEK)中采用20%乙醇浸润兔角膜40s后角膜上皮增生和角膜细胞凋亡情况与机械刮除角膜上皮后的异同。方法实验组42只新西兰大白兔,用直径为8mm的LASEK专用角膜上皮刀切割角膜上皮,20%的乙醇浸润单眼40s,机械刮除对侧眼中央8mm直径的角膜上皮,随机分7组,于术后0、4h,1、3、5、8、30d取材;6只兔眼为空白对照。角膜冰冻切片,行Ki67免疫组化检查和TUNEL检测,计数角膜中央前基质细胞。结果乙醇浸润后5d中央角膜上皮增生达峰值,术后1d周边角膜上皮增生达峰值;术后4h上皮刀口下方局限的角膜基质细胞TUNEL染色阳性,数量最多;各组角膜中央前基质细胞计数和空白对照比差异无统计学意义(P=0.68)。机械刮除角膜上皮后3d周边角膜上皮增生达峰值,其高于乙醇浸润后角膜上皮的增生峰值;术后4h可见大量中央前基质细胞TUNEL阳性;术后1d中央前基质细胞数量最少(P<0.05)。结论与机械刮除角膜上皮相比,20%乙醇浸润40s对角膜损伤轻,恢复快,乙醇浸润后的角膜上皮对基质细胞有保护作用。     

准分子激光角膜切削术与磨镶术后兔角膜基质细胞凋亡的研究

目的研究准分子激光角膜切削术(photorefractive keratectomy,PRK)和准分子激光原位角膜磨镶术(laser in situ keratomileusis,LASIK)后不同时间点角膜基质细胞凋亡的特点并探索不同手术方式、不同的矫正度数对角膜基质细胞凋亡水平的影响。方法50只新西兰纯种白兔随机分为A、B两大组,每组25只;A组兔子为PRK组,B组兔子为LASIK组;每组兔子左眼进行-4.0D激光切削,右眼进行-8.0D激光切削。分别在术后4h、24h、1w、4w和3m五个时间点处死兔子,每个时间点每组随即处死5只兔子,取兔角膜制作病理切片,行透射电镜检查,用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)原位显示凋亡细胞,激光扫描共聚焦显微镜观察凋亡细胞形态,定量统计比较凋亡水平的差别。结果在术后4h、24hPRK组角膜基质中凋亡细胞较多,其中PRK-8.0D组的凋亡细胞数较PRK-4.0D组多,其差异有显著性意义(P<0.05);在术后4h、24h两个时间点,PRK-8.0D组与LASIK-8.0D组的角膜基质中的凋亡细胞数进行比较,两者差异有显著性意义(P<0.05);在不同的时间点,LASIK-4.0D组与LASIK-8.0D组TUNEL阳性细胞计数的比较,两者之间差异无显著性意义(P>0.05)。结论LASIK术后角膜基质细胞的凋亡水平较PRK低,凋亡程度与制瓣中的角膜损伤有关,与切削深度无明显相关;PRK术后角膜基质细胞的凋亡水平随切削深度增加而增高。     

丝裂霉素C诱导PRK后角膜基质细胞凋亡的实验研究

目的 探讨丝裂霉素C(MMC)对准分子激光角膜切削术(PRK)后角膜基质细胞凋亡的影响.方法 30只兔随机取1只眼行PRK并术中使用0.02%MMC为PRK MMC组,另1只眼仅行PRK设为PRK组,2只兔设为正常对照组.观察角膜上皮下混浊(haze)程度;采用苏木精-伊红染色法、TUNEL法和免疫组织化学法观察角膜细胞.结果 术后1周,1、2、3个月角膜haze差异均有统计学意义(P＜0.05).术后1周,1、2、3个月PRK MMC组与PRK组TUNEL染色、α-SMA阳性细胞数相比,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 术中眼局部应用0.02%MMC溶液可促进活化的角膜基质细胞凋亡,减轻PRK术后haze.     

脱细胞猪角膜基质体外支持角膜上皮和基质细胞的生长

目的:探讨脱细胞猪角膜基质体外能否支持兔角膜细胞的生长。方法:体外培养兔角膜上皮细胞和基质细胞,并接种到制备的脱细胞猪角膜基质上,倒置相差显微镜和组织学观察细胞生长情况。结果:上皮细胞能在脱细胞猪角膜基质上贴附生长,10d时可形成2~3层的复层结构。基质细胞在脱细胞猪角膜基质上贴附生长后可向材料深层迁徙。结论:制备的脱细胞猪角膜基质体外可支持兔角膜上皮细胞和基质细胞的生长。     

准分子激光屈光性角膜切削术后兔角膜基质细胞凋亡及其防治的研究

目的：探讨准分子激光屈光性角膜切削术（photorefractive keratectomy,PRK）后凋亡机制介导的角膜创伤愈合反应对屈光度数回退和角膜雾状混浊（haze）的影响,以及局部应用锌制剂的药物效果。方法：对90只新西兰白兔行双眼PRK,将左眼作为实验眼,手术前、后分别给予A组0．1％地塞米松眼液、B组0．5％硫酸锌眼液和C组0．04％丝裂霉素眼液滴眼;右眼作为对照眼。术后定期裂隙灯下观察haze的程度,测量角膜的厚度,进行光镜和透射电镜观察,采用脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法行凋亡细胞检测,并进行对比性分析。结果：（1）PRK术后角膜前基质细胞出现凋亡,实验眼B组凋亡细胞最少（P＜0．01）。（2）术后角膜厚度增加,前基质细胞增多,实验眼haze和增生程度眼B组凋亡细胞最少（P＜0．01）。（3）术后角膜上皮增生,实验眼B组角膜上皮厚度最小（P＜0．01）。结论：PRK术后屈光度数回退和haze的形成是凋亡机制介导的角膜创伤愈合过程,锌制剂可阻止角膜前基质细胞凋亡,最大限度减轻反应性过度增生,有望成为临床防治haze形成和屈光度数回退的理想药物。     

角膜上皮和基质对角膜上皮基底膜再生的影响

基底膜是一种高度特化的细胞外基质,广泛存在于人体的各组织中。自19世纪基底膜被发现以来,人们逐渐认识了其结构和功能。角膜上皮基底膜(EBM)通过限制活化的纤维化因子,参与调控角膜瘢痕形成。角膜损伤后,角膜瘢痕的形成和持续时间由角膜EBM的损伤程度及再生速度决定。角膜上皮及基质共同参与了角膜EBM的再生。角膜上皮的迅速再...     

角膜疾病中细胞凋亡的作用机制

Dohlman CH等〔1〕三十年以前发现 ,前基质层的角膜细胞在上皮损伤后消失 ,当时被认为是由于机械损伤引起的组织暴露于周围环境及渗透压改变引起的。但很长时间因为检测仪器及检测方法的相对落后 ,对这个重要发现没有深入研究。 Campos M等〔2〕于九十年代初重新开始这一研究 ,证实上皮损伤后角膜细胞的消失是由细胞程序性死亡 (PCD)即凋亡引起的。凋亡是生物体在进化过程中去除不需要的细胞 ,而同时不释放降解酶引起周围组织细胞损伤的自身调节过程。凋亡与机体发育、体内环境稳定、感染、损伤和疾病的病理、生理变化都密切相关。角膜…     

机械法准分子激光上皮瓣下角膜磨镶术与去瓣Epi-LASIK术后兔角膜基质细胞凋亡的研究

目的观察机械法准分子激光上皮瓣下角膜磨镶术（Epi-LASIK）与去瓣Epi-LASIK术后不同时间点角膜基质细胞的凋亡,探讨2种手术方式对角膜创伤修复过程的影响。方法 42只新西兰大白兔随机编号,其中40只兔各取一侧眼行Epi-LASIK,对侧眼行去瓣Epi-LASIK,剩余2只兔4只眼作为正常对照组。分别于术后4h,1、3、7d共4个时间点取出角膜组织,透射电镜下观察各组兔角膜组织的超微结构改变,采用TUNEL法检测2组兔手术后不同时间点角膜基质细胞的凋亡情况,应用免疫组织化学法检测2组兔手术后不同时间点白细胞介素-1β（IL-1β）在角膜基质细胞中的表达。结果 Epi-LASIK组术后1d及3d角膜基质细胞凋亡细胞数明显高于去瓣Epi-LASIK组,差异均有统计学意义（t=2.42,P〈0.05;t=4.04,P〈0.05）;Epi-LASI组术后1、3、7d角膜基质中IL-1β表达的阳性细胞数明显高于去瓣Epi-LASIK组,差异均有统计学意义（t=2.13,P〈0.05;t=3.71,P〈0.05;t=3.06,P〈0.05）。Epi-LASIK组术后透射电镜下可见兔角膜基质细胞核固缩,染色质边集并可见凋亡小体。免疫组织化学染色显示Epi-LASIK组术后角膜基质中IL-1β的表达强于去瓣Epi-LASIK组。结论去瓣Epi-LASIK对角膜基质细胞的损害较Epi-LASIK轻,提示去瓣Epi-LASIK术后早期角膜创伤愈合反应的程度较轻,有利于角膜组织的快速修复。     

兔角膜上皮和基质细胞共同培养模型中的相互作用

目的探讨利用细胞生物学和工程学原理在体外培养角膜上皮和基质细胞,模拟上皮和基质细胞相互作用的生存环境,了解角膜上皮细胞和基质细胞间的作用规律。方法分别进行体外兔角膜上皮细胞和基质细胞的原代培养及传代的二维平面培养,利用特殊培养装置制作上皮细胞和基质细胞共同培养的模型,达到两种细胞胞体不混合,而其分泌的成分可以相互渗透、相互作用的目的,从而更好地观察各自细胞的生长状态。描绘角膜上皮细胞和基质细胞的生长曲线及二者在相互作用模型中的生长曲线。利用激光共聚焦显微镜观察上皮细胞和基质细胞在单独培养和三维共同培养模型中上皮细胞胞间通讯的变化特点。结果角膜上皮细胞倍增时间为3．45d,共同培养的上皮细胞倍增时间为3．30d,角膜基质细胞倍增时间为2．11d,共同培养的基质细胞倍增时间为2．32d,共同培养的上皮细胞增长与单独培养的上皮细胞相比,差异有统计学意义（P〈0．01）,共同培养的基质细胞增长与单独培养的基质细胞相比,差异有统计学意义（P〈0．01）。与角膜基质细胞共同培养的角膜上皮细胞胞间通讯明显高于单独培养的基质细胞,差异有统计学意义（U=2．691,P〈0．05）。结论共同培养的细胞模型是理想的。角膜上皮细胞在与基质细胞共同存在的条件下比单独培养下的增殖能力增强,而角膜基质细胞在与上皮细胞共同存在的条件下比单独培养的增殖能力减弱;而上皮细胞在与基质细胞共同存在的条件下,细胞间通讯增强。     

准分子激光兔角膜切削术后细胞凋亡和增殖

目的 寻找准分子激光角膜切削术（ＰＲＫ）术后细胞凋亡和激活增殖的动态联系,评价激光去除上皮（ＰＴＫ）和机械刮除上皮（ＭＥＳ）对凋亡和增殖的影响。方法 对１８只兔按ＰＴＫ和ＭＥＳ行ＰＲＫ（－９．９０Ｄ,６．０ｍｍ直径）,术后定期用活体共聚焦显微镜观察及制作病理切片,ＴｄＴ介导ｄＵＴＰ缺口末端标记（ＴＵＮＥＬ）原位显示凋亡细胞,激光扫描共聚焦显微镜观察凋亡细胞形态,定量统计比较凋亡水平差别。结果 ＰＲ     

脱细胞猪角膜基质的生物相容性与组织工程化兔角膜上皮移植的研究

目的 探讨脱细胞猪角膜基质的生物相容性,评价组织工程化角膜上皮组织作供体的可行性,观察支架材料的细胞化情况和种子细胞的存活情况.方法 实验研究.采用完全随机化设计的方法,用Dispase-Triton-X-100处理猪角膜基质,脱去角膜细胞;以角膜基质囊袋内植入的方法,观察异种角膜基质植入后的生物相容性,A组:脱细胞猪角膜基质,B组:新鲜猪角膜基质,C组:空白对照组.以组织工程化雄性角膜上皮组织为供体,同种雌性为受体,作板层角膜移植,观察角膜的混浊、水肿、新生血管等情况;组织病理学和免疫组化方法检测支架材料的细胞化情况,Y染色体性别决定基因(SRY)-聚合酶链反应(PCR)方法追踪种子细胞的存活情况.结果 猪角膜基质植入兔角膜囊袋后,角膜逐渐恢复透明,排斥反应指数＜6,组织病理学观察角膜结构完整,胶原纤维平行排列,少许细胞长入脱细胞猪角膜基质边缘,各组免疫组化检测未见CIM+、CD8+T淋巴细胞浸润.组织工程化角膜上皮作异体板层角膜移植后,3～4 d上皮光滑,10～20 d变为透明;15 d时角膜上皮、基质、内皮完整,上皮细胞约4或5层结构,少许基质细胞长入支架,1个月时可见角膜上皮细胞约7或8层细胞,基质纤维排列规则,多量细胞长入脱细胞角膜基质.上皮细胞表达CK3,支架内新生细胞表达波形蛋白.SRY-PCR结果显示种子细胞可以在受体内长期存活.结论 脱细胞猪角膜基质生物相容性良好,组织工程化角膜上皮可作为板层角膜移植的供体,脱细胞猪角膜基质细胞化良好,种子细胞可以在受体内长期存活.     

基质再生剂促进角膜上皮损伤愈合的研究进展

角膜上皮急性损伤通常在48小时内愈合,而持续性角膜上皮缺损和慢性角膜溃疡常常难以治愈。角膜上皮的愈合很大程度上取决于细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的重塑。硫酸乙酰肝素(heparin sulfate,HS)是ECM的重要成分,可与细胞外基质蛋白、生长因子和细胞因子特异结合,从而保护它们免...     

羊膜上皮细胞培养液抑制角膜基质细胞凋亡的实验研究

目的 对羊膜上皮细胞培养液抑制由肿瘤坏死因子(TNF-α)诱发的角膜基质细胞凋亡进行研究。方法 体外培养兔角膜基质细胞(RCK),30ng/ml TNF-α诱发角膜基质细胞凋亡。实验分为对照组、羊膜上皮细胞培养液组(羊膜组)和阴性对照组。应用FITC-dUTP-TUNEL和DAPI染色检测RCK细胞凋亡发生率,分别测定经24h培养后各组细胞凋亡特异性DNA梯形降解。Western blot检测细胞凋亡保护性因子Bcl-2、促进因子Bax在经羊膜上皮细胞培养液处理后于细胞中表达强度及Bcl-2/Bax比值变化。结果 羊膜上皮细胞培养液明显抑制由TNF-α诱发的兔角膜基质细胞凋亡,DAPI染色显示24h对照组,羊膜培养液组和阴性对照组细胞凋亡发生率分别为:42.4％±4.3％,2.2％±0.3％和2.7％±0.4％。DNA降解实验显示羊膜上皮细胞培养液明显抑制TNF-α诱导的DNA片段降解。Western blot显示羊膜上皮细胞培养液明显刺激RCK细胞Bcl-2蛋白的表达和分泌。结论 羊膜培养液中可能释放的多种细胞因子对TNF-α诱发的角膜基质细胞调亡具有明显的抑制作用,其作用机制之一是刺激Bcl-2在RCK细胞的表达,并使Bcl-2/Bax比值上调。     

角膜基质细胞研究进展

角膜基质细胞,存在于角膜基质层中,在正常情况下,处于静止状态。但当角膜损伤时,不同上皮来源的因子及环境信号,将影响角膜基质细胞的应答反应,决定着角膜能否完全被修复或形成角膜瘢痕。本文就角膜基质细胞的分布、形态、受激后的应答反应情况及与角膜疾病的关系作一综述。     

细胞凋亡与角膜

细胞凋亡是近年生命科学领域研究的最新热门课题之一，本文就细胞凋亡的概念，形态及生化特征，检测方法，基因调控以及角膜细胞凋亡的研究进展和临床意义进行综合评述。     

深低温保存导致胎儿角膜细胞凋亡的初步研究

目的:研究新鲜和深低温保存后的胎儿角膜的细胞凋亡情况。方法:应用TUNEL法对20例新鲜及深低温保存后胎儿角膜进行了细胞凋亡的研究。结果:凋亡的角膜细胞全为细胞核着色。新鲜角膜中平均每高倍视野可见凋亡细胞0.817±0.612个,经冷冻保存后的角膜每高倍视野可见凋亡细胞平均为7.483±2.490个,经统计学处理P<0.05,差异有显著性。结论:新鲜胎儿角膜可见极少量凋亡细胞。胎儿角膜经深低温冷冻保存后,凋亡细胞数量显著增加。降温-复温损伤可能与细胞凋亡有关。     

准分子激光屈光性角膜切削术后角膜上皮愈合的影响因素

目的　探讨年龄、性别、绷带式隐形眼镜配戴、术后局部使用不同药物及手术切削深度诸因素对PRK术后角膜上皮愈合的影响。方法　对 2 5 8例实施PRK术病人 (393只眼 )进行前瞻、随机、双盲、设立安慰剂对照的临床研究。结果　不同年龄、性别、术后配戴隐形眼镜及手术切削深度诸因素对角膜上皮愈合时间无显著性差别 (P >0 0 5 )。术后使用双氯灭痛滴眼液、透明质酸钠及安慰剂组角膜上皮愈合的时间分别是 :3 78天± 1 37天、2 86天± 1 44天、3 31天± 1 5 0天 (P <0 0 5 )。结论　年龄、性别、术后配戴隐形眼镜以及手术切削深度对PRK术后角膜上皮愈合不构成影响 ,而双氯灭痛可延长角膜上皮愈合 ,透明质酸钠可促进角膜上皮的修复。     

血竭素高氯酸盐促进离体兔角膜基质细胞凋亡的作用

目的 观察天然药物血竭素高氯酸盐(Dp)对离体兔角膜基质细胞增生的抑制作用,探讨其对细胞凋亡的影响,为临床上角膜瘢痕的防治提供新思路.方法 新西兰白兔18只,采用组织块培养法,在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中培养兔角膜基质细胞,通过含有EDTA的胰蛋白酶消化进行传代.采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测不同质量浓度Dp(10～80 μg/mL)对细胞生长的抑制率,电镜观察Dp作用后角膜细胞的凋亡情况,流式细胞术(FCM)检测Dp作用后细胞凋亡率.结果 第3代角膜基质细胞呈现对波形蛋白单克隆抗体阳性反应和对角蛋白12多克隆抗体的阴性反应.角膜上皮细胞对角蛋白12抗体呈现绿色的荧光反应.Dp作用24、48、72 h后,其IC50分别为47.721、41.40、32.01 μg/mL.MTT比色法显示Dp对角膜基质细胞的抑制率呈现明显的质量浓度依赖性;电镜可观察到角膜细胞的凋亡;FCM检测Dp作用24 h的细胞凋亡率呈剂量依赖性升高(P<0.01).在Dp作用后24、48、72 h,Dp质量浓度与抑制率呈正相关(r=0.984,P<0.01;r=0.947,P=0.007;r=0.920,P=0.03).结论 Dp对兔角膜基质细胞的增生具有显著的抑制作用,且呈量效关系促进角膜基质细胞发生凋亡.