BMP-7基因修饰的骨髓间充质干细胞在小鼠肾脏内的表达

目的 构建BMP-7基因腺相关病毒,转染骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),移植入小鼠体内,观察其在肾脏的定植情况.方法 采用分子克隆技术,构建重组质粒pAAV-BMP-7.采用磷酸钙沉淀法,重组质粒与pAAV-RC、pHelper共转染HEK-293细胞,产生具有传染性的病毒颗粒.将此病毒颗粒转染BMSCs后,经尾静脉注射入小鼠体内,免疫组化方法检测其在肾脏的定植情况.结果 成功构建了BMP-7基因腺相关病毒,可以高效转染BMSCs,移植入小鼠体内后,该细胞可在肾脏内定植.结论 BMSCs能稳定、高效表达外源基因BMP-7,并可在肾脏内定植.     

人和鼠源性RANTES基因的克隆和腺病毒表达载体的建立

目的 :克隆人和小鼠的活化T细胞表达与分泌调节基因 (RANTES基因 )并分别构建腺病毒表达载体。方法 :利用RT -PCR方法从人的扁桃体组织和小鼠的脾细胞中克隆RANTES基因并将其克隆入T -easy保存载体中 ,使用Stratagene公司的ADEasy -XL腺病毒载体组装试剂盒建立表达该基因的腺病毒表达载体并使用CsCl2 密度梯度离心法浓缩病毒悬液。空斑试验显示病毒的滴度为2×1011cfu/ml。结果 :该实验成功地克隆了人和小鼠的RANTES基因并分别建立了表达该基因的腺病毒表达载体。结论 :表达人和小鼠RANTES基因的腺病毒载体的建立为今后的体内和体外功能试验奠定了基础     

乙肝病毒X蛋白增强小鼠体内HBV的转录及复制

目的 观察小鼠体内乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBx)对HBV基因转录和复制水平的影响.方法 应用高压射体内转染法将野生型HBV重组质粒、HBx表达缺失的HBV重组质粒及HBx表达质粒DNA通过尾静脉快速注射入小鼠体内,应用Southern和Northem印迹分别检测小鼠肝组织中HBV DNA复制中间体及HBV mRNA水平.结果 野生型HBx表达缺失的HBV重组质粒注射组小鼠肝组织中均检测到HBV的复制与转录;HBx表达缺失的HBV重组质粒注射组HBV基因转录和复制水平较野生型HBV重组质粒注射组、HBx表达缺失HBV重组质粒与HBx表达质粒共注注射组弱,生理盐水注射组未检测到HBV的转录与复制.结论 HBx的表达缺失可导致体内HBV基因转录和复制水平的下降,而外源HBx的表达可逆转这种因HBx表达缺失引起的HBV复制及转录的减弱,提示HBx增强小鼠体内HBV基因转录和复制.     

Plunc序列启动子转基因小鼠模型的建立

目的利用携带有鼻咽组织相对特异性启动子plunc构建的载体建立转基因动物模型。方法将plunc-EGFP质粒用XhoⅠ酶切线性化,胶回收线性化片段,稀释浓度4 μg/ml。采用显微注射法将外源基因注射入小鼠受精卵细胞内。结果产13只小鼠。PCR检测基因整合,其中阳性12只,阳性率92.30%;Southern blot检测阳性3只,阳性率23%。结论鼻咽组织相对特异性启动子plunc可有效地将外源基因整合入小鼠体内。     

ras基因及ras蛋白

“ras”这名字是由于该基因首先在大鼠肉瘤病毒(rat sarcoma virus)中发现而得。1964年,英国学者Harvey在做莫尼氏致白血病病毒(Moloney’s leukemogeic virusMLV)传代时,用一种大鼠血浆(该大鼠在出生时接种了含有MLV的小鼠血浆),注射到15只新生的小鼠体内。结果发现,在32天内存活的6只小鼠中有5只在注射部位或附近长出肉瘤。后来发现使小鼠发生肉瘤的转化基因ras,并不是这种肉瘤病毒株特有的,它也是大鼠的正常细胞基因。另外,在一系列细胞恶性转化试验中,用从     

Plunc序列启动子转基因小鼠模型的建立

目的 利用携带有鼻咽组织相对特异性启动子plunc构建的载体建立转基因动物模型。方法 将plunc—EGFP质粒用XhoI酶切线性化，胶回收线性化片段，稀释浓度4μg／ml。采用显微注射法将外源基因注射入小鼠受精卵细胞内。结果 产13只小鼠。PCR检测基因整合，其中阳性12只，阳性率92．30％；Southernblot检测阳性3只，阳性率23％。结论 鼻咽组织相对特异性启动子plunc可有效地将外源基因整合入小鼠体内。     

乙型肝炎病毒preS2蛋白在转基因小鼠肝脏中的表达

目的：分析乙型肝炎病毒preS2蛋白在3’末端缺失的preS/S基因转基因小鼠肝脏中的分布及其病理学作用。方法：采用原核显微注射法将质粒pcDNA3.1-preS/S^t注射入小鼠受精卵雄原核，制备转基因小鼠。PCR法在基因组小平筛选3’末端缺失的preS/S基因转基因小鼠首建者（founder）及后代；免疫组织化学法在蛋白水平检测preS2蛋白在这些小鼠中的表达；H－E染色分析转基因小鼠肝组织的病理学变化。结果：以原核显微注射法将目的片段注射入受精卵雄原核后，共出生15只新生小鼠，其中存活7只，经PCR检测后获得2只founder转基因小鼠，命名为C57－TgN(preS/S^t）SMMU。免疫组织化学检测发现转基因小鼠肝细胞质中有preS2蛋白表达，H－E染色发现转基因小鼠肝组织中央静脉周围有淋巴细胞聚集。将这2只转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配，进行传代培育，PCR法筛选阳性转基因小鼠，目前已传至F2代。结论：本研究成功建立了稳定遗传3’末端缺失的preS/S基因并表达preS2蛋白的转基因小鼠C57－TgN(preS/S^t)SMMU，它将是体内研究3’末端缺失的preS/S基因的表达产物在体内的生物学作用及其与肝细胞内细胞癌基因的转录激活之间关系的理想动物模型。     

乙型肝炎病毒x基因转基因小鼠模型的建立及培育

目的：建立可表达乙型肝炎病毒X蛋白的HBx基因（adr亚型）转基因小鼠模型，以研究x基因的功能。方法：采用基因重组技术构建含有CMV启动子和HBx基因（adr亚型）开放阅读框（ORF）的真核表达载体pcDNA3-HBx。该载体经Sal I限制性内切酶线性化后，琼脂糖电泳回收目的的片段，用原核显微注射法将其注射入雄原核，制备转基因小鼠。复合PCR法在基因组水平筛选HBx基因转基因小鼠founder；免疫组织化学法在蛋白水平检测X蛋白在这些小鼠中的表达情况。结果：成功构建了HBx基因真核表达载体pcDNA3-HBx。经原核显微注射法将目的片段注射入受精卵雄原核后，出生并存活了11只新生鼠，经PCR检测后获得5只founder转基因小鼠，命名为C57－TgN(HBx)SMMU。免疫组织化学检测发现5只PCR阳性小鼠的肝细胞质中均有X蛋白的表达。将这5只转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配，进行传代培育，复合PCR法筛选阳性转基因小鼠，目前已传至F4代。结论：本研究成功地产生了稳定遗传HBx基因并表达X蛋白的转基因小鼠C57－TgN（HBx)SMMU，它将有利于体内研究HBx基因在肝细胞癌发生中的作用。     

HBx通过Notch信号通路在正常免疫小鼠体内导致肝癌的作用机制

目的 构建长期携带乙型肝炎病毒X(hepatitis B virus X,HBx)的正常免疫小鼠模型,以探讨HBx在体内导致肝癌发生的机制.方法 将转染HBx的肝前体细胞经肝门静脉注射入昆明小鼠体内构建动物模型,分别于术后30、90、180、360 d收取肝脏组织,Western blot和RT-qPCR检测HBx的表...     

基于腺相关病毒血清型8型介导的Gjb2基因c.109G>A纯合突变耳聋小鼠的基因治疗

目的·探究腺相关病毒血清型8型(adeno-associated virus serotype 8,AAV8)介导的野生型缝隙连接蛋白β2 (gap junction protein β 2,Gjb2)基因在Gjb2基因c.109G>A纯合突变小鼠(简称Gjb2纯合突变小鼠)耳蜗支持细胞区域的表达情况及安全性,以及对呋塞米引起的听力下降的影响。方法·将带有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的AAV8-GFP病毒,经耳蜗中阶注射入新生Gjb2纯合突变小鼠的内耳,注射14 d后取小鼠耳蜗,荧光显微镜观察基底膜GFP的表达情况。将载有野生型Gjb2基因的AAV8-GJB2-GFP病毒经中阶注射入新生Gjb2纯合突变小鼠内耳后,于4周后通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测耳蜗Gjb2 mRNA及其编码的连接子蛋白(connexin 26,CX26)的表达水平,通过免疫荧光法观察其具体表达位置。通过听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)实验评价新生纯合突变小鼠中阶注射AAV8-GJB2-...     

小鼠骨桥蛋白(OPN)基因RNA干扰慢病毒载体的构建及体内抑制效果鉴定

 目的 构建骨桥蛋白(osteopontin,OPN)基因RNA干扰慢病毒载体并在小鼠体内鉴定其抑制效果。方法 参照OPN GenBank上的序列,对OPN基因沉默位点进行分析,设计针对OPN信使RNA的小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)OPN shRNA及阴性对照(negative control shRNA,NC shRNA)序列,合成pSicoR GFP shRNA重组体。经鉴定序列无误后,与pCMV VSV G 和pCMV dR8.91辅助质粒包装并转染293FT细胞,得到有效滴度为5×109 TU/mL的病毒原液。经尾静脉将构建的慢病毒载体注射入小鼠体内,qRT PCR及Western blot检测小鼠肝脏OPN mRNA及蛋白的抑制效果。结果 成功构建针对OPN的shRNA慢病毒载体,经纯化、浓缩得到滴度为5×109TU/mL病毒原液。与正常对照组、阴性对照组相比,实验组OPN mRNA及蛋白表达水平明显下降;正常对照组、实验组OPN mRNA及蛋白表达水平无明显差别。结论 利用RNA干扰技术,借助慢病毒载体,成功构建小鼠肝脏OPN基因低表达模型。为进一步研究OPN在胆石症等疾病中的作用提供了有力工具。     

鸡贫血病毒VP3基因体内抑瘤效应的实验研究

目的 观察鸡贫血病毒（chicken anemia virus,CAV)VP3基因的体风抑瘤效应。方法 分别将PCDNA-VP3（含VP3基因的真核表达载体），PCDNA3（空载体）和小鼠腹水型肝癌细胞株H22混合后，接种于BALB/c小鼠皮下，几天后，处死动物，取肿瘤组织称重，比较试验组和对照组瘤重差异，确定VP3基因的抑瘤效应，TUNEL法鉴定VP3在体内诱导肿瘤细胞死亡的方式。结果 注射VP3基因的试验组肿瘤生长率明显低于注射空载体的对照组。TUNEL试验的结果也表明，鸡贫血病毒VP3蛋白在体内调亡方式诱导肿瘤细胞死亡。结论 预示VP3基因可能在抑制肝癌细胞生长方面有一定的疗效。     

A型流感病毒M基因DNA疫苗载体构建及免疫性研究

目的构建A型流感病毒M基因DNA疫苗质粒载体并对免疫后小鼠体内免疫应答反应进行分析和评价。方法将H3N2亚型流感病毒M基因通过RT-PCR扩增后克隆构建DNA疫苗载体pBudCE4．1-M,并将pBudCE4．1-M质粒体外瞬时转染COS7细胞并通过Western blot鉴定M1蛋白的表达,然后将pBudCE4．1-M质粒免疫小鼠。通过EUSA对小鼠体内生成的M1蛋白IgG抗体进行鉴定。结果M基因被成功克隆到质粒载体pBudCE4．1上,并在体外COS7细胞中表达出28kD的M1蛋白。疫苗质粒免疫小鼠后4周,在小鼠血清中检测到M1蛋白kG抗体的吸光度有明显升高。结论成功构建了一种A型流感病毒M基因DNA疫苗载体,将其免疫小鼠后成功诱导小鼠体内产生了特异性的IgG抗体。     

庚型肝炎病毒全基因转基因小鼠的制备与遗传

目的：利用显微注射方法产生整合庚型肝火病毒（HGV）全基因的转基因小鼠，并研究HGV基因的遗传特性。方法：将含有HGV全长基因的载体线性化后，将目的基因DNA溶于显微注射用缓冲液，依常规方法进行显微注射，得到仔鼠后用PCR及基因组DNA Southern印迹法鉴定。阳性小鼠即为建立者（founder)上鼠，将founder小鼠与正常小鼠交配得到1代小鼠，随后将F1代阳性鼠与正常小鼠交配得到F2代小鼠。结果：共得到5只founder小鼠，其中4只与正常小鼠交配，得到F1代小鼠共41只，其中29只为阳性，阳性率为71％。F2代小鼠共21只，其中16只为阳性，阳性率为76％。结论：得到了整合有HGV全长基因的转基因小鼠，并证明HGV基因可以在转基因小鼠体内稳定传递。     

CRISPR/Cas9 基因编辑技术在脑退行性疾病研究中的应用及问题

CRISPR/Cas9 基因编辑技术自2012 年报道以来,经过不断改进后已展示物种普适性、高效与较高通量、低成本等优点,成为现阶段最常用的基因编辑技术。在神经科学领域,CRISPR/Cas9 技术不仅可应用于离体神经细胞,也可以在受精卵、胚胎、成年时期应用,在体脑组织水平产生效应;应用目的涉及脑基因与功能研究、基因敲除/ 敲入小鼠模型的构建、某些神经系统疾病的实验性治疗等。在脑退行性疾病研究中,CRISPR/Cas9 基因编辑技术已经用于亨廷顿病小鼠模型（HD140Q 基因敲入小鼠）的实验性治疗,初步展示了令人鼓舞的治疗效果。腺相关病毒AAV 是无包膜的单链DNA 缺陷型病毒,对分裂细胞或非分裂细胞均可感染,但通常无致病性。成年小鼠实施脑CRISPR/Cas9 基因编辑的常用方法是AAV 病毒混合物注射,但在实际应用中尚有多个技术问题尚待解决。例如,①在小鼠海马部位注射AAV 后,基因编辑较易发生在齿状回,但CA1 区神经元胞体尚难实现高效率基因编辑。②AAV 病毒装载容量相对小,如用经典的化脓链球菌Cas9酶（SpCas9）和MECP2 启动子,SpCas9 通常需要与gRNA 分开包装。替代方法包括使用较小的金黄色葡萄球菌的SaCas9 酶,或者使用容量较大的整合酶缺陷慢病毒,但这两种替代方法都存在一些局限性。③总体上,目前脑内神经元的基因编辑效率比较低,即使Salk 研究所Belmonte 实验室建立的同源非依赖性靶向嵌入（homology-independent targeted integration,HITI）改良方法,小鼠脑内注射仅有视皮层的资料,实际编辑效率也显著低于5%。本实验室试验了神经元特异性新型小启动子,以期可将SpCas9 与gRNA 包装进单一AAV 载体,这方面的尝试取得了初步成功。未来还将试验高效病毒载体AAV-PHP.B 的在体应用效果,以期提升在体脑神经元的基因编辑效率。未来,如何实现高效、安全的CRISPR/Cas9 体内递送（in vivo）,仍然是一个具有挑战性的难题。     

辐照对水流动力学注射介导的小鼠体内基因表达的影响

目的探寻辐照对水流动力学注射（HGT）介导的荧光素酶报告基因在小鼠体内的表达影响,从而评估水流动力学注射方法在小鼠造血干细胞移植模型中应用的有效性。方法将实验鼠分为辐照组和非辐照组,尾静脉大体积快速注射带有荧光素酶报告基因的真核表达质粒PGL3-luc。于注射后6h腹腔注射荧光素酶底物,并通过活体动物体内光学成像系统检测基因表达的初始水平。将辐照组小鼠进行700c Gy非清髓性全身照射,并于水流动力学注射后12、24、48、72、96、120 h通过活体动物体内光学成像系统对两实验组小鼠体内目的基因的表达水平进行监测。结果通过尾静脉进行水流动力学注射的PGL3-luc质粒在注射后6h于小鼠肝脏大量表达,其平均表达水平为（3739±924.8）相对荧光单位（RLU）/（sec·mg）蛋白。在各个时间监测点辐照组与非辐照组相比实验鼠体内基因表达水平差异均有统计学意义（均P〉0.05）,其表达水平均于水流动力学注射72 h后显著降低。结论小鼠移植前的辐照预处理对水流动力学注射介导的基因在小鼠体内的表达并无影响,该种新型基因转移表达方法可以有效地应用于小鼠造血干细胞移植模型中。     

SARS病毒N蛋白真核表达质粒构建及诱导的体液免疫

目的构建SARS病毒核衣壳蛋白（N）的真核表达质粒，并研究其在小鼠体内诱导的体液免疫应答。方法采用PCR方法体外扩增SARS病毒N蛋白基因片段，定向克隆入真核表达栽体pVAC，构建pVAC-N重组质粒；大量制备该重组质粒，经基因枪腹部皮内注射免疫BALB／c小鼠三次，间接ELISA法测定免疫鼠IgG抗体效价。结果成功构建了重组表达质粒pVAC-N，免疫小鼠后可诱导产生出特异性的IgG抗体。结论构建的真核表达质粒pVAC-N能诱导小鼠产生特异性抗体，为SARS疫苗的进一步研究打下基础。     

感冒病毒治愈癌症

一种人们所熟悉的,能引起普通感冒的病毒可能被用于治疗癌症。印第安纳大学生物学系的Milton Taylor及其同事惊奇地发现,给患人乳腺癌的小鼠注射腺病毒5可能治愈这些小鼠。这种病毒可使人产生轻微的感冒症状。 Taylor曾进行试验测定此腺病毒的有效性,此种病毒经过基因工程处理,以便产生一种合成干扰素——一种抗癌化合物。但当他们给对照组小鼠注射天然腺病毒(无干扰素基因)时,他们感到很吃惊,许多     

二氢叶酸还原酶基因在肿瘤生物治疗中的作用

目的 :为了保护骨髓免受或少受化疗药物的损伤 ,用转染人类突变二氢叶酸还原酶 (DHFR)基因反转录病毒载体 ,研究其耐药特性及在小鼠造血细胞的表达和对造血细胞的保护作用。方法 :将含有DHFR基因的病毒上清转染小鼠骨髓造血细胞 ,将转染后的骨髓细胞从尾静脉回输给经致死量 (9Gy)照射的小鼠 ,用MTX和G4 18筛选。结果 :经G4 18和MTX筛选均可得到阳性克隆 ,实验组小鼠白细胞计数和红细胞压积逐渐恢复正常 ,而对照组小鼠 30d内全部死亡。结论 :经初步研究表明 ,该反转录病毒载体能成功转染小鼠造血细胞 ,并表达目的基因 ,使在MTX筛选下重建小鼠造血功能。     

β防御素2转基因小鼠抗金黄色葡萄球菌感染的研究

目的探讨转基因小鼠抗金黄色葡萄球菌作用。方法用分子克隆方法构建β防御素2（HBD-2）全长cDNA重组质粒,通过显微注射技术,将重组片段注射入小鼠雌原核细胞,聚合酶链反应（PCR）方法检测小鼠HBD2基因整合情况,免疫组化检测转基因小鼠HBD2表达和组织分布。用金黄色葡萄球菌腹腔攻击转基因阳性小鼠观测全身情况和死亡数。结果DNA序列测定证明重组质粒插入HBD-2cDNA片段无误,PCR显示7只小鼠已整合HBD-2基因,PCR阳性小鼠免疫组化显示HBD2基因在肺、肠道、肝、肾、睾丸、小脑等组织广泛表达。腹腔攻击实验显示7只转基因小鼠4只存活,而野生小鼠10只全部死亡。结论HBD-2在体内具有显著抗金色葡萄球菌感染能力。