人免疫缺陷病毒1(HIV-1)膜蛋白基因片段在酵母中的克隆表达

目的为获得足够量的膜糖蛋白,以便于对不同ＨＩＶ分离株膜糖蛋白的结构与功能进行进一步的研究。方法从人免疫缺陷病毒１（ＨＩＶ－１）ＨＸＢ２分离株原病毒基因组的重组质粒ｐＨＸＢ２中克隆了两段膜糖蛋白基因（ＥＮＶ）片段。以酵母穿梭诱导表达质粒ｐＹＥＳ２为载体,构建了两个相应的重组表达质粒ｐＹＥＮＶ１和ｐＹＥＮＶ２;进一步利用大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因（β－ｌａｃＺ）构建了ＨＩＶ－１膜外糖蛋白ＤＮＡ片段与β－ｌａｃＺ基因的融合表达质粒。将此３种质粒分别转化单细胞真核生物酿酒酵母ＢＪ１９９１,得到的转化子经半乳糖诱导表达后进行菌体全蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。结果克隆的基因片段在酿酒酵母中产生了分子质量为５０×１０３的特异性诱导蛋白;对含此融合表达质粒的酵母转化子半乳糖诱导后表达产物的免疫检测表明,与对照菌株相比,融合表达产物具有和ＨＩＶ－１阳性血清抗体反应的抗原性。结论可通过β－半乳糖苷酶活性的测定直接指示抗原片段的表达;为表达的膜糖蛋白片段的进一步分离纯化打下了一定基础     

人免疫缺陷病毒Ⅰ型包膜糖蛋白gp120基因在大肠杆？…

目的 提高人免疫缺陷病毒Ⅰ型（ＨＩＶ－１）包膜糖蛋白ｇｐ１２０基因在原核中的表达量。方法 采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增出５６０ｂｐ的ＨＩＶ－１ＬＡＶ株ｇｐ１２０Ｎ端基因片段，经ＥｃｏＲⅠ及ＳａｌⅠ酶切后插入高效表达载体ＰＥＴ２８ａ得到重组质粒ｐＥＴ／１２０，并转化表达宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３），经诱导高效表达出ＨＩＶ－１ｇｐ１２０基因片段。结果 间接酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）及Ｗｅｓｔｅｒ     

人免疫缺陷病毒Ⅰ型包膜糖蛋白gp120基因在大肠杆菌中的高效表达

目的提高人免疫缺陷病毒Ⅰ型（ＨＩＶ－１）包膜糖蛋白ｇｐ１２０基因在原核系统中的表达量。方法采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增出５６０ｂｐ的ＨＩＶ－１ＬＡＶ株ｇｐ１２０Ｎ端基因片段，经ＥｃｏＲⅠ及ＳａｌⅠ酶切后插入高效表达载体ｐＥＴ２８ａ，得到重组质粒ｐＥＴ１２０，并转化表达宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３），经诱导高效表达出ＨＩＶ－１ｇｐ１２０基因片段。结果间接酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ实验表明，表达产物具有良好的抗原性及特异性。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析结果表明，ｇｐ１２０表达量占总菌体蛋白的５０％。结论在原核系统中高效表达了ＨＩＶ－１ｇｐ１２０基因     

人类免疫缺陷病毒1型云南株外膜蛋白原核表达克隆的构建

目的为研究我国云南１型人类免疫缺陷病毒（Ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｖｉｒｕｓｔｙｐｅ１，ＨＩＶ－１）流行株外膜蛋白（ｇｐ１２０）的有关抗原表位。方法采用套式聚合酶链式反应，以来自云南流行区ＨＩＶ－１感染者的外周血单核巨噬细胞基因组为模板，进行云南流行株外膜蛋白基因（ｅｎｖ）片段的扩增，并将ｅｎｖ基因片段与原核表达载体ｐＢＶ２２０进行重组，构建成质粒ｐＹＮｅｎｖ并在大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ１０ｂ）中获得表达。采用限制性内切酶分析进行重组质粒的鉴定。结果含重组质粒的宿主菌经３０℃２０小时培养后，转入４２℃培养５小时，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳分析有重组蛋白的表达。经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ反应证实，该重组蛋白可与来自该流行区的ＨＩＶ－１感染者血清（含多克隆抗体）发生特异反应。结论该重组膜蛋白可作为抗原用于ＨＩＶ－１膜蛋白抗体的检测，并为进一步研究ＨＩＶ－１ｇｐ１２０的病理机制奠定了基础。     

HIV—1 env与hIL—2基因在重组痘苗病毒中的共表达研究

以痘苗病毒复制非必需区血凝素基因为侧翼,将编码人白细胞介素２的基因片段克隆到真核表达质粒ｐＪ３８ｅｎｖ的下游,构建成吸ＨＩＶ－１ ｅｎｖ和ｈＩＬ－２两种外源基因的重组表达质粒ｐＪ３８Ｅ－ＩＬ－２,经同源重组和血凝素阴性空斑筛选,获得了重组痘苗病毒ｖＪ３８Ｅ－ＩＬ２。     

克隆中国B,C,E亚型的HIV—1代表株建立适于我国流行株的 …

目的 构建我国人免疫缺陷病毒１型（ＨＩＶ－１）Ｂ、Ｃ和Ｅ各亚型代表株ｅｎｖ基因质粒,用于对中国ＨＩＶ－１进行分型。方法 将与我国ＨＩＶ－１ Ｂ,Ｃ和Ｅ各亚型共享序列最接近的毒株用套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增包膜（ｅｎｖ）基因,克隆到ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ载体中,构建成用于异源双链泳动分析（ＨＭＡ）分型的中国标准亚型质粒,并进行了序列分析和分型的敏感性分析。结果 构建的中国ＨＩＶ－１ Ｂ,Ｃ和Ｅ     

人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIv-1)gag前体蛋白片段在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（ＨＩＶ－１）核心抗体的检测对于ＨＩＶ－１感染者的筛选及确证分析，感染病人的预后分析都具有重要的意义。为此需要获得大量重组核心蛋白。本文利用新型原核表达载体ｐＤＯＧ，在大肠杆菌中高效表达了人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（ＨＩＶ－１）ｇａｇ基因片段。表达载体利用ＬＰＲ启动子以及Ｔ７噬菌体基因１０（ｇ１０）的核糖体结合位点（ＲＢＳ）来有效起始表达基因的翻译。表达片段ＰＧ１包括ｐ１７Ｃ－端１３ａａ、整个ｐ２４以及ｐ１５Ｎ－端７４ａａ。与ＰＧ１相比ＰＧ２片段不含有ｐ１７序列，并缺失了ｐ２４Ｎ－…     

钩端螺旋体外膜抗原基因ompL1在卡介苗中的克隆和初步 …

目的 将钩端螺旋体外膜基因ｏｍｐＬ１克隆到大肠杆菌－卡介苗（Ｅ．ｃｏｌｉ－ＢＣＧ）穿梭质粒载体ｐＹ６００２中，将重组质粒导入ＢＣＧ并对重组ＢＣＧ的表达进行初步表达研究。方法 采用ＰＣＲ技术直接从致病性钩端螺旋体（钩体）赖型０１７株基因组中扩增钩体外膜蛋白基因ｏｍｐＬ１，并克隆到Ｅ．ｃｏｌｉ－ＢＣＧ穿梭质粒载体ｐＹ６００２中，重组质粒经电转化导入ＢＣＧ。斑点杂交筛选重组ＢＣＧ，再通过免疫印迹对其表达     

登革2型病毒NGC株E基因在NIH3T3细胞中的表达？…

目的 构建登革２型病毒Ｅ基因的真核表达载体,实现登革病毒Ｅ蛋白的真核表达。方法 采用逆录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增登革２型病毒（ＮＧＣ株）包膜糖蛋白Ｅ基因全长片段,克隆人真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的Ｐｃｍｖ启动子下游,构建重组真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｅ,用脂质体转染法转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞,表达产物以免疫荧光、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和蛋白质印迹进行分析检测。结果 成功构建了重组真核表达质粒ｐｃＤＮ     

钩端螺旋体外膜抗原基因ompL1在卡介苗中的克隆和初步表达

目的将钩端螺旋体外膜基因ｏｍｐＬ１克隆到大肠杆菌－卡介苗（Ｅ．ｃｏｌｉ－ＢＣＧ）穿梭质粒载体ｐＹ６００２中，将重组质粒导入ＢＣＧ并对重组ＢＣＧ的表达进行初步表达研究。方法采用ＰＣＲ技术直接从致病性钩端螺旋体（钩体）赖型０１７株基因组中扩增钩体外膜蛋白基因ｏｍｐＬ１，并克隆到Ｅ．ｃｏｌｉ－ＢＣＧ穿梭质粒载体ｐＹ６００２中，重组质粒经电转化导入ＢＣＧ。斑点杂交筛选重组ＢＣＧ，再通过免疫印迹对其表达进行初步研究。结果在所得６个重组ＢＣＧ中，有３个表达了ｏｍｐＬ１基因产物，其中一个表达较强。结论本研究为发展新一代高效广谱的钩体基因工程疫苗打下了基础。     

深圳市HIV-1 E亚型感染毒株的分子流行病学分析

目的 了解人类免疫缺陷病毒１型Ｅ亚型毒株在深圳市不同人群中流行传播情况、流行时间和传播规律。方法 应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法对１９９６年深圳市检出的３份人类免疫缺陷病毒１型（ＨＩＶ－１）感染者外周血单个核细胞样本进行扩增,获得ＨＩＶ－１膜蛋白（ｅｎｖ）基因片段,并对Ｃ２－Ｖ３及其邻区３５０～４５０个核苷酸序列进行测定和分析。结果 这３份血样为ＨＩＶ－１Ｅ亚型毒株感染（ｓｚ－Ｅ）,彼此间的基因离散率为２．６％;与Ａ－Ｅ国际参考亚型及国内部分地区流行的ＢＥ型代表株比较,ｓｚ－Ｅ与Ａ－Ｄ参考亚型共享序列及国内Ｂ亚型代表株间的基因离散率均大于２４％,而与主要代表泰国Ｅ亚型（Ｅｃｏｎ）间的基因离散率仅为６．２％。系统树分析显示,ｓｚ－Ｅ与Ｅｃｏｎ聚集在一起,远离其他国际亚型毒株序列。结论 ＨＩＶ－１Ｅ亚型在深圳的流行     

Epstein—Barr病毒膜抗原在昆虫细胞sf9中的表达,纯 …

将Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ（ＥＢ）病毒膜抗原基因（ＥＢＶ－ＭＡ）称ＭＡ１和截去穿膜区的ＭＡ基因称ＭＡ２分别插入杆状病毒表达载体ｐＶＬ－９４１。将两种重组质粒分别与杆状病毒ＤＮＡ共转染ｓｆ９细胞后获得Ｂａｃｕｌｏ－ＭＡ１和Ｂａｃｕｌｏ－ＭＡ２两种重组病毒，表达产物分别位于重组病毒感染的细胞表面或释放到细胞培养液中。免疫荧光方法检查，在感染的细胞表面表达产物与抗ＭＡ的单克隆抗体特异性地结合，ＳＤＳ－Ｐ     

中国流行株HIV—1gag和hIL—2／hIL—6核酸疫苗构建与实验免疫研究

目的 探讨中国流行株ＨＩＶ－１ｇａｇ与ｈＩＬ－２／ｈＩＬ－６共表达重组核酸疫苗闰的免疫效果。方法 以核酸疫苗质粒ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ为表达载体,构建重组核酸疫苗质料ｐＩＲＥＳ１－ｇａｇ、ｐＩＲＥＳ１－ｇａｇ－ｈＩＬ－２、ｐＩＲＥＳ１－ｇａｇ－ｈＩＬ－６,通过间接免疫荧光试验、Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ检测ｇａｇ／ｈＩＬ－２／ｈＩＬ－６基因的表达产物。另将此重组核酸疫苗质粒免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,进行淋巴细胞转化试验、ＣＤ４＾＋、ＣＤ８＾＋Ｔ淋巴细胞数量测定、细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）特异性杀伤作用检测及血清抗体检测,结果 构建的重组质粒转染ＢＨＫ细胞后可表达目的基因,免疫小鼠后可有效地刺激淋巴细胞增殖、诱导特异性ＣＴＬ反应,当和ｈＩＬ－２／ｈＩＬ－６共表达时免疫效果更加显著。讨论 与Ｇａｇ蛋白共表达的ｈＩＬ－２／ｈＩＬ－     

人类免疫缺陷病毒I型包膜糖蛋白gp41的基因重组表达

目的 基因重组表达（ＨＩＶ－１ ｇｐ４１）抗原,并研制一种快速,简便,灵敏性高,特异性强的国产ＨＩＶ－１免疫检测试剂。方法 选用ＨＩＶ－１型ＢＨ１０毒株的包膜糖蛋白ｇｐ４１的部分基因（６９７７－７４９７）,重组在ＰＢＶ２２１表达载体上。表达产物通过１５％ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳初步分离纯化,根据ＲＦ值,切下含特异蛋白的胶带,以Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法转移在硝酸纤维素膜上;     

4型腺病毒疫苗株载体的构建及β—半乳糖苷酶基因的 …

目的 构建缺失Ｅ３区７８．９－８６ｍｕ的４型腺病毒疫苗株载体。方法 从４型腺病毒疫苗株感染的人胚肺二倍体细胞２ＢＳ中提取病毒ＤＮＡ,经过多卡亚克隆构建成功缺失７８．９￣８６ｍｕ的载体。将含有ＣＭＶ早期启动子的β－半乳糖苷酶基因插入缺失部位,将这一重组质粒与Ａｄ４Ｂｃｌ１大片段共转染２９３细胞,铺含有Ｘ－Ｇａｌ的营养琼脂,经蓝色斑斑纯化三代,ＯＮＰＧ法测定β－半乳糖苷酶基因的表达量。结果 所构建的载     

4型腺病毒疫苗株载体的构建及β-半乳糖苷酶基因的表达

目的构建缺失Ｅ３区７８．９－８６ｍｕ的４型腺病毒疫苗株载体。方法从４型腺病毒疫苗株（Ａｄ４）感染的人胚肺二倍体细胞２ＢＳ中提取病毒ＤＮＡ,经过多步亚克隆构建成功缺失７８．９－８６ｍｕ的载体。将含有ＣＭＶ早期启动子的β－半乳糖苷酶基因插入缺失部位,将这一重组质粒与Ａｄ４ＢｃｌⅠ大片段共转染２９３细胞,铺含有Ｘ－Ｇａｌ的营养琼脂,经蓝色蚀斑纯化三代,ＯＮＰＧ法测定β－半乳糖苷酶基因的表达量。结果所构建的载体能稳定地表达β－半乳糖苷酶基因。结论４型腺病毒疫苗株载体的构建为利用该病毒做为基因工程疫苗载体打下了基础。     

HSV—1 SM44株糖蛋白D基因真核表达载体的构建及其免？…

目的 构建ＨＳＶ－１型ＳＭ４４株糖蛋白Ｄ（ｇＤ）基因的真核表达载体,并用此重组质粒直接免疫小鼠,探讨ＨＳＶ－１ ｇＤ基因作为基因疫苗的可能性。方法 从ＨＳＶ－１基因组中扩增ｇＤ的全编码基因,克隆入载体ｐＵＣ１９中,测序鉴定后转入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）。所得重组质粒ｐｃＤ－ＮＡ－ｇＤ以电穿孔法转染ＣＨＯ细胞,并以荧光染色法鉴定表达效果。用ｐｃＤＮＡ－ｇＤ免疫小鼠,ＥＬＩＳＡ法检测基因免疫     

HPV18 L1基因重组DNA构建及其免疫小鼠体内特异抗体的测定

目的：人类乳头瘤病毒１８型（ＬＰＶ１８）感染与宫颈癌的发生高度相关。其晚期基因Ｌ１编码的Ｌ１结构蛋白是刺激机体产生中和抗体的主要抗原。利用ＨＰＶ Ｌ１基因重组质粒进行ＤＮＡ疫苗的初步免疫学实验研究。方法：从ＨＰＶ１８－ｐＢＲ３２２质粒中扩增ＨＰＶ１８ Ｌ１基因,测序证明扩增片段的可靠性,构建了两个真核表达重组质粒ＨＰＶ１８ Ｌ１－ｐｃＤＮＡ３和ＨＰＶ１８Ｌ１－ｐｃＥＰ４。将提纯的质粒ＤＮＡ直接免疫     

人类免疫缺陷病毒Ⅰ型包膜糖蛋白gp41的基因重组表达

目的基因重组表达（ＨＩＶ１ｇｐ４１）抗原，并研制一种快速、简便、灵敏性高、特异性强的国产ＨＩＶ１免疫检测试剂。方法选用ＨＩＶ１型ＢＨ１０毒株的包膜糖蛋白ｇｐ４１的部分基因（６９７７７４９７），重组在ＰＢＶ２２１表达载体上。表达产物通过１５％ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳初步分离纯化，根据ＲＦ值，切下含特异蛋白的胶带，以Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法转移在硝酸纤维素膜上；免疫血清法检测合格者制备的抗原检测条带，经国家标准参比血清检测。结果获得１株含ＨＩＶ１ｇｐ４１基因的重组质粒，其蛋白的特异性表达为８％，经ＨＩＶ１阳性血清检测和国家标准参比血清检定，该表达蛋白灵敏性、特异性均为１００％。结论（１）可以选用单一的ｇｐ４１作为ＨＩＶ１感染初筛试剂的抗原。（２）表达载体ＰＢＶ２２１其表达的目的蛋白为非融合蛋白，作为试剂中的抗原，可降低检测中的非特异性。（３）该试剂是一种简便、特异、灵敏性高的试剂。     

应用PRPL串联启动子表达HIV-2gag蛋白

探讨ＨＩＶ－２ｇａｇ非融合蛋白的表达。方法：应用ＤＮＡ重组技术,将ＨＩＶｇａｇ基因全序列（ｇａｇ）和部分（ｇａｇ’）ｃＤＮＡ片段克隆到ｐＢＶ２２０载体ＰＲＰＬ串联启动子下游,构建成ＨＩＶ－２ｇａｇ重组表达载体ｐＢＶ－ｇａｇ和ｐＶＢ－ｇａｇ’,在大肠杆菌中表达。结果：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示,ＰＢＶ－ｇａｇ’在２１ｋＤ处可见一明显的客外蛋白带,经薄层扫描分析占菌体总蛋白的６．１％,蛋白印迹结果证明,表达