乳鼠成骨细胞酵母双杂交cDNA文库构建

目的构建乳鼠成骨细胞的酵母双杂交cDNA文库。方法用TRIzol法提取乳鼠成骨细胞总RNA,按照SMART cDNA Library Construction Kit ( CLONTECH)说明书反转录合成双链cDNA.Spin Column去除短片段,然后用同源重组的方法将双链 cDNA和PGADT7~rec载体共转化到酵母细胞Y187中,建立文库并计算文库滴度。结果提取的总RNA的A 260/A 280为 1.99,琼脂糖凝胶电泳示28SrRNA、18SrRNA2条带,且28S与18S带亮度比值约为2。酵母文库库容为1. 68 x 107,重组率为 100%。插人片段PCR检测提示大小分布为1. 5 -4. 0 kb,平均长度约为3. 0 kb。结论乳鼠成骨细胞酵母双杂交cDNA文 库构建成功。     

人分泌的凋亡相关蛋白1基因酵母双杂交诱饵载体的构建及表达鉴定

目的构建人分泌的凋亡相关蛋白1(secreted apoptosis-related protein 1,SARP1)基因酵母双杂交诱饵载体,为鉴定SARP1基因相互作用蛋白、探讨SARP1基因在瘢痕组织中的生物学功能奠定基础。方法根据GenBank中SARP1的mRNA序列,设计分别带有NdeⅠ和SalⅠ酶切位点的上、下游引物,人工合成SARP1基因片段,扩增SARP1基因片段,构建含pGBKT7-SARP1基因的重组质粒,用NdeⅠ和SalⅠ进行双酶切、PCR,凝胶电泳及测序。用醋酸锂法将序列正确的重组质粒pGBKT7-SARP1(卡那霉素抗性筛选)转化入AH109酵母菌株,在缺陷型培养基上观察pGBKT7-SARP1在AH109中的表达情况。结果 SARP1基因扩增后的片段大小符合预期,并成功克隆入pGBKT7载体中;酶切后凝胶电泳及DNA测序显示pGBKT7-SARP1基因重组载体构建正确,对酵母菌株AH109无毒性,且不具自主激活报告基因的效应。结论成功构建了pGBKT7-SARP1基因酵母双杂交诱饵载体。     

人睾丸酵母双杂交cDNA文库的构建与鉴定

目的:构建应用于酵母双杂交系统的人睾丸组织cDNA文库。方法:从正常人睾丸组织总RNA中纯化出mRNA,以SMARTШTM和CDSШ为引物,合成两端具有同源臂的双链cDNA,后者与线性质粒pGADT7-Rec共转化入感受态酵母细胞Y187,两者在酵母细胞中同源重组成环形的cDNA文库质粒,收集在营养缺陷培养板上筛选出的所有克隆,即为人睾丸酵母双杂交cDNA文库。结果:构建了具有基因多样性和库容量足够大的人睾丸cDNA文库,共获得2×106个转化子,插入的双链cDNA片段的长度在0.3～4.0 kb之间。结论:利用ClontechSMART技术,成功构建了应用于酵母双杂交的人睾丸组织cDNA文库,为探讨人精子发生的分子机制奠定了基础。     

雄激素受体相关蛋白267-α酵母双杂交诱饵重组质粒的构建及转化

目的 构建和转化雄激素受体相关蛋白267—α(ARA267—α)的酵母诱饵重组质粒，为通过酵母双杂交研究ARA267—α的功能奠定基础。方法 用PCR扩增ARA267—α全长cDNA中编码PWWP和PHD-SET蛋白结构域的两个基因片段；将基因片段与pGBKT7载体定向重组；用酶切和测序鉴定重组质粒；将核苷酸序列正确的重组质粒转化入AH109酵母菌株。结果 成功构建pGBKT7-PWWP和pGBKT7—PHDSET重组质粒。分别转化有2种重组质粒和pGBKT7空载体的3种AH109酵母都能在SD／-Trp／X—α—gal培养基中长成白色菌落，但都不能在SD／-HiS／-Trp／2．5mmol／L 3-AT／X—α—gal和SD／-Ade／-Trp／X—α—gal培养基中生长，在SD／-Trp液中培养16h后，A600均值分别为0．8、0．9、0．9。这表明重组质粒表达的融合蛋白没有激活HIS3、ADE2和MEL1酵母报告基因表达的活性，也没有酵母毒性作用。结论 构建的诱饵重组质粒可以用于下一阶段的cDNA文库筛选。     

酵母双杂交技术筛选p7TP2蛋白结合肝细胞蛋白的编码基因

目的 筛选HCV p7蛋白反式调节蛋白p7TP2的结合蛋白,探讨HCV的致病机制及新蛋白p7TP2的生物学功能.方法 应用酵母双杂交系统3,将多聚酶链反应(PCR)法扩增的p7TP2基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化单倍体酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝细胞文库质粒pACT2的单倍体酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠埃希菌氨苄青霉素-LB平板上选择并测序,结果在GenBank中进行生物信息学分析.然后将阳性文库质粒与诱饵质粒回交,以证实其相互作用.结果 筛选出与p7TP2结合的蛋白基因10个,其中包括金属硫蛋白2A、载脂蛋白H、蛋白C、果糖二磷酸醛缩酶B、配对免疫球蛋白样2型受体α、CTL1基因类胆碱运输蛋白等已知功能蛋白基因相互作用,回交试验已经证实其相互作用.结论 由本研究结果发现p7TP2蛋白可以结合一系列不同功能的肝细胞蛋白,作为一种新基因,对它的进一步作用机制的研究将为阐明HCV感染及慢性肝炎、肝纤维化和肝癌的病理机制提出新的思路.     

应用酵母双杂交系统筛选小鼠PIAS2相互作用蛋白

目的:应用酵母双杂交技术,从小鼠精原细胞cDNA文库中筛选与PIAS2(protein inhibitor of activatedSTAT2,PIAS2)相互作用的未知蛋白。通过对其相互作用蛋白的筛选和研究,探讨PIAS2在精子发生中的作用机制,为临床男性不育症的治疗和诊断提供理论基础。方法:以pGBKT7-PIAS2为诱饵质粒,从小鼠精原细胞cDNA文库中筛选出与pGBKT7-PIAS2相互作用的阳性克隆,对验证后的阳性克隆进行测序及生物信息学分析,进一步采用直接酵母双杂交进行相互作用的验证。结果:经过筛选、测序、同源性分析及直接酵母双杂交验证,发现了与PIAS2相互作用的8个候选蛋白:Cyfip2、Psmb3、Nme1、nischarin、Nsun5、Ints10、Gnb2l1及Ndufaf3。结论:应用酵母双杂交系统,共筛选得到了8个不同的基因,其编码蛋白与PIAS2相互作用,可能与男性生殖调控相关。对上述蛋白与PIAS2的相互作用研究有助于揭示PIAS2的作用机制。     

丙型肝炎病毒 NS4A蛋白在胰腺细胞 cDNA文库中的结合蛋白基因的筛选

目的:从人胰腺细胞cDNA文库中筛选出与丙型肝炎病毒(HCV)NS4A蛋白存在相关作用并且参与糖、脂类代谢过程的结合蛋白,为研究HCV影响糖、脂类代谢的分子生物学机制提供实验依据.方法:构建pGBKT7-NS4A作为诱饵质粒,转化酵母菌株AH109,用SD/-Trp筛选阳性菌落.配合两种重组酵母菌株AH109与Y187...     

肾癌中原癌基因EphB4及其蛋白表达的研究

目的：研究人肾癌组织中EphB4基因及其蛋白的表达及其在肾癌发生、发展中的作用和临床意义。方法：取液氮保存的原发性肾癌新鲜标本40例,相应癌旁组织（阴性切缘）40例,正常肾脏组织30例,采用半定量逆转录PCR（RTPCR）和免疫组化SP法检测EphB4基因及其蛋白表达水平,并结合临床病理资料进行分析。结果：EphB4基因在肾癌组织和癌旁组织中都表达,且癌旁表达低于肿瘤表达,差异有统计意义（P〈0．05）;正常肾脏组织不表达（P〈0．01）;40例肾癌标本中,25例EphB4蛋白表达阳性,阳性率为62．5％,40癌旁组织中,10例EphB4蛋白表达阳性,阳性率为25．0％;两者有显著差异性（P〈0．05）。EphB4蛋白的表达与患者的性别、年龄无关（P〉0．05）,但与肿瘤浸润深度、肿瘤分化程度、淋巴结转移密切相关（P〈0．05）。结论：原癌基因EphB4及其蛋白在人肾癌组织中过度表达,且与肾癌的发生,发展相关,可能成为肾癌预后的侯选标志物之一。     

重组人骨形成蛋白4基因腺相关病毒载体的构建

目的 构建重组人骨形成蛋白4（human bone morphogenetie protein4，hBMP-4）基因腺相关病毒载体。方法 根据hBMP4的基因序列设计引物，上游引入EcoRⅠ位点，下游引入Sal Ⅰ位点，以EX-A0242M01hBMP4为模板扩增目的基因。将hBMP-4基因克隆入pUC18载体中，获得重组质粒pUCl8hBMP-4。然后用EcoRⅠ与Sal Ⅰ酶切pUC18-hBMP-4及质粒pSNAV，回收酶切片段，T4DNA连接酶16C过夜，转化大肠杆菌DH5a感受肽细胞，筛选阳性克隆获得pSNAV-hBMP-4，EcoRⅠ／SalⅡ双酶切鉴定，并行全基因测序。转染BHK21细胞，G418筛选培养，获得抗药克隆细胞株。HsV1-rc／△UL2感染，包装此细胞株并收获病毒载体AAV-hBMP-4。行DNA点杂交法测定病毒滴度，SDS-PAGE分析判断病毒纯度。结果 PCR电泳及酶切鉴定表明，pSNAV-hBMP-4重组成功，基因测序显示装入pSNAV质粒中的hBMP-4基因正确；AAV-hBMP-4病毒的大致滴度为1．5×10^12μg／ml，分泌蛋白浓度为0．124mg／ml，病毒载体纯度在95％以上。结论 实验获得的病毒载体滴度高、感染性好，可以满足骨组织工程的需要。     

肾癌酵母双杂交文库的构建及其意义

目的　研究肾癌中的信号传导尤其是Wnt/Frizzled信号通路在肾癌发生、发展中的作用 ,寻找具有生物意义的小肽 ,构建肾癌的酵母双杂交文库。　方法　提取肾癌组织的mRNA ,逆转录合成cDNA ,SalI/NotI酶切后基因重组法定向克隆于穿梭质粒pPC86中 ,转化DH5α菌后扩增。　结果　文库大小为 6× 10 6,SalI/NotI酶切鉴定 ,插入cDNA片段多为 1～ 3kb。　结论　肾癌pPC86酵母双杂交文库的构建成功为研究肾癌发生机理、诊断和治疗 ,尤其是信号分子通路治疗提供了有效的工具。     

Wnt信号通路调控因子Pygo2在人肾癌组织中的表达及意义

目的 研究Wnt信号通路调控因子Pygo2在肾癌组织中的表达及意义. 方法 经病理检查确诊为肾透明细胞癌组织标本42例.肿瘤直径1.2～15.5 cm,平均7.2 cm;其中＜4.0 cm7例,4.0～7.0 cm9例,＞7.0 cm 26例.Fuhrman分级:Ⅰ级6例,Ⅱ级17例,Ⅲ级17例,Ⅳ级2例.AJCC TNM分期:Ⅰ期16例,Ⅱ期7例,Ⅲ期7例,Ⅳ期12例.采用RFQ-PCR及免疫组织化学SP法检测Pygo2在肾癌组织及癌旁正常肾脏组织中的表达.统计学分析癌旁正常肾组织与肾癌组织、肾癌组织各组内的表达差异情况. 结果 肾癌组织与癌旁组织中Pygo2 mRNA表达量分别为2.88±1.26及1.00 +0.00,蛋白表达量分别为45.53+ 24.54及11.02+1.39,组间差异均有统计学意义(P ＜0.0001).肾癌组织中Pygo2表达与病理分级、临床分期密切相关,特别是与有无淋巴结转移密切相关(P ＜0.0001),而与性别、年龄无关(P＞0.05). 结论 Pygo2在病理高分级、临床高分期、发生淋巴结转移的肾癌组织中高表达,提示可能在肾癌发生发展过程中具有重要作用.     

肾癌组织消减文库的构建与肾癌特异表达基因克隆

目的 构建人肾癌组织与正常肾组织差异表达的cDNA消减文库,从文中克隆鉴定出肾癌特异性表达的基因奠定基础。方法 应用抑制性消减杂交技术,分别从肾癌及正常肾组织中提取poly(A) RNA;依次合成单链及双链cDNA,分别与2种不同的接头衔接,再与正常肾cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性PCR;将产物T／A载体连接接构建成功cDNA消减文库。结果 构成功具有高消减效率的人肾癌组织cDNA消减文库,文库扩增后得到350个阳性克隆,其中95％克隆均含50－400bp插入片段。结论 应用抑制性消减杂交技术所构建的人肾癌组织cDNA消减文库为进一步大批量筛选、克隆肾癌特异性表达的基因奠定了基础。     

Wnt信号通路在骨稳态中的作用

人体内的骨稳态是由骨形成和骨吸收活动组成的动态平衡过程.骨稳态的失衡和功能障碍是包括骨质疏松症和骨硬化症在内的多种骨骼疾病的基础.以往研究证实Wnt、BMP、PTH/PTHrP、Notch和Hedgehog等信号通路参与调控成骨细胞/破骨细胞功能及骨稳态的平衡,其中Wnt信号通路的作用尤为关键和重要.本综述以此为切入点...     

肾癌特异性配体多肽ZT-2筛选及新标志物的研究

目的 寻找肾癌早期诊断和靶向治疗的标志物. 方法 以肾癌细胞株A498为靶细胞,正常肾细胞株HK-2为吸附细胞,37℃下对噬菌体十二肽库进行4轮减性筛选.挑取单克隆采用ELISA方法 初步鉴定噬菌体克隆亲和力;阳性克隆提取质粒,测序后合成多肽,鉴定多肽的亲和力及特异性.结果 经ELISA初步鉴定,随机挑选20个单克隆中,2号多肽对A498细胞亲和力最高(A_(ZT-2)/A_(对照)比值为3.15),命名为Phage-ZT-2.细胞免疫荧光试验证明,合成的相应多肽FITC-ZT-2对A498细胞具有特异性结合.利用荧光标记的ZT-2检测肾癌组织芯片,肾癌组织ZT-2的荧光吸光度(A)值为0.453±0.123,正常组织及非肾癌炎性组织为0.148±0.075,2组间比较差异有统计学意义(t=2.776,P<0.01).结论 成功筛选出与肾癌细胞特异性结合的多肽ZT-2,为肾癌的早期诊断和靶向治疗提供了实验依据.     

Wnt信号调控骨髓源巨噬细胞参与肾脏纤维化的作用及机制

目的观察转化生长因子β1(TGF-β1)对骨髓来源巨噬细胞(BMDM)的影响,探讨Wnt信号调控该过程的作用与机制。 方法无菌分离获取小鼠BMDM,以集落刺激因子(M-CSF)作为刺激因素,于37℃、5%CO₂培养箱中培养7d,倒置相差显微镜观察细胞形态改变,流式细胞仪鉴定BMDM纯度。后以TGF-β1作为干预因素,分别设立对照组(A组：a-MEM高糖培养基＋M-CSF)、实验组(B组：a-MEM高糖培养基＋M-CSF＋TGF-β1),M-CSF浓度为60 ng/ml,TGF-β1浓度为5 ng/ml。以α-SMA作为肌成纤维细胞表面标志物,以F4/80作为巨噬细胞表面标志物,3 d后流式检测α-SMA^＋F4/80^＋细胞比例、Western blot测定各组Wnt3a、DVL(dishevelled蛋白)、β-catenin蛋白的表达。应用SPSS 19.0统计软件进行数据处理。 结果M-CSF刺激骨髓细胞7 d后流式检测BMDM比例最高,纯度达(94.44±6.11)%。以M-CSF诱导7d为分组时间点,与对照组相比较,3 d后实验组α-SMA^＋F4/80^＋细胞比例明显升高(t＝6.365,P＝0.0007),Wnt3a、DVL、β-catenin的蛋白表达也显著增高(t_Wnt3a＝12.06,P<0.0001;t_DVL＝8.168,P＝0.0002,t_β-catenin＝6.752,P＝0.0005)。 结论TGF-β1可刺激BMDM向肌成纤维细胞转化;Wnt信号通路可能参与调控BMDM的纤维化过程;通过降低巨噬细胞Wnt信号通路的活性可能成为延缓纤维化发生的潜在治疗思路。     

Wnt/Frizzled信号通路靶基因C-myc在肾癌中的生物学意义

目的 探讨Ｃ－ｍｙｃ基因作为Ｗｎｔ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ信号通路靶基因在肾癌生物学行为中的表达极其意义。方法 采用细胞核蛋白印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ）、免疫组化及免疫细胞化学Ｃ－ｍｙｃ蛋白半定量分析方法，对３２例肾癌组织及肾癌细胞株ＧＲＣ－Ｉ、ＲＣＣ－９４９进行了研究。结果 Ｃ－ｍｙｃ蛋白半定量分析方法，对３２例肾癌组织及肾癌细胞株ＧＲＣ－Ｉ、ＲＣＣ－９４９进行了研究。结果 Ｃ－ｍｙｃ在肾癌组织     

miR-204通过Wnt信号通路对骨质疏松症小鼠成骨细胞增殖的影响及机制分析

目的探讨miR-204通过Wnt信号通路对骨质疏松症小鼠成骨细胞增殖的影响及机制分析。方法雌性昆明小鼠分为:对照组、假手术组和骨质疏松症组,采用双侧卵巢切除法建立去卵巢骨质疏松小鼠模型并进行鉴定;提取小鼠原代成骨细胞并鉴定;细胞转染并检测miR-204的表达水平;MTT检测各组细胞活力;各组细胞碱性磷酸酶(ALP)活性的检测;Transwell检测各组细胞的侵袭能力;细胞流式术检测各组细胞凋亡情况;细胞流式术检测各组细胞Caspase-3活性;双荧光素酶报告基因检测miR-204和β-catenin、LRP-5间的相互作用;Western blot检测Wnt信号通路相关蛋白表达情况。结果骨质疏松症组小鼠骨密度较对照组和假手术组明显降低(P=0.007,P=0.057),表明骨质疏松症小鼠造模成功。miR-204的表达水平在miR-204模拟物组明显提高(P=0.072),在miR-204抑制剂组下降(P=0.031);miR-204模拟物组成骨细胞活力和ALP活性提高(P=0.007,P=0.043),miR-204抑制剂组成骨细胞活力和ALP活性下降(P=0.007,P=0.035);miR-204模拟物组成骨细胞的侵袭能力明显增强(P=0.006),miR-204抑制剂组成骨细胞的侵袭能力下降(P=0.036);miR-204模拟物组成骨细胞的凋亡能力和Caspase-3活性下降(P=0.041,P=0.045),miR-204抑制剂组成骨细胞的凋亡能力和Caspase-3活性增强(P=0.005,P=0.039);miR-204与β-catenin、LRP-5之间有靶向关系;miR-204模拟物组成骨细胞中β-catenin和LRP-5蛋白表达均上调(P=0.043,P=0.009),miR-204抑制剂组成骨细胞中β-catenin和LRP-5蛋白表达均下调(P=0.041,P=0.032)。结论miR-204可能促进成骨细胞的增殖,激活Wnt信号通路,对骨质疏松症有一定的保护作用。     

Wnt信号途径在不同性质乳腺组织和细胞中的表达与分布

目的 探讨乳腺癌发生发展中Wnt信号途径的改变及其关机制.方法 用基因芯片和荧光实时定量聚合酶链反应(PCR)技术检测5例乳腺癌患者不同性质乳腺组织和细胞中Wnt信号途径相关基因的表达.结果 与正常乳腺组织比较,癌组织中Frizzled 3、Lrp5、Lrp6、Wnt9a、Wnt10a表达分别上调了8.11、10.28、9.37、15.47、19.63倍(发生频率均≥60%),DDK1、DDK4、WIF1表达分别下调了10.87、9.62、12.05倍(发生频率均≥60%);其中Wnt9a、Wnt10a以及DDK1、DDK4、WIF1表达的改变主要在癌源性成纤维细胞,分别上调40.88、61.59倍和下调38.46、19.61、29.41倍(P<0.01);Frizzled 3、Lrp5、Lrp6表达改变主要在乳腺癌千细胞,分别上调了27.36、31.41、21.25倍(P<0.01).结论 在乳腺癌发生发展过程中,成纤维细胞源性因子Wntga、Wnt10a和DDK1、DDK4、WIF1的改变参与了Wnt信号途径的异常,并主要影响乳腺癌干细胞的自我更新调控.