HLA—DRB1基因与IgA肾病关联性的研究

目的：探讨HLA—DRB1等位基因与山西汉族IgA肾病的关联性。方法：用聚合酶链反应序列特异性探针（PCR—SSO）法，对30例IgA肾病患者和45例正常对照者进行了HLA—DRB1等位基因分型。结果：IgA肾病组的HLA—DRB1＊15基因频率明显较正常对照低（5.00％ vs 17.78％，P=0．021，OR=0．243，95％CI：0．068，0.876），IgA肾病组的HLA—DRB1＊04基因频率明显较正常对照高（30．00％ vs 15．56％，P=0．034，OR=2．327，95％CI：1.052，5．145）。结论：HLA—DRB1＊15可能与山西IgA肾病的抵抗性有关，HLA—DRB1＊04可能与山西IgA肾病的易感性有关。     

DNA芯片技术检测HLA-DR1,DR51组基因型

目的 采用DNA芯片技术对HLA—DRl，DR51组基因分型。方法 根据编码HLA—DR1，DR51组抗原等位基因序列设计特异分型探针，制作DNA分型芯片。通过组间特异引物扩增基因组相应区段DNA，扩增中用Cy5-dCTP荧光标记，扩增标记后的产物与芯片探针杂交，通过杂交产生的荧光信号及分布格局确定样品基因亚型。分型结果用标准DNA和PCR—SSO验证。结果130份样本共检出HLA-DR1，DR51组位点34个，包括18个：DR15，8个DR16，6个：DR10，2个DR1，无假阳性或假阴性，准确率和重复率均达100％。检测总耗时约3．5h。结论 DNA芯片用于HLA-DR1、DR51组基因分型具有高分辨度、高特异性和简单快速的优点，适于器官移植临床应用。     

高分辨率HLA-DRB基因型分析方法的研究

目的 采用焦磷酸微测序技术，建立一种高通量、高分辨率的HLA-DRB基因型分析新方法，为临床应用提供依据。方法 对HLA-DRB外显子2DNA序列进行同源性分析，设计PCR引物，提取健康人外周血淋巴细胞基因组DNA，PCR扩增外显子2基因片段，克隆构建含有外显子2的重组质粒pMD／DRB3＊02023。扩增产物经链亲和素包被磁珠纯化、变性、分离制备单链DNA测序模板，采用PSQ96焦磷酸测序仪进行实时测序，分析判断HLA-DRB基因型。结果 扩增并克隆了HLA-DRB外显子2，焦磷酸微测序结果与克隆质粒常规测序结果比较，测序正确，与HLA数据库基因序列比较，可准确进行HLA-DRB基因型分析。采用重组质粒pMD／DRB3＊02023和pMD／DRBl＊0405等比例混合模拟杂合子基因型，焦磷酸微测序分析获得预期结果。结论焦磷酸微测序技术应用于HLA-DRB基因型分析具有高分辨率和快速等优点，可有效分析杂合子基因型，该新方法有望应用于器官及骨髓移植的供体／受体筛查。     

MHC捕获测序探寻慢性肾功能衰竭的致病基因

目的 研究慢性肾功能衰竭患者人类白细胞抗原(HLA)基因,以获得慢性肾功能衰竭的致病突变.方法 使用新的MHC捕获技术结合新一代高通量测序技术对15例慢性肾功能衰竭患者和15名健康对照的HLA区域基因进行捕获测序.结果 慢性肾功能衰竭的致病与HLA-A* 02∶01∶01、B*15∶01∶01和DRB1* 09∶01∶02关联,且这三个基因相互独立与慢性肾功能衰竭关联.结论 HLA-A*02∶01∶01、B* 15∶01∶01和DRB1* 09∶01∶02与慢性肾功能衰竭相关.采用MHC基因捕获技术结合下一代高通量测序技术研究慢性肾功能衰竭的基因易感性是可行的.     

HLA-I类PCR-SSP基因分型在异基因造血干细胞移植中的应用

目的：提高异基因造血干细胞移植供、受者HLA－I类配型的精确度,有效防止移植物抗宿主病（GVHD）的发生。方法 采用准确、简便的DNA、RNA提取方法和HLA－I类PCR－SSP基因分型方法。建立HLA－A33、A68、B40、B13 PCR－SSP分型方法以及HLA基因序列测序分析。结果：对300例中清学难以判断结果的30例临床标本进行基因水平的研究发现,DNA及RNA提取方法可以满足此项研究对样本的要求。HLA－I类PCR－SSP分型方法具有良好的稳定性、可靠性和特异性;重复率达100％。同时,HLA－A33、A68、B40、B13结果与HLA－I类PCR－SSP分型结果一致。HLA基因测序分析进一步肯定了HLA－I类PCR－SSP分型的特异性。HLA－I类PCR－SSP不受某些血清学影响因素的干扰。整个实验过程仅耗时2．5h。结论：HLA－I类PCR－SSP基因分型方法准确、特异、重复性好,可作为临床骨髓移植配型和正常人群无关供者筛选的常规方法,对GVHD的发生必将起到重要的预防作用。     

人类白细胞抗原-DRB1基因多态性与山西省家族性乙型肝炎预后的相关性研究

目的探讨人类白细胞抗原（human lymphoeyte antigen,HLA）-DRB1等位基因多态性与山西省家族性乙型肝炎临床转归及乙型肝炎病毒（HBV）复制状态的相关性。方法采用前瞻性临床流行病学研究方法,以山西省家族性乙型肝炎家庭中的295位成员为研究对象,将其分为健康对照组、慢性无症状携带（ASC）组、慢性乙型肝炎（CHB）组及肝硬化组。采用聚合酶链反应．序列特异性寡核苷酸探针技术（polymerase chain reaction—sequence specific oligonucleotide probe,PCR—SSOP）结合荧光磁珠流式检测技术,进行HLA—DRB1等位基因检测。采用,检验或Fisher’s确切概率计算法比较HLA—DRB1各等位基因频率在各组间以及在HBV DNA不同载量下的分布情况,组间计量资料比较采用方差分析,相关疾病的等位基因风险率以相对危险系数（RR）表示。结果HLA—DRB＊04基因频率在健康对照组为0．159,明显高于ASC组（0．069）和CHB组（0．079）,差异具有统计学意义（χ^2分别为4．892和4．072,P值均〈0．05）;HLA—DRB1＊07等位基因在CHB组和肝硬化组的频率分别为0．131和0．154,明显高于健康对照组（0．049）,差异具有统计学意义（χ^2值分别为4．140和5．529,P值均〈0．05）;HLA—DRB1＊13等位基因频率在健康对照组为0．037,高于CHB组（0）,2组比较差异具有统计学意义（χ^2=3．316,P〈0．05）。HLA—DRB1＊15等位基因频率在ASC组为0．206,在肝硬化组为0．115,2组比较差异具有统计学意义（χ^2=4．287,P〈0．05）。其他各等位基因频率在各组间差异无统计学意义。患者年龄在ASC、CHB及肝硬化3组间的差异有统计学意义（F=33．38,P〈0．01）;HBV DNA阳性组的HLA—DRB1＊07基因频率（0．167）高于HBV DNA阴性组（0．096）（χ^2=5．268,P=0．002）。结论HLA—DRB1＊07与家族性HBV易感性有关,可能是山西省家族性乙型肝炎易感基因或连锁基因。HLA—DRBI＊04及HLA—DRB1＊13与家族性乙型肝炎抗性相关,可能是山西省家族性乙型肝炎抗性基因。     

HLA-Ⅰ、Ⅱ类PCR-SSP基因分型在肾移植配型及亲子鉴定中的应用

目的：建立快速、准确的HLA基因分型方法,满足临床移植配型的需要。方法：对21对已进行HLA抗原血清学分型的肾移植的供、受者,12例亲子鉴定应用聚合酶链反应－序列特异引物（PCR－SSP）进行HLA－I、Ⅱ类基因A、B、DRB、DQB1位点扩增,琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物并确定其基因型。结果：基因分型结果与血清学分型一致者有18对,基因分型能明确判断而血清学分型无法判断者有3对;排除亲子关系的有两例。结论：PCR－SSP方法具有操作简单、快速、结果可靠的特点,不仅适用于移植配型、法医学亲子鉴定和个人识别,也可用于相关疾病及人类遗传学的研究。     

人血管内皮生长因子C基因真核表达载体的构建

目的：VEGF—C基因的真核表达载体，以便进一步研究VEGF—C基因在淋巴管生成中的作用。方法：根据人VEGF—C的cDNA序列，设计合成一对5’端分别含有EcoRI和BamH I酶切位点的特异性引物，运用RT—RCR方法扩塔人乳腺癌细胞MDA—MB－231中的VEGF—C cDNA(1.26kb)；回收PCR产物(1．28kb)，并将其连接至克隆载体pUMT—18中，重组的pUMT—18在大肠杆菌DH5α内扩增后，经质粒提取、EcoR I和BamH I酶切，筛选出阳性重组子，并进行基因测序鉴定；琼脂糖凝胶电泳回收含有VEGF—C cDNA全长的酶切片断(1．27kb)，然后在DNA连接酶作用下将其与真核表达载体pcDNA3．1（－)连接，重组质粒经EcoR I和BamH I酶切予以鉴定。结果：RT—PCR产物自有VEGF-C cDNA，基因测序显示重组的pUMT—18中自有正确的人VEGF—C cDNA全长序列，重组的pcDNA3．1(-)中含有人VEGF—C cDNA全长序列。结论：VEGP—C/pcDNA3．1(－)。     

多聚酶链反应寡聚核苷酸探针反向杂交在HLAⅠ类抗原分型中的应用

目的比较多聚酶链反应寡聚核苷酸探针（PCR—SSOP）技术与血清学方法对HLAⅠ类抗原A、B分型的准确性及分型精度。方法选取25例曾行血清学HLA-A、B分型的肾移植受者血标本行PCR—SSOP反向杂交法HLA—A、B分型。结果25例PCR—SSOP法HLA—A抗原分型均成功，检出A位点等位基因总数46个，单一位点4例，杂合子21例；检出B位点等位基因总数47个，单一位点3例，杂合子22例。血清学方法检出A抗原单一位点7例，其中2例经PCR—SSOP证实存在第2个位点，血清学A位点总误差率为12％；B抗原单一位点6例，1例PCR-SSOP证实存在第2个位点血清学B位点总误差率为8％。结论PCR—SSOP反向杂交法能对HLA—Ⅰ类抗原行中等分辨度进行等位基因分型，操作简单，分辨度及灵敏度高，结果解读客观。     

采用核转染技术建立稳定表达可溶性人类白细胞抗原G1的真核细胞系

目的 建立稳定表达可溶性人类白细胞抗原G1（soluble human leucocyte antigen G1，sHLA—G1）的真核细胞系。方法 采用核转染技术将质粒pcDNA3一sHLA—G1转入不表达HLA—1类分子的LCL721．221细胞，经G418筛选获得稳定转染细胞，通过RT—PCR及Dot—ELISA在基因和蛋白水平鉴定目的基因的表达。结果 采用核转染法LCL721．221细胞转染效率可以达到约14％。RT—PCR检测发现了sHLA—G1基因特异性条带；采用Dot—ELISA方法利用sHLA—G1特异性抗体MEM—G／9检测，存在sHLA—G1蛋白。结论 通过核转染方法成功建立了稳定表达sHLA—G1的真核细胞系。