白细胞介素—12信号转导参与小鼠肾小管上皮细胞炎性损伤

为观察白细胞介素-12（IL-12）在小鼠肾小管上皮细胞（TEC）炎症损伤的信号传递,以培养的正常小鼠TEC作为空白对照组,狼疮肾炎（LN）TEC作为实验组,以IL-12（10μg/L)刺激5min,利用放射自显影检测发现正常对照及LN组lck活性增强,后者更明显,应用lck抑制剂PP1后其活性消失。再以等浓度IL-12刺激TEC15min,采用免疫印迹观察到LN组P38磷酸化强于正常对照组,应用PP1或P38抑制剂SB203580则不发生P38磷酸化。给予IL-12刺激时发现LN组c-Jun基因表达水平强于正常对照组,应用PP1或SB203580后则未有c-Jun基因表达,提示IL-12可通过lck/P38/c-Jun信号途径参与对狼疮小鼠TEC的炎症损伤。     

白细胞介素2对淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶在肾小管上皮细胞中表达的影响

目的：探讨IL-2对肾小管上皮细胞中淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（Lck） mRNA及蛋白表达的影响以及Lck在狼疮肾炎中的致病作用.方法：采用BALB/c小鼠及BXSB狼疮小鼠肾小管上皮细胞为实验对象,分别给予 IL-2（100 U/ml）刺激.应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测肾小管上皮细胞Lck mRNA的表达,免疫印迹法检测Lck蛋白的表达,比较IL-2刺激前后Lck mRNA及蛋白表达水平的变化.结果：正常BALB/c小鼠及BXSB狼疮小鼠肾小管上皮细胞中仅有微量Lck mRNA及蛋白表达,经IL-2刺激后二者的Lck mRNA及蛋白表达水平均有增加,以狼疮小鼠肾小管上皮细胞增加更为显著.结论：（1）肾小管上皮细胞中有Lck基因的表达.（2）肾小管上皮细胞经IL-2刺激后Lck mRNA及蛋白表达水平增加,提示IL-2可活化肾小管上皮细胞诱导Lck表达,进而可能通过一系列信号传导作用,发挥生物学作用.相对于BALB/c小鼠,狼疮小鼠肾小管上皮细胞在IL-2刺激后Lck表达更明显,提示狼疮小鼠肾小管上皮细胞可能更易激活.（3）由于Lck在狼疮肾炎小鼠肾小管上皮细胞中异常表达,推测Lck可能作为细胞因子或炎症因子的重要信号分子,促进狼疮肾炎的发生.     

系统性斑狼疮小鼠脾细胞中IL—12信号传递途径的研究

目的 探讨在狼疮小鼠脾细胞中是否存在IL-12通过Lck/p38/c-jun传递信号及其对脾细胞的影响。方法 以慢性移植物抗宿主病（graft versus host disease,CVHD)小鼠为狼疮小鼠模型。分别采用放射自显影、Western blot和Northern blot，检测培养的脾细胞中Lck的活性、p38磷酸化活化及c-jun基因表达的变化。结果 狼疮小鼠脾细胞经IL-12刺激后，与正常对照组相比较，Lck抑制剂PP1组Lck的活性及p38磷酸化消失，无c-jun基因的表达；加入p38抑制剂SB203580组亦无p38磷酸化及c-jun基因的表达。结果 狼疮小鼠的脾细胞异常，IL-12可通过Lck/p38/c-jun在细胞内传递信号，直接参考免疫损伤。     

系统性红斑狼疮小鼠脾细胞中IL-12信号传递途径的研究

目的探讨在狼疮小鼠脾细胞中是否存在IL-12通过Lck/p38/c-jun传递信号及其对脾细胞的影响。方法以慢性移植物抗宿主病(graft versus host disease,GVHD)小鼠为狼疮小鼠模型,分别采用放射自显影、Western blot和Northern blot,检测培养的脾细胞中Lck的活性、p38磷酸化活化及c-jun基因表达的变化。结果狼疮小鼠脾细胞经IL-12刺激后,与正常对照组相比较,Lck的活性增高、p38异常活化,c-junmRNA的水平增高。加入Lck抑制剂PP1组Lck的活性及p38磷酸化消失,无c-jun基因的表达;加入p38抑制剂SB203580组亦无p38磷酸化及c-jun基因的表达。结论狼疮小鼠的脾细胞异常,IL-12可通过Lck/p38/c-jun在细胞内传递信号,直接参与免疫损伤。     

C-KIT抑制剂对过敏性哮喘气道炎症反应的作用及机制探讨

目的研究C-KIT抑制剂对过敏性哮喘小鼠气道炎症的作用及机制。方法使用卵清蛋白(ovalbumin,OVA)构建过敏性哮喘小鼠模型,收集支气管肺泡灌洗细胞进行细胞定量和定性分析,使用IL-13处理细胞并检测细胞中内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ER)蛋白的表达和信号通路状态,处死小鼠后收集其肺部组织,通过免疫组化检测内质网应激标志物的表达,通过免疫印迹分析相关蛋白表达;通过RNA模拟物诱导肺上皮细胞中C-KIT的过表达,使用IL-13处理细胞并检测相关蛋白的表达。结果 OVA可以诱导野生小鼠气道炎症,促进杯状细胞增生,增加嗜酸性理细胞比例,促进内质网应激标志物的表达,而c-kit敲低/C-KIT抑制剂处理可以抑制OVA诱导的ER应激和炎症反应;体外实验显示,相对于敲除小鼠,野生小鼠肺部细胞中IL-13表达增加,从而促进PI3K/Akt/NF-κB的激活并诱导ER,c-kit敲低/C-KIT抑制剂处理可以抑制IL-13表达,并下调PI3K/Akt/NF-κB的激活。结论 C-KIT抑制剂能够通过抑制PI3K/AKT信号通路减轻IL-13诱导的内质网应激,从而起到治疗过敏性哮喘小鼠模型中的气道炎症的作用。     

白介素13通过FOXA2调控气道上皮细胞粘液分泌

目的:研究白介素13(Interleukin-13,IL-13)对气道上皮细胞粘液分泌的效应并探讨其作用机制。方法:HBE16细胞在无血清培养基中培养24小时后加入IL-13刺激24小时,ELISA检测粘蛋白(MUC)5AC的表达;Western检测磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(Extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)和磷酸化c-Jun氨基端激酶1/2(c-Jun N-terminal kinase 1/2,JNK1/2的表达;使用SP600125阻滞JNK信号通路后检测MUC5AC蛋白表达;RT-PCR检测STAT4和STAT6的表达变化;EMSA检测通路下游核蛋白FOXA2的表达。结果:IL-13刺激24小时后MUC5AC和p-JNK1/2表达升高,而p-ERK1/2表达无显著变化;使用SP600125阻断JNK通路表达后,MUC5AC表达减弱;IL-13刺激后STAT4表达无显著变化,STAT6表达显著升高,FOXA2表达显著降低。结论:IL-13通过JNK-STAT6-FOXA2通路调控粘液分泌。     

肾小管上皮细胞表达共刺激分子B7-DC并抑制CD4+T细胞活化

目的 探讨肾小管上皮细胞(TECs)表达B7-DC及其对T细胞活化的调节作用.方法 免疫组化检测肾穿刺标本B7-DC表达;流式细胞术分析人及小鼠肾小管上皮细胞B7-DC的表达变化;使用TECs/CD4 T共培养分析TECs表达的B7-DC对CD4 T细胞活化的影响.结果 慢性肾小球肾炎、狼疮性肾炎、小管间质性.肾炎等肾活检组织中发现B7-DC显著表达于肾小管.IFN-γ、TNF-a等炎症因子可诱导体外.肾小管上皮细胞表达137-DC.共培养试验发现阻断B7-DC信号可增强CD4 T细胞分泌细胞因子IFN-γ及IL-2并促进CD4 T细胞表达CD69.结论 肾小管上皮细胞表达B7-DC并可显著下调CD4 T细胞活化,在多种慢性肾脏疾病发展中可能发挥重要作用.     

IL-18对HK-2细胞E-钙黏蛋白表达的作用及其可能的胞内信号途径

目的:探讨白细胞介素-18(IL-18)是否通过核因子-κB(NF-κB)细胞内信号转导途径诱导近端肾小管上皮细胞转分化.方法:实验分单纯IL-18刺激组和SN50预孵育组, 单纯IL-18 刺激组采用终浓度分别为0、 1、 10、 100 μg/L的IL-18处理人肾小管上皮细胞株(HK-2细胞)72 h, SN50预孵育组在此基础上预先应用终浓度为100 mg/L的NF-κB特异性抑制剂 SN50预处理细胞0.5 h.然后应用免疫细胞化学法检测HK-2细胞E-cadherin的表达百分数;采用RT-PCR法检测HK-2细胞E-cadherin mRNA的表达.结果:NF-κB特异性抑制剂SN50可拮抗IL-18对HK-2细胞E-cadherin mRNA和蛋白表达的抑制作用.结论:IL-18可通过核因子-κB(NF-κB)细胞内信号转导途径诱导近端肾小管上皮细胞转分化.     

c-Jun氨基末端激酶选择性抑制剂对哮喘小鼠肺组织IL-8表达的影响

目的探讨c-Jun氨基末端激酶选择性抑制剂(SP600125)对哮喘小鼠肺组织白介素-8(IL-8)表达的影响。方法 30只BALB/c小鼠随机分为对照组、哮喘组和SP600125组,制作哮喘模型及干预处理后,处死小鼠,取肺组织,采用免疫组织化学方法和Western blot方法检测各组小鼠肺组织内IL-8的表达。结果免疫组化结果显示,哮喘组小鼠肺组织IL-8表达的平均光密度值为(0.75±0.12),显著高于对照组(0.25±0.03,p0.01),而SP600125组小鼠明显低于(0.44±0.06,p0.01)哮喘组。Western blot结果显示,哮喘组小鼠肺组织IL-8表达的平均光密度值为(0.51±0.08),显著高于对照组(0.15±0.02,p0.01);而SP600125组与哮喘组相比明显降低(0.29±0.04,p0.01)。结论 c-Jun氨基末端激酶选择性抑制剂能降低哮喘小鼠肺组织IL-8的表达。     

肺炎链球菌热休克蛋白40通过p38MAPK和JNK通路诱导小鼠巨噬细胞免疫应答

目的探讨肺炎链球菌热休克蛋白40(HSP40)引起小鼠巨噬细胞免疫应答的机制。方法表达、纯化重组HSP40蛋白(r HSP40),去除其中的脂多糖(LPS)。r HSP40处理C57BL/6野生小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)后,反转录PCR检测BMDM中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、IL-1β、IL-23p19、IL-12p40、IL-12p35、IL-10的mRNA水平,ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-12p40水平;r HSP40刺激后,ELISA检测野生型、Toll样受体2(TLR2)和TLR4缺陷的BMDM中TNF-α和IL-6的表达水平;丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制剂预处理BMDM后,ELISA检测其对r HSP40诱导TNF-α和IL-6水平的影响;Western blot法检测p38MAPK和c-Jun氨基末端激酶(JNK)磷酸化水平。结果获得纯度90%以上的r HSP40;r HSP40可显著增强p38MAPK、JNK的磷酸化水平和TNF-α、IL-6的表达;p38MAPK和JNK抑制剂可显著抑制TNF-α和IL-6的表达;与野生BMDM相比较,TLR4缺陷的BMDM表达TNF-α和IL-6显著降低。结论 HSP40诱导小鼠巨噬细胞产生免疫应答受JNK及p38MAPK信号通路调控,并且此过程依赖TLR4。     

IL—6在人骨髓瘤细胞U266中的信号转导途径与细胞增殖促进效应之间的关系

目的：研究人骨髓瘤细胞U266中IL－6信号转导途径激活与细胞增殖促进效应之间的关系。方法：首先分别采用MTT、凝胶阻滞电泳（electrwophoretic mobility shift assay, EMSA）和免疫沉淀（immunoprecipitation,IP）方法观察IL－6对U266细胞生长的影响及两条IL－6信号转导途径在U266细胞中的诱导激活状态;然后采用化学试剂处理或转基因方法观察信号途径活化状态变化与IL－6效应变化之间的关系。结果：IL－6可明显促进U266细胞增殖,并在不同剂量下诱导JAK／STAT和Ras/NF-IL-6途径活化;Ras途径活化被特异性上调和下调时,IL－6对U266细胞的生长促进效应分别得以增强和减弱;而JAK／STAT途径活化受抑时,IL－6的促细胞生长效应反而加强。结论：Ras途径的诱导激活介导了IL－6对U266细胞的增殖促进效应;而JAK／STAT途径活化介导了与IL－6促细胞增殖相反的生物学效应。     

Ras/NF-IL-6信号转导途径介导人骨髓瘤细胞KM-3中的IL-6生物学效应

目的　研究人骨髓瘤细胞KM 3中的IL 6信号转导途径与生物学效应之间的关系。方法　分别采用MTT、凝胶阻滞电泳 (electrophoreticmobilityshiftassay ,EMSA)、免疫沉淀方法检测IL 6对KM 3细胞生长状态的影响、参与IL 6信号传递功能的转录因子以及蛋白激酶在KM 3细胞中的诱导激活状态。结果　IL 6可明显促进KM 3细胞增殖 ,并可引发Ras/NF IL 6信号转导途径活化 ,但Jak/STAT信号途径没有激活。结论　Ras/NF IL 6信号转导途径介导了IL 6对KM 3细胞的生长促进作用     

cAMP对人骨髓瘤细胞的IL-6信号转导功能及细胞增殖的抑制作用

目的 研究ＰＫＡ途径激活（或胞内ｃＡＭＰ水平升高）后对人骨髓瘤细胞的ＩＬ－６信号转导功能及细胞生长的影响。方法 采用ＰＫＡ途径激动剂Ｆｏｓｋｏｌｉｎ（ＦＫ）和ｃＡＭＰ类似物８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ刺激人骨髓瘤细胞骨－Ｓｋｏ－００７,分别通过ＭＴＴ方法和凝胶阻滞电泳（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙ,ＥＭＳＡ）方法检测ＦＫ和８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ对Ｓｋｏ细胞的生长及其Ｉ     

结核分支杆菌培养上清诱导呼吸道上皮细胞IL-8表达

目的：观察呼吸道上皮细胞对结核杆菌产物产生的炎症反应，探讨炎症反应信号传递的机制。方法：制备结核分枝杆菌强毒力H37RV株培养上清，用培养上清刺激肺上皮细胞株SPC-A-1和A549，酶联免疫吸附实验检测细胞IL-8表达量。用突变MyD88表达重组质粒转染SPC-A-1细胞，观察MyD88与结核杆菌培养上清诱导上皮细胞炎症反应信号传递的关系。结果：结核分枝杆菌强毒力H37RV株培养上清明显增加SPC-A-1和A549细胞IL-8的表达。用突变MyD88表达重组质粒pcDNA3．1-MyD88转染SPC-A-1。结果显著抑制了结核杆菌培养上清对SPC-A-l细胞的炎症刺激作用。结论：结核杆菌培养上清能够诱导呼吸道上皮细胞IL-8表达，，Toll／IL-1受体信号通路及MyD88分子与细胞炎症反应的信号传递相关，提示在肺结核病发病过程中。结核杆菌的代谢产物可能刺激肺上皮细胞产生炎症细胞因子，参与肺结核炎症病变的形成。     

PD-L1 is expressed by human renal tubular epithelial cells and suppresses T cell cytokine synthesis

T cell activation is affected by both stimulatory and inhibitory co-signaling. MHC class II-expressing renal tubular epithelial cells (TEC) can function as APC for T cells. To study the influence of inhibitory ligands on TEC-mediated T cell activation, we examined the expression of programmed death ligand-1 (PD-L1) on human TEC line HK-2 cells, as well as in normal and diseased kidney samples. RT-PCR, FACS, and immunocytochemistry showed that PD-L1 is constitutively expressed on HK-2 cells, and is dramatically upregulated by IFN-gamma. In situ hybridization and immunohistochemical staining revealed constitutive low expression of PD-L1 on proximal tubules at both mRNA and protein levels in normal kidneys, but much higher expression in kidneys with type IV lupus nephritis. In vitro, pretreatment of IFN-gamma-stimulated HK-2 cells with anti-PD-L1 significantly enhanced IL-2 secretion from cocultured, mitogen-activated Jurkat or human peripheral blood T cells. These results suggest that the PD-L1:PD-1 pathway negatively regulates T cell activation by TEC, and may play an inhibitory role in TEC-mediated immune activation and immunopathology in the kidney.     

未知酪氨酸激酶对骨髓瘤细胞中IL—6诱导Ras／MAPK／NF—IL—6途径活化的调节作用

目的 研究两条主要的IL-6信号转导途径-JAK/STAT和Ras/MAPK/NFG-IL-6在人骨髓瘤细胞系KM-3中的诱导活化情况和调控机制。方法 首先分别采用凝胶阻滞电泳（EMSA）和免疫沉淀（IP）方法检测参与 IL-6信号转导功能的转录因子（STAT3、NF-IL-6）和蛋白激酶（JAK1、MAPK）在KM-3细胞中的诱导活化情况。然后采用特异性酢氨酸蛋白激酶 抑制剂Genistein作用于KM-3细胞,观察酢氨酸磷酸化作用对KM-3细胞中IL-6信号转导功能的影响。结果 IL-6刺激后,KM-3细胞中只出现了Ras/MAPK/NF-IL-6信号转导途径的诱导激活,而JAK/STAT途径则不参与IL-6在KM-3细胞中的信号转导功能。Gwenistein的作用可明显抑制Ras/MAPK/NF-IL-6途径的活化。结论 一种目前尚无法确定的非JAK1酪氨酸蛋白激酶可参与并调节Ras/MAPK/NF-IL-6信号转导途径在KM-3细胞中的诱导活化。     

STAT3反义表达载体的构建、稳定表达及对M1白血病细胞表型的影响

目的 探讨JAK／STATs通路在IL－6信号转导中的功能。方法 将含起始密码子在内的约1．2kbSTAT3cDNA反向插入到真核细胞表达载体pcDNA3中,采用电穿孔法重组质粒导入到M1小鼠急性髓系白血病细胞中,进行G418筛选。结果 G418筛选出抗性克隆后,基因组DNAPCR扩增表明STAT3反义基因片段已导入M1细胞中并在基因组中整合。STAT3反义RNA不影响M1细胞的生长动力学特征,但可显著拮抗IL－6诱导的STAT3激活,并拮抗IL－6对M1细胞的生长抑制效应。结论 STAT3反义RNA能够在M1细胞中稳定表达,成为进一步研究JAK／STATs途径功能的新模型。     

Both T cell receptor (TcR)-CD3 complex and CD2 increase the tyrosine kinase activity of p56lck. CD2 can mediate TcR-CD3-independent and CD45-dependent activation of p56lck.

T cell activation by triggering the T cell receptor (TcR)-CD3 complex leads to a dramatic increase in tyrosine phosphorylation of multiple cellular proteins. To date, there has been no direct evidence on the identity of the tyrosine kinase activity implicated in this signaling pathway. In this study, we demonstrate that activation of human T cells with anti-CD3 monoclonal antibody increases tyrosine kinase activity of p56lck. This extends our previous findings which demonstrated the involvement of p56lck kinase activity in the CD2 signal transduction pathway. The results from peripheral blood lymphocytes and Jurkat cell line showed in both cases an early and transient change in the specific activity of p56lck, followed by a shift to a higher apparent molecular mass. Therefore, to test directly the role of TcR-CD3 in CD2-induced activation of p56lck, we utilized mutant variants of the Jurkat cell line lacking in cell surface TcR-CD3. We found that cell surface expression of TcR-CD3 is not required for the activation of p56lck via CD2 but is necessary for the appearance of the reduced-electrophoretic-mobility form of p56lck observed after CD2 triggering. By isolating CD45- mutants from Jurkat cells, we observed that surface expression of the tyrosine phosphatase CD45 is required in order to increase p56lck activity following CD2 stimulation, while CD4-induced activation of the kinase remained unchanged. These data provide evidence for a specific functional linkage between CD2 and p56lck, in which CD45 may play an essential role.     

Sex steroid modulation of signal transduction in thymus epithelial cell culture

The mechanism of action of sex steroid hormones (SHs), androgen (A) or oestrogen (E), on the protein kinase C (PKC)-related signal transduction pathway was examined in culture of a rat thymus epithelial cell line (TEC; IT-45R1). The results were as follows: (a) proliferation of TEC in response to SHs is mediated by plasma membrane-associated signal pathways generated as a result of interactions between SHs and plasma-borne inhibitors; (b) the action of cyclins and cyclin-dependent families, such as cdc2/cdk2 kinases, play a key role in cell cycle progression in TEC; (c) the SH-induced ‘shutoff' effect on TEC cell proliferation is triggered by high doses of SHs. These results clearly suggest that ‘non-genomic' SH action is a crucial event for TEC proliferation, and that TEC proliferation is controlled by a ‘shutoff' mechanism triggered by high levels of SHs. The development of the TEC network in the thymus was discussed in relation to this ‘shutoff' mechanism.