高糖对体外培养兔视网膜Müller细胞AQP4表达的影响

目的：观察体外培养兔视网膜Müller细胞在高糖条件下水通道蛋白-4（AQP4）表达的变化。方法：采用体外培养的兔视网膜Müller 细胞,分为正常对照组及高糖组（葡萄糖浓度：30、40和50 mmol•L^-1）,分别培养1、3和5 d;采用免疫细胞化学、流式细胞术及RT-PCR方法对Müller 细胞AQP4的表达情况进行检测。结果：高糖组Müller 细胞AQP4表达的绿色荧光明显弱于正常对照组（P<0.01）;流式细胞仪检测中波峰位置明显提前,AQP4表达强度较对照组明显减弱（P<0.01）,且随着葡萄糖浓度的增高和作用时间的延长,AQP4表达强度逐渐减弱;血糖浓度50 mmol•L^-1培养3 d时,RT-PCR半定量分析显示,AQP4 mRNA的表达比对照组明显降低（P<0.01）。结论：高糖能降低视网膜Müller细胞AQP4的表达,且随着葡萄糖浓度的增高和作用时间的延长,AQP4的表达强度也逐渐减弱;高糖时AQP4的表达下降可能是机体对糖尿病视网膜病变的一种保护性反应。     

高糖对体外培养兔视网膜Müller细胞AQP4表达的影响

目的：观察体外培养兔视网膜Müller细胞在高糖条件下水通道蛋白-4（AQP4）表达的变化。方法：采用体外培养的兔视网膜Müller 细胞，分为正常对照组及高糖组（葡萄糖浓度：30、40和50 mmol•L^-1），分别培养1、3和5 d；采用免疫细胞化学、流式细胞术及RT-PCR方法对Müller 细胞AQP4的表达情况进行检测。结果：高糖组Müller 细胞AQP4表达的绿色荧光明显弱于正常对照组（P<0.01）；流式细胞仪检测中波峰位置明显提前，AQP4表达强度较对照组明显减弱（P<0.01），且随着葡萄糖浓度的增高和作用时间的延长，AQP4表达强度逐渐减弱；血糖浓度50 mmol•L^-1培养3 d时，RT-PCR半定量分析显示，AQP4 mRNA的表达比对照组明显降低（P<0.01）。结论：高糖能降低视网膜Müller细胞AQP4的表达，且随着葡萄糖浓度的增高和作用时间的延长，AQP4的表达强度也逐渐减弱；高糖时AQP4的表达下降可能是机体对糖尿病视网膜病变的一种保护性反应。     

高糖对体外培养兔视网膜Müller细胞表达血管内皮生长因子的影响

目的探讨高糖对体外培养兔视网膜Müller细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)的影响。方法体外培养兔视网膜Müller细胞,采用免疫细胞化学方法半定量检测不同浓度葡萄糖对视网膜Müller细胞表达VEGF的影响。结果高糖可以明显增加Müller细胞VEGF的表达,且具有一定的浓度依赖性。结论高糖促进体外培养兔视网膜Müller细胞VEGF的表达,提示高血糖作为糖尿病视网膜病变(DR)的始动因素,其可能机制之一为诱导Müller细胞VEGF的表达。     

糖基化终产物对视网膜Müller细胞表达碱性成纤维细胞生长因子的影响

目的 探讨糖基化终产物(AGEs)对体外培养兔视网膜Müller细胞表达碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的影响.方法 体外分离并培养兔视网膜Müller细胞.37℃条件下制备牛血清白蛋白AGEs(AGEs-BSA)及其对照物.应用AGEs-BSA及其对照物作用于Müller细胞,采用免疫细胞化学(ICC)方法半定量检测AGEs对视网膜Müller细胞表达bFGF的影响.结果 与对照组相比,AGEs作用下体外培养的兔视网膜Müller细胞bFGF的表达增高(P＜0.05或P＜0.01),且具有一定的时间和浓度依赖性.结论 AGEs可以上调Müller细胞表达bFGF,推测AGEs可能通过增加bFGF的表达从而加速糖尿病视网膜病变(DR)新生血管的形成.     

高糖条件下沉默LRP6通过Wnt/β-catenin途径抑制大鼠视网膜Müller细胞的自噬与凋亡

目的:探究在高糖作用下大鼠视网膜Müller细胞中低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)的表达及其对高糖条件诱导的Müller细胞自噬与凋亡的作用和机制。方法:体外培养大鼠视网膜Müller细胞,采用RT-PCR与Western blotting检测高糖条件下Müller细胞中LRP6 mRNA和蛋白的表达水平;利用siRNA干扰技术沉默Müller细胞中的LRP6,并分别在葡萄糖浓度为5.6 mmol·L^-1(NG)与35 mmol·L^-1的DMEM培养液(HG)中进行培养,按处理方式的不同将Müller细胞分为葡萄糖浓度为5.6 mmol·L^-1的DMEM培养的正常葡萄糖组(NG组)、葡萄糖浓度为35 mmol·L^-1的DMEM培养的转染si-NC组(HG+si-NC组)和si-LRP6的Müller细胞组(HG+si-LRP6组);采用Western blotting检测各组Müller细胞中自噬相关蛋白P62的表达、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ之值、Beclin1与Atg12-Atg5复合体的表达;共...     

高糖和缺氧对体外培养视网膜M üller细胞VEGF表达的影响

目的 :观察体外培养兔视网膜 Müller细胞在高糖和缺氧条件下血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的变化。方法 :采用免疫细胞化学、原位杂交和ELISA方法对高糖和缺氧条件下体外培养兔视网膜 Müller细胞 VEGF的表达进行定性定量测定。结果 :高糖能刺激 VEGF表达 ,且通过转录水平调节 ,这种调节呈时间和剂量依赖性。 Co Cl2 能造成 Müller细胞不完全缺氧 ,刺激 VEGF的分泌。结论 :Müller细胞在高糖、缺氧条件下 VEGF表达增强 ,VEGF表达水平的升高可能是高糖及缺氧条件下促进糖尿病视网膜病变的因素之一。     

糖尿病兔视网膜bFGF的表达及定位

目的：探讨糖尿病兔视网膜碱性成纤维生长因子(bFGF)的表达时期及bFGF表达增加与视网膜 Müller细胞的相关性。 方法：16只大耳白兔随机分为正常对照组及糖尿病组,建立糖尿病兔模型,饲养7周后,取材并通过激光共聚焦显微镜应用免疫荧光双重标记方法观察视网膜,对bFGF进行定位。 结果：正常对照组兔眼视网膜各层结构清晰,细胞排列紧密、整齐,细胞形态正常,GFAP免疫荧光标记,显现红色荧光的部位为兔视网膜Müller细胞。bFGF免疫荧光标记仅在毛细血管基底膜处呈现红色荧光;糖尿病组兔视网膜各层结构清晰,内核层、神经节细胞层细胞排列疏松,细胞间隙增大,细胞形态与正常对照组无明显差异,可见出血未见血管新生,bFGF 免疫荧光标记,视网膜各层细胞均见不同强度的红色荧光,GFAP及bFGF双重免疫荧光标记,视网膜可见黄色荧光。糖尿病兔模型的视网膜病变为BDR期;bFGF在BDR期表达增加;bFGF与GFAP共同表达于视网膜Müller细胞。 结论：bFGF在BDR期即开始在视网膜Müller细胞中表达。     

牛磺酸对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞凋亡的防护研究

目的 观察高糖培养条件及牛磺酸干预视网膜Müller细胞的凋亡变化,探讨牛磺酸对早期糖尿病视网膜Müller细胞的保护作用.方法 取出生后3 d的SD大鼠视网膜,分离纯化培养视网膜Müller细胞;经预实验选取25 mmol/L葡萄糖作为高糖培养条件,实验分为6组:正常组;高糖 0.1 mmol/L牛磺酸组;高糖 1 mmol/L牛磺酸组;高糖 5 mmol/L牛磺酸组;高糖 10 mmol/L牛磺酸组,用原位缺口末端标记法(TUNEL)法检测视网膜Müller细胞凋亡并观察牛磺酸的防护效应.结果 神经胶质酸性蛋白(glia1 fibrillary acid protein, GFAP)和S-100荧光双染鉴定纯化培养的视网膜Müller细胞均被双染;牛磺酸干预后TUNEL阳性细胞数量明显减少,并呈一定剂量的关系效应,1～10 mmol/L牛磺酸干预TUNEL阳性细胞显著低于高糖培养组(P＜0.01).结论 牛磺酸能够呈剂量依赖性地抑制高糖所致视网膜Müller细胞凋亡.     

高糖对体外培养兔视网膜Müller细胞表达血管内皮生长因子的影响

目的探讨高糖对体外培养兔视网膜Müller细胞表达血管内皮生长因子（VEGF）的影响。方法体外培养兔视网膜Müller细胞，采用免疫细胞化学方法半定量检测不同浓度葡萄糖对视网膜Müller细胞表达VEGF的影响。结果高糖可以明显增加Müller细胞VEGF的表达，且具有一定的浓度依赖性。结论高糖促进体外培养兔视网膜Müller细胞VEGF的表达，提示高血糖作为糖尿病视网膜病变（DR）的始动因素，其可能机制之一为诱导Müller细胞VEGF的表达。     

色素上皮衍生因子对高糖刺激下大鼠视网膜Müller细胞形态及活性的影响

目的检测色素上皮衍生因子(PEDF)对高糖刺激下体外培养SD大鼠视网膜Müller细胞形态及活性的影响,探讨PEDF对Müller细胞的保护作用。方法实验分为对照组、高糖模型(HG)组、PEDF干预高糖模型(HG+PEDF)组。采用反复胰蛋白酶消化法培养纯化SD大鼠视网膜Müller细胞,免疫荧光双标鉴定纯度,应用倒置相差显微镜、透射电子显微镜、CCK-8试剂盒、SOD试剂盒及MDA试剂盒检测各组Müller细胞形态与活性的改变及超氧化物歧化酶(SOD)活力与丙二醛(MDA)含量的变化。结果对照组、HG组、PEDF+HG组细胞吸光度分别为0.67±0.03、0.54±0.03、0.63±0.03,SOD活力分别为(196.69±22.15)、(153.42±15.54)、(180.32±16.47)U/mg prot,M DA含量分别为(2.11±0.43)、(2.86±0.33)、(2.40±0.28)nmol/mg prot。与对照组相比,HG组Müller细胞形态发生明显改变,细胞活性及SOD活力降低(P<0.01),M DA含量升高(P<0.01);与HG组相比,PEDF+HG组Müller细胞形态改变较小,细胞活性升高(P<0.01),SOD活力升高(P<0.05),MDA含量降低(P<0.05)。结论外源给予PEDF可显著减轻高糖所致的Müller细胞形态、活性的改变及细胞损伤,对Müller细胞具有显著的保护作用。     

Effect of taurine on GFAP and TauT expressions in rat retinal Müller cells in high glucose culture

Objective： To detect the expression of glial fibrillary acid protein （GFAP） and taurine transporter （TauT） in the retinal Müller cells in high glucose culture with taurine and to explore the influence of glucose on the taurine transporting, and the possible protective effects of taurine on MUller cells in early diabetic retinopathy. Methods： The Müller cells from the rat retina were cultured in high glucose, and GFAP and Taut expressions were detected in the cells treated with different doses of taurine by immuocytochemical fluorescein staining and Western blotting. Results： High glucose enhanced the expression of GFAP and decreased the expression of TauT in Müller cells. Taurine decreased the up-regulation of GFAP in the cells which was induced by high glucose; 0. 1-10 mmol/L taurine increased the expression of TauT in Müller cells. Conclusion： Taurine can inhibit the changes in Müller cell resulted from high glucose.     

花色苷对高糖高胰岛素培养下Müller细胞的保护

目的:观察高糖高胰岛素作用下Müller细胞的活性改变及花色苷对其的保护作用。方法:用50mmol/L葡萄糖和不同浓度胰岛素处理大鼠视网膜Müller细胞24h,分为高胰岛素组:3kU/L胰岛素;低胰岛素组:3U/L胰岛素;对照组:不含胰岛素。分别用121.1,22.8,0μmol/L花色苷对各组细胞进行保护。48h后用MTT法测定Müller细胞的活性。结果:高胰岛素(3kU/L)处理后Müller细胞活性降低(P<0.05),低胰岛素组(3U/L)则与对照组无显著性差异(P>0.05)。在低胰岛素和高胰岛素组中,经高浓度花色苷处理过的Müller细胞较未加入花色苷的Müller细胞活性提高(P<0.05),且与未经胰岛素处理的Müller细胞相比差异消失(P>0.05);而低浓度花色苷无此作用(P>0.05)。结论:高浓度胰岛素在短期内可使Müller细胞的活性降低,一定浓度的花色苷可恢复高胰岛素对Müller细胞活性的改变。     

兔视网膜Müller细胞原代培养

目的 :建立兔视网膜 Müller细胞原代培养的方法。方法 :组织块悬浮法培养兔视网膜Müller细胞 ,用电镜和免疫组织化学法对细胞进行鉴定。结果 :培养的细胞贴壁生长 ,呈长梭形 ,胞体肥大 ,胞浆丰富。电镜下可见特征性的中间丝 (直径 8～ 1 0 nm) ;免疫组织化学显示细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白 ( GFAP)和 S- 1 0 0阳性 ,八因子相关抗原阴性。结论 :组织块悬浮法培养兔视网膜Müller细胞是一种稳定、可靠的方法     

ATP与P2X7受体在Müller细胞激活导致视网膜神经节细胞株RGC-5凋亡中的作用研究

目的:探讨Müller细胞胶质化激活对RGC-5细胞的影响及ATP与P2X7受体在其中的相关作用?方法:纯化培养Müller细胞?RGC-5细胞株,免疫荧光进行细胞鉴定,并观察加入DHPG后Müller细胞的GFAP表达情况?荧光素酶法检测加入DHPG后Müller 细胞外ATP的含量变化;DHPG刺激后的培养液作为条件培养基加入RGC-5细胞株(RGC-5预先使用MPEP及MPMQ处理2 h),TUNEL法检测RGC-5凋亡情况,预先加入P2X7受体阻断剂亮蓝G(brilliant blue G,BBG)后检测RGC-5的凋亡情况?同时使用Western blot检测抗凋亡蛋白及促凋亡蛋白Bcl-2和Bax的变化情况?免疫荧光及Western blot检测RGC-5上P2X7受体的表达变化?结果:DHPG激活Müller 细胞后可以导致细胞外ATP的增加;激活的Müller 细胞条件培养基(conditioned medium,CM)可以导致RGC-5凋亡的明显增加?而BBG可以抑制RGC-5凋亡的增加,同时Western blot也显示与对照组相比CM显著降低RGC-5细胞上的Bcl-2蛋白水平,但增加了Bax的蛋白表达,而当预先加入BBG后再用CM处理则呈现相反的结果?另外Western blot及免疫荧光显示加入条件培养基后RGC-5细胞的P2X7受体蛋白表达增加?结论:Müller细胞的激活可以导致RGC-5细胞的凋亡,该现象可能与Müller细胞激活引起的ATP释放增加及RGC-5上P2X7受体有关?     

缺氧对Müller细胞水通道蛋白4及血管内皮生长因子的影响

目的:观察缺氧条件下,体外培养的人视网膜Müller细胞上水通道蛋白4(AQP4)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况。方法:酶消化法培养人视网膜Müller细胞,免疫荧光和透射电镜进行细胞鉴定,CoCl2诱导细胞缺氧,RT-PCR测定视网膜Müller细胞AQP4和VEGF基因的表达。结果:免疫荧光显示95%以上细胞谷氨酰胺合成酶、神经胶质纤维酸性蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、中间丝波形蛋白呈阳性。Müller细胞AQP4 mRNA和VEGFmRNA的表达在缺氧条件下均升高,VEGF更明显,且呈部分浓度和时间相关性。缺氧12 h时VEGF mRNA表达达高峰,24 h时AQP4 mRNA达高峰。结论:AQP4和VEGF均与缺氧时的细胞水肿有关,二者关系密切,VEGF的作用较早且强。     

羊膜对体外培养的兔视网膜Müller细胞增殖影响的实验研究

目的观察羊膜对体外培养的兔视网膜Müller细胞增殖能力的影响。方法（1）取第四代兔视网膜Müller细胞以3×10^4个／ml接种于96孔板,200μl／孔,24h后加入不同浓度羊膜匀浆条件培养基（800、400、200、100μg／ml）,培养24、48、96h后,用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测Müller细胞增殖率。（2）第四代兔视网膜Müller细胞以4×10^4个／ml密度接种于预置有盖玻片的6孔板中,24h后加入不同浓度的羊膜条件培养基,继续培养48h后,免疫组化细胞核增殖抗原（PCNA）检测。（3）4代兔视网膜Müller细胞以4×10^4个／ml接种于6孔板中,24h后加入不同浓度的羊膜条件培养基,继续培养48h,流式细胞仪观察细胞周期变化。结果随着条件培养基中羊膜匀浆浓度的增加,对兔视网膜Müller细胞的增殖效应逐渐增强,800μg／ml时获得最大增殖效应,细胞增殖率为62．5％;细胞周期分析显示：进入S期的细胞数明显增加（56．49％）。在羊膜匀浆浓度恒定条件下,随着时间延长,其对视网膜Müller细胞的增殖效应逐渐加强,在48h即达到较高的增殖效应,96与48h相比差异无统计学意义（F=0．233、0．007,P=0．492、0．729）。800μg／ml组和400μg／ml组PCNA阳性表达率（0．84±0．07;0．79±0．06）与对照组（0．54±0．12）相比差异具有统计学意义（x^2=-0．182、-0．151,P=0．002、0．015）。结论羊膜对体外培养的兔视网膜Müller细胞具有促进增殖作用,且呈浓度和时间依赖性。