大鼠早期肝纤维化α_1(Ⅰ)、α_1(Ⅲ)前胶原mRNA及相应胶原蛋白表达的初步研究

应用Northern杂交及免疫组化方法.观察CC1_4诱导的大鼠肝纤维化形成不同阶段α_1(Ⅰ)、α_1(Ⅲ)前胶原mRNA表达与相应Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白ColⅠ、ColⅢ及前Ⅲ型胶原端肽(PⅢP)表达间的变化规律及其相互关系。结果表明:①肝纤维化时α_1(Ⅰ)、α_1(Ⅲ)前胶原mRNA表达增强,早期以α_1(Ⅲ)mRNA为主;α_1(Ⅰ)及α_1(Ⅲ)前胶原mRNA均于3～4周时呈一过性下降。②Ito细胞是肝纤维化过程中产生Col Ⅰ、ColⅢ及PⅢP的主要来源,肝细胞亦具有一定的合成ColⅢ及PⅢP的能力。③应用Northern杂交技术检测前胶原mRNA表达,能从基因水平了解肝内胶原含量的变化,能更敏感地反映肝纤维化的倾向。     

α_1(Ⅰ)、α_2和α_1(Ⅲ)三股胶原肽链顺序的比较分析

含有α_1(Ⅰ)和α_2链的Ⅰ型胶原以及由α_1(Ⅲ)链组成的Ⅲ型胶原,其氨基酸顺序已经明了,其中α_1(Ⅰ)与α_2链之比为2:1。作肽链内部分析,α链分为四个D单位,每个D单位具有234个氨基酸残基的长度。除D单位之外,还可观察到其它周期,有D/3(78个残基)、D/6(39个残基)、D/11(21个残基)和D/13(18个残基),这些周期在α_1(Ⅰ)和α_1(Ⅲ)中尤其突出。D单位为功能性重复单位,由能相互作用的极性残基与疏     

内源性一氧化碳对低氧大鼠肺动脉胶原代谢的影响

探讨内源性一氧化碳 (CO)对低氧大鼠肺动脉胶原代谢的作用及其机制。采用常压低氧大鼠肺动脉高压模型 ,观察血红素加氧酶 (HO)抑制剂锌原卟啉 9(ZnPP 9)对肺动脉平均压 (PAMP)和肺组织匀浆碳氧血红蛋白 (Hb CO)含量的影响 ,并用免疫组织化学和核酸原位杂交法分别观察Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达和肺动脉Ⅲ型前胶原[Proα1 (Ⅲ )胶原 ]mRNA、间质性胶原酶 (MMP 1)mRNA、金属蛋白酶组织抑制因子 1(TIMP)mRNA表达的变化。结果发现ZnPP 9使低氧大鼠PAMP明显升高 ,肺组织匀浆CO含量明显降低 ;ZnPP 9显著促进低氧大鼠肺动脉Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达 (P <0 0 1)和Proα1 (Ⅲ )胶原mRNA表达及MMP 1mRNA与TIMP 1mRNA表达 (P <0 0 1)。内源性CO可能通过抑制胶原蛋白的合成对低氧大鼠肺动脉胶原代谢发挥重要的调节作用。     

胰岛素样生长因子-Ⅰ对人肾小管上皮细胞转分化及胶原合成的作用

目的探讨胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)在人肾小管上皮细胞转分化及胶原合成中的作用。方法将体外培养的人肾小管上皮细胞HK2分为2组(1)对照组;(2)IGF-Ⅰ组培养液中加入终浓度分别为25、50、100、200μg/L的IGF-Ⅰ。用倒置显微镜观察细胞形态变化,以RT-PCR检测HK2细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、胶原Ⅰα和胶原ⅢαmRNA表达的变化。ELISA方法检测培养上清中胶原Ⅰ的浓度。结果IGF-Ⅰ刺激使HK2细胞由椭圆形变为梭形。不同浓度的IGF-Ⅰ作用于HK2细胞48h后,α-SMA、胶原Ⅰα和胶原ⅢαmRNA水平显著升高(P<0.05);ELISA结果显示,100及200μg/LIGF-Ⅰ组中HK2细胞分泌的胶原Ⅰ显著增加(P<0.05)。结论IGF-Ⅰ在体外能够诱导人肾小管上皮细胞转分化,并促进其胶原的合成。     

二氧化硅对胶原mRNA改变的体外研究

矽肺是由于人体吸入大量游离二氧化硅(SiO_2,石英粉尘)而引起的肺组广泛纤维化疾病。肺组织中矽结节的形成导致肺正常功能障碍。在矽肺发生过程中,肺胶原蛋白蓄积,胶原类型相对比例亦发生改变。 本文使α_1(Ⅰ)、α_2(Ⅰ)及α_1(Ⅲ)胶原的cDNA探针,以加石英粉尘的人胚肺成纤维细胞的体外培养为模型,探讨了二氧化硅促进胶原蛋白含量上升的分子生物学基础。同时对参与纤维化的一些蛋白质因子如纤维粘连蛋白(Fibronectin,FN)及铜蓝蛋白(Celu-     

普伐他汀对人Ⅰ型胶原α 1(Ⅰ)链启动子活性调控的研究

目的研究普伐他汀人Ⅰ型胶原α1(Ⅰ)链启动子活性的调控,从转录水平上了解普伐他汀对Ⅰ型胶原合成的影响.方法大鼠胸主动脉平滑肌细胞原代、传代培养.构建含人α 1(Ⅰ)前胶原基因5'侧翼序列-2.5kb与报告基因氯霉素乙酰基转移酶(CAT)的重组体phCOL2.5,用FuGENE转染试剂瞬时转染平滑肌细胞,CAT-ELISA测定普伐他汀对重组体的作用.结果设对照组的CAT值为1,普伐他汀组的CAT值为0.62±0.04,普伐他汀能明显抑制Ⅰ型胶原α1(Ⅰ)启动子的活性.结论普伐他汀可以在转录水平上调节人α1(Ⅰ)前胶原基因表达.     

己克隆的人类DNA序列

本文收集了至1983年6月为止的有关已隆的人类DNA序列研究的原始资料。它们是:肌动蛋白,白蛋白,淀粉样蛋白A,抗血友病因子Ⅸ,抗凝血酶Ⅲ,α1-抗胰蛋白酶,脱脂蛋自A-1,脱脂蛋白E,精氨酸代琥珀酸合成酶,降钙素,绒膜促性腺激素a,绒膜促性腺激素β,绒膜生长催乳激素,前胶原,前-α(Ⅰ)胶原,前-α_2(Ⅰ)胶原,α_2(Ⅰ)胶原,补体因子B,补体C3,补体C4D,C-oncAEV-rel.(ERBA),C-one AEV(ERBB), C-onc AMV-rel.(MYB),C-onc AMV-rel.(MYC),C-oncBa CV-rel,C-onc Ba EV-rel,C-onc Ba EV-rel.(POL,GAG),C-onc FOS-rel,C-onc FSV-rel.C-onc     

内皮素-1诱导培养的人肺动脉平滑肌细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及其mRNA表达

为研究内皮素-1(ET-1)对培养的人肺动脉平滑肌细胞(HPASMC)Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的影响,应用贴块法培养人胎儿肺动脉平滑肌细胞,应用免疫细胞化学染色、原位杂交方法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及其mRNA的表达.结果显示,加入含10-8mol/L ET-1的培养液培养48h和72h后,HPASMC Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA及其蛋白表达明显增强.提示ET-1能够诱导培养的人肺动脉平滑肌细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原合成增加,其调控机制之一是在转录水平上增强了Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达.     

CCl_4诱导大鼠肝纤维化动物模型Ⅰ、Ⅲ及Ⅳ型胶原生成变化的研究

目的探讨肝纤维化过程中胶原生成细胞的来源以及Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型前胶原基因及其蛋白表达的演变规律。方法利用免疫组化及核酸分子杂交技术，对ＣＣｌ４诱导ＳＤ大鼠肝纤维化不同阶段（２０周内）α１（Ⅰ）、α１（Ⅲ）及α１（Ⅳ）前胶原ｍＲＮＡ的表达进行动态观察。结果（１）肝纤维化时α１（Ⅳ）前胶原ｍＲＮＡ早期即迅速升高，α１（Ⅲ）前胶原ｍＲＮＡ呈优势性表达，α１（Ｉ）前胶原ｍＲＮＡ含量的增加则较为缓慢；（２）肝纤维化早期，变性坏死区结蛋白阳性和α－平滑肌肌动蛋白阳性的Ｉｔｏ细胞及肌纤维母细胞表达α１（Ⅲ）、α１（Ⅳ）及α１（Ⅰ）前胶原ｍＲＮＡ。纤维化中、后期，三种前胶原ｍＲＮＡ表达主要见于间隔内纤维母细胞和肌纤维母细胞。结论二者构成肝纤维化时的主要胶原生成细胞。此外，窦内皮细胞也参与肝内Ⅳ型胶原的合成。     

抗纤复方及TGF-β对胶原基因启动子活性的影响①

目的研究TGF-β及中药抗纤复方对小鼠前胶原α2(Ⅰ)基因上游启动子活性的影响。方法以含小鼠胶原α2(Ⅰ)基因上游0.4、0.8、2.0 kb启动片段为研究靶序列，以氯霉素乙酰基转移酶（CAT)作报告基因，应用基因转染技术研究小鼠胶原启动子活性。结果TGF-β可促进小鼠前胶原α2(Ⅰ)基因启动序列的启动活性，而中药抗纤复方可明显抑制其启动活性。结论TGF-β和中药抗纤复方都可作用于胶原α2(Ⅰ)基因调控片段，进而促进或抑制胶原合成。     

人α2(Ⅰ)型胶原基因启动子活性研究

目的探索器官纤维化形成中调控Ⅰ型胶原基因高水平转录的启动片段及TGF-β、PDGF-BB、IGF-1等细胞因子对其活性的影响. 方法从人α2(Ⅰ)胶原基因转录起始点上游-2.4kb至+58bp的片段中,取长度不等的片段作为启动子与含氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因的质粒组成5个重组体,转染上述重组体至正常人原代培养皮肤成纤维细胞,测定细胞CAT表达水平以比较各重组体的启动子活性,同时加入细胞因子,以测定其对Ⅰ型胶原启动序列的影响. 结果除 -129～+58bp序列外,其余4个重组体CAT表达水平均较高,其中-2292～+58bp、-1476～+58bp序列具较强启动CAT表达活性,-339～+58bp、-616～+58bp片段次之.TGF-β、IGF-1均能在一定程度上调人α2(Ⅰ)胶原基因启动活性. 结论人α2(Ⅰ)胶原基因片段-2292～+58bp、-1476～ +58bp、-339～+58bp有高启动活性,是进一步研究纤维化相关DNA结合蛋白的重要调控靶序列.TGF-β、IGF-1促进胶原表达,与其上调胶原基因启动活性有关.     

心肌梗塞大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达的变化

本文使用人胶原α１（Ⅰ）、α２（Ⅱ）及α１（Ⅲ）链ｃＤＮＡ探针，采用斑点杂交法动态观察了心肌梗塞（ＭⅠ）大鼠心室各部位Ⅰ、Ⅲ型胶原ｍＲＮＡ比值［Ⅰ／Ⅲ（Ｒ）］的变化。发现心室各部位Ⅰ／Ⅲ（Ｒ）表现出不同的时相变化过程。Ⅰ／Ⅲ（Ｒ）的变化与Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的比值［Ⅰ／Ⅲ（Ｐ）］的变化一致。本研究提示ＭⅠ后心脏胶原网架的生化政变与基因表达水平的政变有关。     

实验性矽肺纤维化组织中Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因的表达

在制备人和小鼠的Ｐｒｏαｌ（Ⅰ）、Ｐｒｏαｌ（Ⅲ）前胶原ｃＤＮＡ探针的基础上，采用ｃＤＮＡ－ｍＲＮＡ斑点杂交及原位杂交技术，观察了二氧化硅诱导二个月和四个月的矽肺纤维化大鼠肺组织Ⅰ型、Ⅲ型胶原基因的ｍＲＮＡ水平和分布情况。实验结果表明，肺纤维化组织中Ｐｒｏαｌ（Ⅰ）、Ｐｒｏαｌ（Ⅲ）ｍＲＮＡ含量比正常肺组织明显增加（Ｐ＜０．０５），两型ｍＲＮＡ在正常肺组织主要分布于肺泡间隔的成纤维细胞中，而在病变组织主要分布于细胞性结节和增厚间质的成纤维细胞中。我们认为二氧化硅诱导的矽肺纤维出组织中胶原纤维的增生和积聚与胶原基因的表达密切相关。     

心房纤颤患者心房Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的变化

目的：探讨心房纤颤患者心房胶原的组织学分布和Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的变化。方法：应用Masson和SP免疫组化染色方法,结合数字图像分析方法,观测正常人和心房纤颤患者心房胶原的组织学和Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达。结果：(1)正常心房Ⅰ、Ⅲ型胶原广泛分布,均可分为粗、细不等的条状纤维。(2)心房纤颤患者心房Ⅰ和Ⅲ型胶原表达,仅部分区域发生极度重排;其心肌细胞间隙增大,胶原松散、断裂或大量聚集。(3)正常心房肌Ⅰ型胶原含量较Ⅲ型胶原多;心房纤颤组Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量明显增多。结论：心房纤颤心肌的间质松散,胶原增多。Ⅰ和Ⅲ型胶原纤维形态上的变化可能是心房纤颤时心功能异常所致。     

普伐他汀对人I型胶原α1(I)链启动子活性调控的研究

目的研究普伐他汀人I型胶原α1(I)链启动子活性的调控 ,从转录水平上了解普伐他汀对Ⅰ型胶原合成的影响。方法大鼠胸主动脉平滑肌细胞原代、传代培养。构建含人α1(I)前胶原基因5'侧翼序列 -2.5kb与报告基因氯霉素乙酰基转移酶 (CAT)的重组体 phCOL2.5,用FuGENE转染试剂瞬时转染平滑肌细胞 ,CAT -ELISA测定普伐他汀对重组体的作用。结果设对照组的CAT值为1 ,普伐他汀组的CAT值为0.62±0.04 ,普伐他汀能明显抑制I型胶原α1(I)启动子的活性。结论普伐他汀可以在转录水平上调节人α1(I)前胶原基因表达。     

Ⅰ型、Ⅲ胶原mRNA在Ⅱ型糖尿病大鼠窦房结的表达及变化

目的:探讨Ⅱ型糖尿病大鼠窦房结(SAN)内Ⅰ、Ⅲ型间质胶原重塑及胰岛素对其的影响。方法:高糖高脂饮食加小剂量链脲佐菌素(STZ)腹腔注射制备Ⅱ型糖尿病大鼠模型,并随机分为正常对照组、糖尿病组和胰岛素治疗组(每只3 U/d股内侧皮下注射),对照组和糖尿病组注射等剂量的生理盐水(股内侧皮下注射)每天1次,持续喂养4个月;以半定量RTPCR检测Ⅰ型、Ⅲ胶原mRNA在各组窦房结的表达及变化。结果:与对照组比较,糖尿病组Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维在窦房结内明显增加;治疗组较糖尿病组呈显著下降。图像分析结果显示Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达量为糖尿病组治疗组对照组。糖尿病组Ⅰ/Ⅲ型胶原基因mRNA表达比值明显较对照组上升。结论:Ⅱ型糖尿病可致窦房结胶原重塑,胰岛素治疗可使其发生逆转。     

氯喹对体外活化肝星状细胞自噬与胶原代谢的影响

目的:研究不同浓度的自噬抑制剂氯喹(CQ)对活化的大鼠肝星状细胞系HSC-T6中Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响及可能机制。方法:应用转化生长因子β1(TGF-β1)活化HSC-T6细胞,给予CQ干预24 h。实验分组为:control组、TGF-β1组、TGF-β1+CQ(15μmol/L)组、TGF-β1+CQ(30μmol/L)组和TGF-β1+CQ(60μmol/L)组。采用Western blot技术检测微管相关蛋白轻链3(LC3)比值LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、自噬靶蛋白P62、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、基质金属蛋白酶13(MMP-13)、金属蛋白酶组织抑制物1(TIMP-1)和TIMP-2的表达情况;免疫细胞化学检测Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达;RT-q PCR检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、MMP-13、TIMP-1和TIMP-2mRNA的表达变化。结果:CQ干预后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显升高且呈剂量依赖性;P62蛋白表达TGF-β1+CQ组均显著高于TGF-β1组(P0.01)。TGF-β1组的Ⅰ、Ⅲ型胶原表达量较control组显著增加,TGF-β1+CQ组较TGF-β1组也有明显增加。α-SMA的表达在TGF-β1组和TGF-β1+CQ组均显著高于control组(P0.05),而TGF-β1组和TGF-β1+CQ各组之间无显著差异。MMP-13表达在TGF-β1+CQ组较TGF-β1组显著下降(P0.05);TIMP-1和TIMP-2在TGF-β1+CQ组较TGF-β1组显著升高(P0.05),且呈剂量依赖性。结论:自噬抑制剂CQ能显著增加HSC-T6细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达并呈剂量依赖性,这可能与其上调TIMP-1及TIMP-2的表达并抑制MMP-13表达有关。     

普伐他汀对人Ⅰ期胶原α1（Ⅰ）链启动子活性调控的研究

目的：研究普伐他汀对人Ⅰ期胶原α1（Ⅰ）链启动子活性的调控,从转录水平上了解普伐他汀对Ⅰ期胶原合成的影响。方法：大鼠胸主动脉平滑肌细胞原代,传代培养,构建含人α1（Ⅰ）前原基因5'侧翼序列－2．5kb与报告基因氯霉素乙酰基转酶（CAT）的重组体phCOL2.5,用FuENE转染试剂瞬时转染平滑肌细胞,CAT－ELISA测定普伐他汀能明显抑制Ⅰ型胶原α1（Ⅰ）启动子和活性。结论：普伐他汀可以在转不水平上调节α1（Ⅰ）前胶原基因表达。     

IL-1受体拮抗剂对大鼠肝星状细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原及TIMP-1 mRNA表达的影响

目的:研究白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)对大鼠肝星状细胞(HSC)Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、Ⅲ型胶原(Col-Ⅲ)和基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)基因表达的影响,探讨IL-1ra抗肝纤维化作用的机制.方法:原位分离、培养大鼠HSC,荧光显微镜观察及免疫细胞化学染色法鉴定.用1 μg/L、10 μg/L、100 μg/L 3个浓度的IL-1ra分别作用于HSC 48 h,实时荧光定量RT-PCR法检测Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和TIMP-1 mRNA的表达.结果:对照组Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和TIMP-1mRNA的表达水平分别为1.97±0.29、2.70±0.57、3.83±0.30.加入1 μg/L、10 μg/L、100 μg/L IL-1ra后Col-Ⅰ基因表达水平依次为1.34±0.35、0.86±0.19、0.35±0.03;Col-Ⅲ基因表达水平依次为2.02±0.29、1.13±0.09、0.47±0.11;TIMP-1 mRNA的表达水平依次为3.12±0.25、2.53±0.38、1.98±0.18,与对照组比较,不同浓度处理组Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和TIMP-1 mRNA的表达均明显降低(P<0.05).结论:IL-1ra以剂量依赖方式抑制HSC中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ及TIMP-1 mRNA的表达,具有抗纤维化作用.     

核心蛋白聚糖对TGFβ1诱导的人肾小管上皮细胞产生胶原的影响

目的:探讨核心蛋白聚糖对转化生长因子β1(TGFβ1)诱导的人近端肾小管上皮细胞(HK-2)Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响。方法:将体外培养的HK-2细胞分为:(1)阴性对照组;(2)10μg/LTGFβ1组;(3)TGFβ1(10μg/L) (10μg/L)核心蛋白聚糖组;(4)TGFβ1(10μg/L) (100μg/L)核心蛋白聚糖组。倒置显微镜下观察加入刺激因子48h后肾小管上皮细胞的细胞形态学改变;应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)观察不同浓度的核心蛋白聚糖对HK-2细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原表达变化的影响。结果:加入刺激因子48h后,(1)组细胞形态与正常HK-2细胞形态基本一致,大部分仍为椭圆形;(2)组细胞形态发生明显的变化,大部分细胞由椭圆形拉长为长梭形;(3)和(4)组,梭形样细胞明显减少,尤其是(4)组梭形样细胞减少更为明显。(2)组HK-2细胞Ⅰ型胶原mRNA表达上升到(1)组的27.86倍,Ⅲ型胶原mRNA的表达上升到(1)组的21.83倍。(3)和(4)组与(2)组相比,Ⅰ型胶原mRNA的表达分别下降了36.39%、53.36%,Ⅲ型胶原mRNA的表达分别下降了26.35%、47.96%(P<0.05),但仍未下降到正常水平。结论:核心蛋白聚糖能抑制TGFβ1诱导的人近端肾小管上皮细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达,可能是核心蛋白聚糖抑制肾间质纤维化的原因之一。