肿瘤坏死因子-α对体外培养牛眼小梁细胞纤维连接蛋白的影响

目的 探讨肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)对体外培养牛眼小梁细胞纤维连接蛋白(fibronectin,FN)表达的影响及意义.方法 体外培养牛眼小梁细胞,免疫荧光法行神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)及Ⅷ因子相关抗原染色鉴定.取第3代小梁细胞分别加入浓度20μg·L-1、40μg·L-1、80μg·L-1 TNF-α孵育35 h,免疫荧光法行FN染色后用激光共聚焦显微镜观测并行定量分析.结果 20μg·L-1、40μg·L-1、80μg·L-1浓度组染色积分光密度值分别为19 486.45±1 318.15、31 312.61±1 822.52、39 958.98±2 186.85,高于对照组积分光密度值(13 062.62±1 923.36).各实验组FN荧光强度表达高于对照组,差异具有统计学意义,且随TNF-α浓度增高FN的表达亦逐渐增多.结论 在体外培养条件下TNF-α可引起牛眼小梁细胞FN合成增加,推测FN可能通过与整合素结合来促进胶原收缩,小梁网间空隙扩大,房水外流阻力减小,从而降低眼压.     

人重组肿瘤坏死因子-α体外诱导人小梁细胞凋亡

目的:研究人重组肿瘤坏死因子-α(rhTNF-α)对人小梁细胞(humantrabecularmeshworkcells,HTM)凋亡的影响,探讨其在原发性青光眼发病中的作用机制。方法:组织块法原代培养人小梁细胞,取第3~5代细胞用于实验。不同浓度的rhTNF-α与细胞共同孵育24h,采用Annexin-ⅴ联合PI双染流式细胞术,测定细胞凋亡率,结合荧光显微镜来观查凋亡细胞。结果:浓度低于0.01MU/L的肿瘤坏死因子-α作用24h对人小梁细胞凋亡无明显影响,浓度0.01MU/L及以上的肿瘤坏死因子-α作用24h可明显增加人小梁细胞凋亡率,凋亡率与肿瘤坏死因子-α浓度成正比。结论:肿瘤坏死因子-α可以诱导体外培养的人小梁细胞发生凋亡,可能参与了青光眼发病中小梁细胞的损害过程。     

肿瘤坏死因子-α对体外培养的牛眼小梁细胞MMP3,MMP9和TIMP-2表达的影响

目的:观察肿瘤坏死因子-α对体外培养的牛眼小梁细胞MMP3,MMP9和TIMP-2表达的影响,探讨原发性开角型青光眼的发病机制。方法:对牛眼小梁细胞进行原代及传代培养,应用免疫组化方法(NSE,Ⅷ因子相关抗原染色)鉴定细胞,化学及电子透射电镜对细胞进行形态学及生长特性的观察;对传3代的小梁细胞分别施加含TNF-α终浓度为0,12.5,25,50μg/L的培养液,48h后行MMP3和MMP9免疫组化SP染色,结果进行计算机图像分析并进行统计学检验。分组提取细胞培养液用ELASA检测TIMP-2量的变化。结果:体外培养的牛眼小梁细胞表达MMP3及MMP9,TNF-α可增加MMP3及MMP9的表达,并且抑制TIMP-2的表达。结论:TNF-α在一定范围内可以增加MMP3及MMP9的表达(P<0.05),并抑制TIMP-2的表达(P<0.01),故TNF-α可以减少小梁细胞细胞外基质的堆积,使房水引流通畅,对激光小梁成形术的手术原理有一定的说明意义。     

肿瘤坏死因子-α对人眼小梁细胞增殖及NO合成的影响

目的研究肿瘤坏死因子α(TNFα)对体外培养的人眼小梁细胞增殖及一氧化氮(NO)合成的影响。方法体外培养人眼小梁细胞,采用细胞计数法及MTT法比较不同浓度TNFα对细胞增殖能力的影响。采用硝酸还原酶法检测不同浓度TNFα对细胞合成NO的影响。结果TNFα浓度在10×103IU·L-1以上可以抑制人眼小梁细胞增殖,呈浓度依赖性,并可以增加人眼小梁细胞NO合成,在浓度100×103IU·L-1达到最大促进程度。结论TNFα可以抑制人眼小梁细胞增殖,增加NO合成,可能在青光眼发病过程中发挥重要作用。     

肿瘤坏死因子-а对人眼小梁细胞增殖及NO合成的影响

目的研究肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对体外培养人眼小梁细胞增殖及一氧化氮(NO)合成的影响.方法体外培养人眼小梁细胞,采用细胞计数法及MTT法比较不同浓度TNF-α对细胞增殖能力的影响.采用硝酸还原酶法检测不同浓度TNF-α对细胞合成NO的影响. 结果 TNF-α浓度在10×103 IU·L-1以上可以抑制人眼小梁细胞增殖,呈浓度依赖性,并可以增加人眼小梁细胞NO合成,在浓度100×103 IU·L- 1达到最大促进程度. 结论 TNF-α可以抑制人眼小梁细胞增殖,增加NO生成,可能在青光眼发病过程中发挥重要作用.     

压力对体外培养牛眼小梁细胞的影响

目的 观察压力对小梁细胞的影响。方法 对体外培养牛眼小梁细胞施以不同程度的压力,用倒置相差显微镜、光镜、电镜观察细胞形态结构及吞噬功能的变化。结果 细胞承受２．００ｋｐａ（１ｋｐａ＝７．５ｍｍＨｇ）、２．６７ｋｐａ压力４８小时,各项指标与对照组比较,差异无显著性。４．００ｋｐａ２４小时,细胞形态结构有轻度的损伤,吞噬功能有轻度下降。当压力进一步增加,时间更加延长后,细胞的损伤也更重。结论小梁细胞只     

上皮状牛眼小梁细胞选择性体外培养

目的建立上皮状牛眼小梁细胞体外培养的方法。方法用DME培养液加10％胎半血清选择性培养上皮状牛眼小梁细胞．结果（1）原代和传1、传2代牛眼小粱细胞生长不稳定，传3～7代牛眼小梁细胞生长旺盛；（2）原代细胞和传代细胞汇合前其形态可是多种多样，汇合后均为单层上皮状小梁细胞。结论（1）牛眼小梁组织丰富，解剖清楚，体外培养易生长；（2）选择性培养可得到单纯上皮状牛眼小梁细胞，更易与邻近组织细胞相区别。     

消化法牛眼小梁细胞的体外培养

目的 探讨用消化培养法体外培养牛眼小梁细胞，为进一步研究原发性开角型青光眼(POAG)提供实验材料。方法 0．25％胰蛋白酶、0．3％胶原酶等量混合行牛眼小梁细胞的原代培养和传代实验。结果 成功培养出性状良好的牛眼小梁细胞。结论 消化法培养牛眼小梁细胞可获得生长形态及特征稳定的小梁细胞，是值得提倡的培养方法。     

选择性牛眼上皮样小梁细胞的体外培养

目的选择性行牛眼上皮样小梁细胞的体外培养，为进一步研究原发性开角型青光眼提供实验材料。方法利用组织块法进行小梁细胞的原代培养，之后利用机械划除法、酶消化法、反复贴壁法，对牛眼上皮样小梁细胞进行选择性培养和传代。结果成功选择性培养出形态、性状良好的牛眼上皮样小梁细胞。结论选择性牛眼上皮样小梁细胞的体外培养所获细胞形态单一，可以用此种方法进行牛小梁细胞的体外培养并为实验应用做好准备。     

肿瘤坏死因子-α对体外培养的人眼小梁细胞基质金属蛋白酶-3和基层金属蛋白酶-9表达的影响

目的 探讨肿瘤坏死因子-α，（tumor necrosis factor-α．TNF—α）对体外培养的人眼小梁细胞基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP-3、MMP-9）表达的影响。方法 对人眼小梁细胞（humantrabecular cells，HTCs）进行体外原代培养及传代培养。取传3代的小梁细胞分别施加含TNF-α终浓度为0（对照组）、1mg／ml、10mg／ml、25ng／ml的无血清培养液．48h后采用免疫细胞化学法观察小梁细胞MMP-3、MMP-9的染色变化。对结果进行计算机图像分析并进行统计学检验．结果 利用免疫细胞化学法检测1ng／ml、10ng／ml、25ng／ml的TNF-α实验组小梁细胞MMP-3的平均灰度值分别为138．63±8．15、138．73±7．02、129.25±10．47．均低于对照组平均灰度值143．53±6．01．且各实验组与对照组比较差异均有显著性（P〈0．05）：实验组小梁细胞MMP-9的平均灰度值分别为137．60±11．53、125．20±17．29、119．88±12．47．均低于对照组平均灰度值145．30±7．05．且各实验组与对照组比较差异均有显著性（P〈0．05）。结论 TNF-α在-定范围内促进小梁细胞MMP-3及MMP-9的表达．增加了小梁网异常堆积的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的降解，使房水流出增加，眼压降低。     

尿激酶对组织培养人眼小梁细胞的影响

为检验尿激酶在临床应用时对小梁细胞有无不良影响。本研究应用组织培养人眼小梁细胞，观察不同浓度尿激酶对细胞形态的影响，并测定其对细胞DNA合成时氚（标胸腺嘧啶核着（3H-TdR）掺入的量，来判断药物对细胞增殖功能的影响。结果示5000u／ml浓度作用6小时细胞即出现胞突回缩、胞体皱缩等变化，至48小时细胞死亡；5000和500u／ml浓度均显著抑制DNA合成。提示在应用尿激酶冲洗前房积血时，一定要冲洗干净残留药物，以免对小梁细胞造成损害。     

米非司酮对培养的牛眼小梁细胞糖胺多糖代谢的影响

为了从发病学角度研究和发掘治疗青光眼的药物，在体外培养新生牛小梁细胞至第３代，掺入米非司酮（１１β－Ｉ４－（Ｎ，Ｎ－二甲胺基）苯基Ｊ－４，９－雌甾二烯－１７ａ－（１－丙炔）－１７β－羟基－３－酮，以下按国际贯例简称ＲＵ４８６）５０、１００、２００、４００ｕｇ／ｍｌ培养液和３Ｈ－葡萄糖胺，分离提纯后用乙酸纤维薄膜电泳、酶分解及液体闪烁等于手段测定生成的糖胺多糖（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ，     

葡萄糖对POAG患者小梁网细胞凋亡的影响

目的探讨不同浓度葡萄糖对POAG患者小梁网细胞凋亡的影响,研究葡萄糖与POAG以及糖尿病与POAG之间的关系,进一步探讨POAG的发病机制。方法实验研究。采用组织块培养法原代培养POAG患者小梁网细胞,取传代的小梁网细胞分别加入含葡萄糖终浓度为0.0（对照组）、5.5、45.0 mmol/L的无血清培养基,分别培养48 h后,采用CCK-8和流式细胞仪法检测不同浓度葡萄糖对小梁网细胞的影响。数据采用单因素方差进行分析。结果通过CCK-8检测发现,随着浓度的增加,葡萄糖对小梁网细胞的增殖抑制作用增强,可促进细胞凋亡,且各实验组与对照组之间相比差异有统计学意义（F=13.87,P＜0.01）;通过流式细胞仪法检测葡萄糖浓度为5.5、45.0 mmol/L实验组小梁网细胞凋亡率分别为10.65%±0.03%、25.74%±0.02%,均高于对照组（4.02%±0.03%）,且差异有统计学意义（F=25.34,P＜0.01）。结论高糖可以使小梁网细胞的增殖能力下降,凋亡率增加,从而可能导致小梁网细胞网状结构改变,房水流出途径的阻力增加。     

白细胞介素-1α对培养的人眼小梁细胞吞噬功能的影响

目的观察白细胞介素-1α（IL-1α）对体外培养的人眼小梁细胞（HTM）吞噬功能的影响。方法取人眼小梁组织进行小梁细胞体外培养,取传3～5代的人眼小梁细胞,加入不同浓度的IL-1α的DMEM-F12培养液,用倒置相差显微镜、光镜、电镜观察细胞吞噬功能的变化。结果小梁细胞吞噬乳胶微球数与IL-1α浓度（F=3．603,P=0．046）和作用时间（F=15．846,P=0．005）均有相关性（F=18．069,P=0．000）。结论IL-1α可以直接损害体外培养的人眼小梁细胞吞噬功能,其吞噬程度与IL-1α作用时间和浓度相关。     

曲尼司特对体外培养的人眼小梁细胞转化生长因子-β2表达的抑制作用

目的　观察曲尼司特对体外培养的人眼小梁细胞转化生长因子 β2 (TGF β2 )表达的影响。方法　体外培养的第 3～ 5代人眼小梁细胞经 0 0 (对照组 )、12 5、2 5 0及 5 0 0mg/L曲尼司特处理 4 8h后 ,采用半定量逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)观察曲尼司特对体外培养的人眼小梁细胞TGF β2 表达的影响 ,以人甘油醛 3 磷酸酯脱氢酶 (G3PDH)作为内参照。结果　 12 5、2 5 0及 5 0 0mg/L曲尼司特处理组TGF β2 /G3PDH象素值比值分别为 1 85± 0 35 ,1 6 6± 0 4 2 ,1 16± 0 2 4 ,与对照组比值 3 82± 0 5 6比较 ,差异有非常显著意义 (q′ =10 77,11 80 ,14 5 4 ;P <0 0 1) ;同时 ,TGF β2 /G3PDH比值随曲尼司特浓度增加而变小 ,呈现明显的量效关系。结论　曲尼司特能明显抑制小梁细胞TGF β2 的表达。可从发病学途径探讨曲尼司特对原发性开角型青光眼的治疗机制。     

血小板源性生长因子-BB对体外培养的牛眼小梁细胞中基质金属蛋白酶-2表达的影响

背景 目前在青光眼的治疗研究中,血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)作为直接作用于小梁网的药物手术刀正处于研究中,期望药物成分能直接作用于小梁网,在不破坏正常房角生理结构的前提下,疏通小梁网房水流出通道,从而达到降眼压的目的. 目的 探讨PDGF-BB对体外培养的牛眼小梁细胞中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达的影响及其意义.方法 取新鲜牛眼球的小梁组织,以组织块培养法培养小梁细胞,通过形态学观察和神经元特异性烯醇化酶(NSE)染色对培养的细胞进行鉴定.将第3代小梁细胞接种于6孔培养板,在培养基中加入不同质量浓度(0、5.0、12.5、25.0μg/L)的PDGF-BB培养2h,分别采用逆转录PCR(RT-PCR)法和免疫组织化学法观察PDGF-BB对牛眼小梁细胞MMP-2 mRNA(相对值)和蛋白在小梁细胞中的表达水平,分析各组培养细胞中阳性信号的吸光度(A)值. 结果 牛眼小梁组织块培养5～9 d时可见细胞游出,第3代小梁细胞可见较多突起,细胞核居中,NSE染色细胞基质中呈绿色荧光.RT-PCR检测结果发现,0、5.0、12.5、25.0μg/L PDGF-BB组小梁细胞中MMP-2 mRNA/β-actin的A值分别为0.127±0.026、0.147±0.045、0.178土0.053和0.222±0.062,差异有统计学意义(F=56.71,P＜0.05),其中5.0、12.5、25.0 μ g/LPDGF-BB组小梁细胞中MMP-2 mRNA表达量明显高于0μg/L PDGF-BB组,差异均有统计学意义(P＜0.05).免疫组织化学检测发现,0、5.0、12.5、25.0 μg/L PDGF-BB组小梁细胞中MMP-2蛋白表达量(A值)分别为446.12±13.81、1444.65±54.64、2086.18±73.18和3488.65±25.98,差异有统计学意义(F=213.12,P＜0.01),各组间两两比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 在体外培养的条件下,PDGF-BB可促进牛眼小梁细胞中MMP-2的表达,其作用呈剂量依赖的方式.     

地塞米松体外抑制人眼小梁细胞生长及表皮生长因子mRNA的表达

目的 探讨地塞米松对培养的人眼小梁细胞生长的影响及抑制小梁细胞表达表皮生长因子（epidermal growth factor EGF)mRNA的情况。方法 取人眼小梁组织进行小梁细胞体外培养,对传3代的小梁细胞进行地塞米松处理实验。实验组在传代后的培养液中按300ug/ml加入地塞米松,另一组作为对照组进行常规培养,观察生长5d后的细胞情况,取培养7d的两组的小梁细胞分别提取RNA,用EGFcDNA探针,a-^32P同位素标记进行斑点杂交,放射自显影。对显影片用计算机激光密度扫描,测定吸光度A值相对值进行组间比较。结果 加入地塞米松300ug/ml实验组,小梁细胞生长明显受到抑制,5d时对照组细胞已经融合,地塞米松组的细胞仍呈集落状态。从对照组小梁细胞提取RNA22.5ug,地塞米松组提取RNA 14ug,取14ug两组等量RNA,用EGFcNDA探针进行斑点杂交。结果阳性。激光密度扫描值地塞米松明显低于对照组。结论 地塞米松对培养的人眼小梁细胞有明显的生长抑制作用,通过抑制总RNA转录及EGFmRNA表达而抑制小梁细胞生长。提示糖皮质激素性青光眼是因抑制了小梁细胞的多种代谢和生理功能所致。     

纤维连接蛋白对原发性开角型青光眼小梁网细胞增殖、黏附和迁移的影响

目的通过研究纤维连接蛋白（FN）对体外培养的原发性开角型青光眼（POAG）患者小梁网细胞增殖、黏附、迁移的影响,探讨FN与POAG发病机制的关系。方法取临床确诊的POAG患者小梁网切除术中的深层巩膜组织块,进行小梁网细胞体外原代和传代培养．并对其进行免疫细胞化学和电镜鉴定。取第3代小梁网细胞,实验组分别加入浓度为5、10、20、40、100μg／ml的FN（含无血清DMEM／F12培养液）培养,对照组不加FN。培养24h后,采用CCK-8比色法和Transwell试剂盒检测各组光密度值,分析FN对POAG小梁网细胞增殖、黏附、迁移的影响。采用SPSS17．0统计软件,组间比较采用One-Way ANOVA分析,两两比较采用SNK检验。结果经过免疫细胞化学和电镜鉴定后,确定培养的细胞为POAG小梁网细胞。不同浓度FN对小梁网细胞均有影响。FN对POAG小梁网细胞有促增殖作用,在FN为5～10μg／ml浓度范围,小梁网细胞增殖相对缓慢,10μg／ml以后呈现上调趋势,在40μg／ml时达到增殖高峰,100μg／ml仍促进增殖,但是相对缓慢。各实验组光密度值分别与阴性对照组比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）;各实验组不同浓度组间比较,差异有统计学意义（F=81．778,P〈0．05）。FN浓度为5、10、20、40、100μg／ml时．小梁网细胞的增殖率分别为18．6％、54．7％、67．9％、98．7％和121．5％。同样,FN对POAG小梁网细胞有明显的促黏附、迁移作用。小梁网细胞的黏附、迁移能力随FN浓度的增加而增强,基本呈现曲线上升趋势,与阴性对照组比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论FN能促进POAG患者小梁网细胞增殖、黏附和迁移,其在POAG发病机制中的作用可能为通过影响POAG小梁网细胞的增殖、黏附、迁移功能参与房水流出的调节过程。